一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法

摘要

本发明公开了一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法，可以从酵母发酵液中直接分离重组人血白蛋白，属于生物化工领域中的蛋白分离技术。具体步骤如下：1)发酵液预处理，取含有人血白蛋白的酵母发酵液，加入辛酸钠，加热灭活蛋白酶；2)扩张床吸附，用装填有混合模式吸附剂的扩张床直接分离酵母发酵液，收集洗脱峰。3)脱盐和干燥，将收集液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的人血白蛋白。本发明的特色在于开发了一种新的分离工艺，可以从酵母发酵液中直接分离得到高纯度的重组人血白蛋白。方法的关键在于采用了基于混合模式的扩张床吸附剂，酵母发酵液无需去除细胞，无需调整离子强度，洗脱条件温和，具有工艺简单、分离效率高、收率高的特点。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质分离技术领域，涉及一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法。

背景技术

人血白蛋白是人体血浆中含量最丰富的蛋白质，约占血浆蛋白60％，主要生理功能是维持血浆渗透压，结合以及运输营养物质。临床用于治疗失血性休克、创伤性休克、急性血容量减少和低白蛋白血症等。还可作为细胞培养的添加成分、药物辅剂、赋形剂等，具有广泛的应用价值。

临床使用的人血白蛋白产品主要是从人源血浆中提取纯化，制备方法包括冷乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、利凡诺沉淀、辛酸盐沉淀等，过程繁杂，且不能排除病毒或其它潜在致病因子的影响。利用现代生物技术构筑表达重组人血白蛋白的酵母细胞，可避免病毒感染，解决血源供应紧张等问题，具有良好的应用前景。但是，药用人血白蛋白的纯度要求高，而酵母发酵液组分复杂，含有蛋白酶、杂蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖及热原物质等多种杂质，必须采用多步层析方法才能去除。

酵母发酵液，一般先要去除酵母细胞，然后取上清液进行后续分离纯化。专利CN1127299A和US5521287利用加热、稀释、调酸、阳离子交换层析、疏水作用层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、硼酸钙沉淀等步骤，得到纯度较高的人血白蛋白。专利CN1934128A公开了一种在二价阳离子存在下通过加热处理制备人血白蛋白的方法，可选择性凝集来源于宿主的杂质。专利CN1406246A中公开了包括加热处理步骤的人血白蛋白的制造方法，通过在宿主细胞蛋白等电点附近pH下进行加热处理，可有效去除宿主细胞蛋白。专利US5962649用阳离子交换扩张床吸附替代阳离子交换层析，可以处理含酵母细胞的发酵液，缩短了工艺。不过，蛋白捕获阶段采用阳离子交换方法，料液需要调酸至pH 4.0和稀释，酸性环境容易激活蛋白酶，导致人血白蛋白的降解，稀释使得目标物浓度下降，吸附容量降低，处理量增大，过程时间延长。针对酵母发酵液的特点，提高人血白蛋白的捕获效率，开发一种无需去除酵母吸附、近中性pH下吸附、高选择性、具有耐盐吸附特性的分离新方法，将有助于简化人血白蛋白的分离工艺，提高效率，节约成本。

扩张床吸附利用独特设计的扩张床和吸附剂，在向上液流的作用下床层适度膨胀，吸附剂颗粒形成稳定的分级分布，细胞或细胞碎片等固体小颗粒可以直接穿过床层，而目标物被吸附剂捕获。扩张床吸附突破了常规层析的局限性，可以直接处理含固体颗粒的复杂料液，实现从细胞培养液中直接捕获目标物，将固液分离、浓缩和初步纯化集成于一个单元，减少分离步骤，提高分离效率。混合模式层析是一种新型的生物分离技术，配基兼有多种功能基团，可以与目标蛋白产生多种相互作用，主要是疏水和静电相互作用。混合模式吸附剂的配基密度通常较高，吸附容量大，具有耐盐吸附特性，可以通过静电相吸来强化吸附，也可以通过静电排斥来协助解吸，洗脱条件温和，特别适合于大规模的分离纯化，已在抗体等蛋白的分离纯化中得到应用。本发明充分结合扩张床吸附和混合模式层析的特点，筛选合适的混合模式扩张床吸附剂，直接从酵母发酵液中捕获人血白蛋白，开发一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法，具体包括如下步骤：

1)取含有人血白蛋白的酵母发酵液，调节pH至6.0，加入辛酸钠至5～20mM，68℃加热30min灭活蛋白酶，得到人血白蛋白粗品溶液；

2)混合模式吸附剂装填到扩张床中，平衡缓冲液预平衡，达到1.8～2.5倍膨胀率，保持20分钟；

3)调节人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0～6.0，上样到扩张床中，平衡缓冲液冲洗，冲洗缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到人血白蛋白溶液；

4)将人血白蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的人血白蛋白；

所述的含有人血白蛋白的酵母发酵液为毕赤酵母、汉逊酵母或酿酒酵母表达重组人血白蛋白的发酵液；所述的混合模式吸附剂的基质为添加有增重剂的多孔微球，增重剂包括石英砂、钛白粉、碳化钨粉末，多孔微球包括琼脂糖微球、纤维素微球、聚丙烯酰胺微球；所述的混合模式吸附剂的功能配基为色氨酸及其衍生物，包括L-色氨酸、L-色氨酸甲酯、L-色氨酸乙酯、5-羟基-L-色氨酸、N-乙酰-L-色氨酸、色胺和4-(1H-吲哚-2-基)苯胺等；所述的平衡缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为5.0～6.0；所述的冲洗缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH值为7.0～8.0；所述的洗脱缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH值为3.5～4.5；所述的步骤3)中的冲洗缓冲液的冲洗体积为5-20倍柱体积；所述的步骤1)中酵母发酵液pH值和步骤3)人血白蛋白粗品溶液的pH调节所用酸溶液为乙酸或柠檬酸，所用碱溶液为氢氧化钠溶液。

本发明针对酵母发酵液组分复杂、pH中性、电导较高的特点，结合扩张床吸附和混合模式层析的优势，采用混合模式扩张床吸附剂直接处理含酵母细胞的发酵液，充分利用扩张床吸附直接处理含细胞料液的特点，以及混合模式吸附容量大、选择性好、具有耐盐特性、洗脱条件温和等优势，简化分离步骤，提高分离效率，得到一个从酵母发酵液中扩张床吸附直接分离人血白蛋白的新方法。本发明的优点在于：1)采用独特的扩张床吸附模式，发酵液无需去除酵母细胞，直接用于人血白蛋白分离，简化预处理步骤，提高分离效率；2)采用特殊的混合模式吸附剂，对人血白蛋白的吸附选择性高，单步层析纯度高达95％以上，宿主细胞蛋白和色素去除率达90％左右；3)在pH 5.0～6.0条件下实现吸附，减小酸性环境下蛋白酶对人血白蛋白的降解；4)具有耐盐吸附的特性，料液无需调节离子强度，直接上样；5)利用静电排斥作用实现有效洗脱，洗脱条件温和，人血白蛋白的回收率达到85％以上；6)吸附容量大，过程处理量大，工艺简单，易于放大。

附图说明

附图1是本发明混合模式扩张床吸附分离人血白蛋白的高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明提供一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法。取含有人血白蛋白的酵母发酵液，加入辛酸钠，加热，灭活蛋白酶，直接通过混合模式扩张床进行分离，得到人血白蛋白。本发明方法得到的人血白蛋白纯度大于95％。

从酵母发酵液中直接分离人血白蛋白的方法包括如下步骤：

1)取含有人血白蛋白的酵母发酵液，调节pH至6.0，加入辛酸钠至5～20mM，68℃加热30min灭活蛋白酶，得到人血白蛋白粗品溶液；

2)混合模式吸附剂装填到扩张床中，平衡缓冲液预平衡，达到1.8～2.5倍膨胀率，保持20分钟；

3)调节人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0～6.0，上样到扩张床中，平衡缓冲液冲洗，冲洗缓冲液冲洗，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰对应的洗脱缓冲液，得到人血白蛋白溶液；

4)将人血白蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到纯度大于95％的人血白蛋白；

所述的含有人血白蛋白的酵母发酵液为毕赤酵母、汉逊酵母或酿酒酵母表达重组人血白蛋白的发酵液；所述的混合模式吸附剂的基质为添加有增重剂的多孔微球，增重剂包括石英砂、钛白粉、碳化钨粉末，多孔微球包括琼脂糖微球、纤维素微球、聚丙烯酰胺微球；所述的混合模式吸附剂的功能配基为色氨酸及其衍生物，包括L-色氨酸、L-色氨酸甲酯、L-色氨酸乙酯、5-羟基-L-色氨酸、N-乙酰-L-色氨酸、色胺和4-(1H-吲哚-2-基)苯胺等；所述的平衡缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液，pH值为5.0～6.0；所述的冲洗缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH值为7.0～8.0；所述的洗脱缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH值为3.5～4.5；所述的步骤3)中的冲洗缓冲液的冲洗体积为5-20倍柱体积；所述的步骤1)中酵母发酵液pH值和步骤3)人血白蛋白粗品溶液的pH调节所用酸溶液为乙酸或柠檬酸，所用碱溶液为氢氧化钠溶液。

以下通过实施例对本发明作进一步的描述，实施例中除特殊说明外所有pH调节溶液均为乙酸或氢氧化钠：

实施例1

取含有重组人血白蛋白的毕赤酵母发酵液，调节pH至6.0，加入辛酸钠至5mM，68℃加热30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附剂(添加石英砂为增重剂的琼脂糖微球、L-色氨酸为配基)装填到内径为1cm的扩张床中，柱高约20cm，pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液预平衡，达到2.0倍膨胀率，保持20分钟；调节人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上样10ml。经平衡缓冲液冲洗5倍柱体积，20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 7.5)冲洗10倍柱体积，20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0)洗脱10倍柱体积，收集洗脱Ⅱ组分，脱盐，冷冻干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析纯度为96.3％，收率为89.6％，宿主蛋白和色素去除率分别为90.2％和89.0％。其中附图1是本发明混合模式扩张床吸附分离人血白蛋白的高效液相色谱图。

实施例2

取含有重组人血白蛋白的毕赤酵母发酵液，调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附剂(添加钛白粉为增重剂的琼脂糖微球、L-色氨酸甲酯为配基)装填到内径为1cm的扩张床中，柱高约20cm，pH 5.5乙酸-乙酸钠缓冲液预平衡，达到1.8倍膨胀率，保持20分钟；调节人血白蛋白粗品溶液的pH至5.5，上样10ml。经平衡缓冲液冲洗5倍柱体积，20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 7.0)冲洗5倍柱体积，20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 3.5)洗脱10倍柱体积，收集洗脱Ⅱ组分，脱盐，冷冻干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析纯度为95.0％，收率为86.7％，宿主蛋白和色素去除率分别为90.5％和89.1％。

实施例3

取含有重组人血白蛋白的汉逊酵母发酵液，调节pH至6.0，加入辛酸钠至15mM，68℃加热30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附剂(添加碳化钨为增重剂的琼脂糖微球、L-色氨酸乙酯为配基)装填到内径为1cm的扩张床中，柱高约20cm，pH 6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液预平衡，达到2.2倍膨胀率，保持20分钟；调节人血白蛋白粗品溶液的pH至6.0，上样10ml。经平衡缓冲液冲洗5倍柱体积，20mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH8.0)冲洗15倍柱体积，20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)洗脱10倍柱体积，收集洗脱Ⅱ组分，脱盐，冷冻干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析纯度为96.1％，收率为89.2％，宿主蛋白和色素去除率分别为89.7％和90.1％。

实施例4

取含有重组人血白蛋白的汉逊酵母发酵液，调节pH至6.0，加入辛酸钠至15mM，68℃加热30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附剂(添加石英砂为增重剂的聚丙烯酰胺微球、5-羟基-L-色氨酸为配基)装填到内径为1cm的扩张床中，柱高约20cm，pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液预平衡，达到2.2倍膨胀率，保持20分钟；调节人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上样10ml。经平衡缓冲液冲洗5倍柱体积，20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.0)冲洗20倍柱体积，20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.0)洗脱10倍柱体积，收集洗脱Ⅱ组分，脱盐，冷冻干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析纯度为97.7％，收率为90.5％，宿主蛋白和色素去除率分别为91.3％和92.2％。

实施例5

取含有重组人血白蛋白的酿酒酵母发酵液，调节pH至6.0，加入辛酸钠至10mM，68℃加热30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附剂(添加碳化钨为增重剂的聚丙烯酰胺微球、N-乙酰-L-色氨酸为配基)装填到内径为1cm的扩张床中，柱高约20cm，pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液预平衡，达到2.0倍膨胀率，保持20分钟；调节人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上样10ml。经平衡缓冲液冲洗5倍柱体积，20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.5)冲洗10倍柱体积，20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.0)洗脱10倍柱体积，收集洗脱Ⅱ组分，脱盐，冷冻干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析纯度为96.5％，收率为91.5％，宿主蛋白和色素去除率分别为89.3％和93.1％。

实施例6

取含有重组人血白蛋白的酿酒酵母发酵液，调节pH至6.0，加入辛酸钠至20mM，68℃加热30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附剂(添加石英砂为增重剂的纤维素微球、色胺为配基)装填到内径为1cm的扩张床中，柱高约20cm，pH 5.5乙酸-乙酸钠缓冲液预平衡，达到2.5倍膨胀率，保持20分钟；调节人血白蛋白粗品溶液的pH至5.5，上样10ml。经平衡缓冲液冲洗5倍柱体积，20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.0)冲洗10倍柱体积，20mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.0)洗脱10倍柱体积，收集洗脱Ⅱ组分，脱盐，冷冻干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析纯度为95.4％，收率为85.6％，宿主蛋白和色素去除率分别为90.3％和89.2％。实施例7

取含有重组人血白蛋白的毕赤酵母发酵液，用柠檬酸或氢氧化钠调节pH至6.0，加入辛酸钠至15mM，68℃加热30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附剂(添加石英砂为增重剂的聚丙烯酰胺微球、4-(1H-吲哚-2-基)苯胺为配基)装填到内径为1cm的扩张床中，柱高约20cm，pH 5.0乙酸-乙酸钠缓冲液预平衡，达到2.2倍膨胀率，保持20分钟；调节人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上样10ml。经平衡缓冲液冲洗5倍柱体积，20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH 7.0)冲洗10倍柱体积，20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.0)洗脱15倍柱体积，收集洗脱Ⅱ组分，脱盐，冷冻干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析纯度为96.7％，收率为85.5％，宿主蛋白和色素去除率分别为90.6％和90.2％。