区分经典型和韩国型鸭肝炎病毒的实时荧光定量PCR引物

摘要

本发明提供了一组区分经典型和韩国型鸭肝炎病毒的实时荧光定量PCR引物，利用经典型和韩国型鸭肝炎病毒特征性核苷酸序列存在GC含量差异来设计。利用本组引物对经典型和韩国型鸭肝炎病毒进行实时荧光定量PCR反应均可有效扩增，但可在经典型和韩国型鸭肝炎病毒的实时荧光定量PCR反应后生成的熔解曲线存在熔解温度（Tm值）差异来对经典型和韩国型鸭肝炎病毒进行有效区分。配合实时荧光定量PCR仪连接的电脑并利用仪器自带的分析软件，可达到仅需一组引物，即可特异性地对经典型和韩国型鸭肝炎病毒感染情况进行鉴别诊断。本发明鉴定方法简单，效率和准确率较高。

说明书

技术领域

本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一组区分经典型和韩国型鸭肝炎病毒实时的荧光定量PCR引物。

背景技术

鸭肝炎是由鸭肝炎病毒引起的、侵害雏鸭的一种高度致死性传染病，临床以急性肝炎为特征，主要侵害3周龄以内的雏鸭，尤其以1周龄内的雏鸭为甚，病死率可达100%。目前，随着我国鸭饲养密度的加大、患病鸭和病死鸭处置的不规范、各种贸易活动的日益频繁以及免疫抑制病的出现等诸多原因，鸭肝炎的危害日趋严重，已成为养鸭业最为严重的疫病之一。

在我国，鸭群中流行的鸭肝炎病毒主要以经典型鸭肝炎病毒为主，但关于韩国型鸭肝炎病毒感染的报道也日益增多。然而无论是经典型鸭肝炎病毒，还是韩国型鸭肝炎病毒，均主要侵害3周龄内的雏鸭，病死鸭多呈角弓反张，剖检可见肝脏肿大、出血，无法从临床剖检对二者进行有效鉴别诊断。

本发明的一组区分经典型和韩国型鸭肝炎病毒的实时荧光定量PCR引物，仅需1组引物对（2条引物）即可对经典型和韩国型鸭肝炎病毒进行有效区分。该引物根据经典型和韩国型鸭肝炎病毒存在特征性核苷酸序列差异来设计，利用实时荧光定量PCR反应后生成的熔解曲线的Tm值和其GC含量正相关的特点，通过观察经典型和韩国型鸭肝炎病毒经该组引物进行实时荧光定量PCR扩增反应后的熔解曲线Tm值差异，即可精确对经典型和韩国型鸭肝炎病毒感染情况进行准确鉴别诊断，相关研究尚未见国内外文献报道，本发明可填补相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一组区分经典型和韩国型鸭肝炎病毒的实时荧光定量PCR引物及其应用，该引物能有效区分经典型和韩国型鸭肝炎病毒感染（或共感染），为科学防控鸭肝炎病毒感染提供技术保障。

本发明根据经典型和韩国型鸭肝炎病毒存在特征性的核苷酸序列差异来设计一组实时荧光定量PCR引物。该引物针对经典型和韩国型鸭肝炎病毒进行PCR扩增均可得到特异性目的条带，利用该扩增区域经典型和韩国型鸭肝炎病毒存在核苷酸GC含量差异，通过建立基于Eva Green的实时荧光定量PCR方法对经典型和韩国型鸭肝炎病毒实时荧光定量PCR扩增反应，获得的熔解曲线存在不同的熔解温度（Tm值）差异，根据熔解曲线Tm值差异可直接对经典型和韩国型鸭肝炎病毒感染情况进行鉴别诊断。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组区分经典型和韩国型鸭肝炎病毒的实时荧光定量PCR引物，其核苷酸序列为：

上游引物F1: 5′- AAACGGATTACCGGTAGTAGCATC-3′，

下游引物R1: 5′- GACCAGCCGCGACCCTAT-3′。

通过所述引物建立基于Eva Green的实时荧光定量PCR方法，根据该引物扩增的经典型和韩国型鸭肝炎病毒所存在的核苷酸特征性差异——GC含量的差异，可导致实时荧光定量PCR反应扩增反应后生成的熔解曲线存在不同的熔解温度（Tm值），可直接对经典型和韩国型鸭肝炎病毒感染进行鉴别。

具体包括以下步骤：

1、设计并合成上述特异性引物对F1/R1；

2、病毒RNA提取：从检测样品中分别提取经典型和韩国型鸭肝炎病毒的RNA；

3、RT-PCR扩增：利用鸭肝炎特异性引物对DHVF/DHVR对提取的核酸RNA反转录后进行PCR扩增，将PCR扩增的目的片段进行胶回收并纯化后，克隆到T载体上，获得含有经典型和韩国型鸭肝炎病毒的阳性重组质粒，测定其OD值计算出拷贝数后，连续倍比稀释，作为实时荧光定量PCR反应的标准品。

所用鸭肝炎特异性引物对DHVF/DHVR的核苷酸序列为：

DHVF: 5’- GTTGTGAAACGGATTACCGGTAGTA -3’；

DHVR: 5’- ACTCGACCAGCCGCGACC -3’。

4、实时荧光定量PCR：用所述实时荧光定量引物F1和R1对含有经典型和韩国型鸭肝炎病毒的阳性重组质粒进行Eva Green实时荧光定量PCR扩增，反应完成后获得相应的扩增曲线，并生成Eva Green实时荧光定量PCR扩增的熔解曲线。

5、病毒感染情况判断：实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察扩增曲线判断是否存在经典型和韩国型鸭肝炎病毒感染；通过观察熔解曲线其Tm值差异可对经典型和韩国型鸭肝炎病毒进行鉴别。

其中，设计的实时荧光定量PCR引物需满足如下要求：

（1）特异性强：该实时荧光定量PCR产物需选择经典型和韩国型鸭肝炎病毒核苷酸序列进行分析后保守的区域设计，以便仅需一组引物能对经典型和韩国型鸭肝炎病毒进行扩增，即观察实时荧光定量PCR反应后的扩增曲线便可对经典型和韩国型鸭肝炎病毒感染进行判断。

（2）两种病毒的扩增区域GC含量不同：该组引物对经典型和韩国型鸭肝炎病毒的扩增区域的核苷酸序列存在GC含量差异。基于实时荧光定量PCR反应生成的熔解曲线的Tm峰值差异（该差异和核苷酸序列的GC含量差异正相关），即可通过观察实时荧光定量PCR反应后的熔解曲线对经典型和韩国型鸭肝炎病毒感染进行判断（可有效区分是经典型鸭肝炎病毒还是韩国型鸭肝炎病毒）。

其中，所述的步骤（5）的病毒感染情况判断方法如下：

若在Tm=（87.2±0.20）℃出现单一的特异性Tm峰判为经典型鸭肝炎病毒阳性；

若在Tm=（84.8±0.24）℃出现单一的特异性Tm峰判为韩国型鸭肝炎病毒阳性；

若在Tm=（87.2±0.20）℃以及Tm=（84.8±0.24）℃出现双峰，则判断为经典型和韩国型鸭肝炎病毒双重感染；

其他情况均判为阴性。

本发明所设计的实时荧光定量PCR引物对F1/R1可用于制备区分经典型和韩国型鸭肝炎病毒感染的试剂盒。

本发明的有益效果：鉴定方法简单，效率和准确率较高。使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物对前期分离的5株经典型鸭肝炎病毒和3株韩国型鸭肝炎病毒进行实时荧光定量PCR检测，均和预期相符。且仅需1组引物对（2条引物）即可有效对经典型和韩国型鸭肝炎病毒进行有效区分。

附图说明

图1 鸭肝炎病毒定量PCR引物设计区；

图2 鸭肝炎病毒基因扩增区域的核苷酸差异；

图3 特异性引物对F1/R1对经典型鸭肝炎病毒进行实时荧光定量PCR反应的熔解曲线；

图4 特异性引物对F1/R1对韩国型鸭肝炎病毒进行实时荧光定量PCR反应的熔解曲线；

图5 特异性引物对F1/R1对经典型和韩国型鸭肝炎病毒进行实时荧光定量PCR反应的熔解曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、毒株：

经典型鸭肝炎病毒（JX1132株）和韩国型鸭肝炎病毒（FJ1521株）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

2、引物设计与合成

根据经典型和韩国型鸭肝炎病毒的核苷酸特征性差异区设计实时荧光定量PCR反应的引物F1和R1，引物序列为：

上游引物F1：5′- AAACGGATTACCGGTAGTAGCATC-3′，

下游引物R1: 5′- GACCAGCCGCGACCCTAT-3′。

3、病毒RNA提取以及RT-PCR扩增：

以常规方法提取经典型鸭肝炎病毒（JX1132株）和韩国型鸭肝炎病毒（FJ1521株）的病毒RNA。利用鸭肝炎特异性引物对DHVF/DHVR对提取的核酸RNA进行PCR扩增，将PCR扩增的目的片段进行胶回收并纯化后，克隆到T载体上，获得含有经典型和韩国型鸭肝炎病毒的阳性重组质粒，测定其OD值计算出拷贝数后，连续倍比稀释，作为实时荧光定量PCR反应的标准品。所用鸭肝炎特异性引物对DHVF/DHVR的核苷酸序列为：

DHVF: 5’- GTTGTGAAACGGATTACCGGTAGTA -3’；

DHVR: 5’- ACTCGACCAGCCGCGACC -3’。

4、实时荧光定量PCR反应：

优化出的20 μL 最佳反应体系为体系：Eva Green 10 μL，浓度为10 μmol/L的F1、R1各0.2 μL、模板2 μL、水补足至20 μL。最佳反应条件为：95℃，2 min预变性；95℃ 10 s，59℃15 s，共40个循环，循环结束后，根据条件做出对应的熔解曲线。

5、病毒感染情况判断：

实时荧光定量PCR反应结束后，观察扩增曲线，判断建立的方法有无特异性扩增。实时荧光定量PCR反应结束后做出的熔解曲线，直接在荧光定量PCR仪器连接的电脑上利用实时荧光定量PCR对应的软件进行分析（可直接肉眼观察），对经典型和韩国型鸭肝炎病毒感染情况进行判断，判断方法为：

若在Tm=（87.2±0.20）℃出现单一的特异性Tm峰判为经典型鸭肝炎病毒阳性；

若在Tm=（84.8±0.24）℃出现单一的特异性Tm峰判为韩国型鸭肝炎病毒阳性；

若在Tm=（87.2±0.20）℃以及Tm=（84.8±0.24）℃出现双峰，则判断为经典型和韩国型鸭肝炎病毒双重感染；

其他情况均判为阴性。

使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物对前期分离的5株经典型鸭肝炎病毒和3株韩国型鸭肝炎病毒进行实时荧光定量PCR检测，均和预期相符。且仅需1组引物对（2条引物）即可有效对经典型和韩国型鸭肝炎病毒进行有效区分。

实施例2

对临床送检的75份疑似样品进行检测；经典型鸭肝炎病毒感染阳性有6份，阳性率为8%（6/75）；韩国型鸭肝炎病毒感染阳性有2份，阳性率为2.67%（2/75）； 经典型鸭肝炎病毒和韩国型鸭肝炎病毒共感染的样品1份。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 区分经典型和韩国型鸭肝炎病毒的实时荧光定量PCR引物

<130> 4

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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actcgaccag ccgcgacc 18