一种检测肝微粒体中UGT酶活性的cocktail方法

摘要

本发明公开了一种检测五种UGT酶活性的cocktail方法，选择五种UGT酶的专一性较强的底物，设置合适的浓度，进行底物相互作用考察，将相互作用较小的UGT1A1/Ugt1a1和UGT1A6/Ugt1a6酶的底物混合孵育，将UGT1A3/Ugt1a3，UGT1A9/Ugt1a9和UGT2B7/AZTG的底物混合孵育，最后测定UGT酶的活性。本发明检测五种UGT酶活性的cocktail方法可用于检测大鼠和人肝微粒体中的UGT酶的活性，具有高效、快速和全面的优点，可用于快速评价化合物对UGT酶活性的影响。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种检测人或者大鼠肝微粒体中五种UGT酶活性的cocktail方法。

背景技术

尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(UGT)是主要的二相代谢酶(包括尿苷二磷酸葡醛酸转移酶、N－乙酰基转移酶、甲基转移酶、谷胱甘肽转移酶、转硫酶等)，主要位于肝脏中滑面内质网上，其主要功能是将葡萄糖醛酸基结合到底物上，使其极性增大，易于排出体外，从而达到代谢解毒的作用。UGT酶不仅在药物代谢中扮演着重要的角色，可代谢35％的药物(经过二相代谢)，还在代谢内源性物质，如胆汁酸、胆红素、类固醇激素等方面发挥着至关重要的作用。当UGT酶活性发生改变，如被抑制时，其代谢转化外源性物质和内源性物质的能力下降，容易引起药物间的相互作用，甚至产生严重的中毒反应或代谢性紊乱。

所有的UGT酶都含有由29个氨基酸组成的保守的特征序列，有报道称其与UDP糖的结合相关，UGT酶催化反应的实质是将核苷酸糖上的糖基转移到亲脂性的底物上。人类UGT酶可以分为UGT1，UGT2，UGT3和UGT8共4个基因家族，分别位于人类染色体2q37，4q13，5p13.2，4q26上，其中UGT1和UGT2是最重要的药物代谢酶家族，主要功能是将尿苷二磷酸葡萄糖醛酸作为糖基供体结合到底物上。UGT1家族主要有UGT1A1，UGT1A3，UGT1A4，UGT1A5，UGT1A6，UGT1A7，UGT1A8，UGT1A9和UGT1A10；UGT2家族可以分为UGT2A和UGT2B，其中UGT2A包括UGT2A1，UGT2A2和UGT2A3；UGT2B包括UGT2B4，UGT2B7，UGT2B10，UGT2B11，UGT2B15，UGT2B17，UGT2B28；UGT3家族主要在胸腺、睾丸和肾脏中表达，在肝脏中几乎检测不到表达。UGT8A1是UDP半乳糖神经酰胺半乳糖转移酶，即主要利用尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖为供体糖原。UGT1和UGT2家族中UGT1A1，UGT1A3，UGT1A6，UGT1A9和UGT2B7为参与药物代谢的最重要的几种亚型，而UGT3和UGT8均很少参与药物或者其他外源性物质的代谢和解毒。另外UGT1A2p,UGT1A11p,UGT1A1p2和UGT1A13p为假基因，不表达功能性蛋白。

大鼠作为人类同源性较高的动物模型，经常被用在临床前的实验研究中。目前为止，在大鼠中采用cocktail方法检测UGT酶的活性还未见报道。在大鼠中，功能性的UGT可以分为Ugt1a，Ugt2a，Ugt2b几个亚家族，具体包括Ugt1a1，Ugt1a2，Ugt1a3，Ugt1a5，Ugt1a6，Ugt1a7，Ugt1a8，Ugt1a10，Ugt2a1，Ugt2a2，Ugt2a3，Ugt2b1，Ugt2b2，Ugt2b3，Ugt2b6，Ugt2b8，Ugt2b12，Ugt2b34和Ugt2b47，其中Ugt1a4，Ugt1a9为假基因。另外，在大鼠肝微粒体中，Ugt1a9虽然被报道为假基因，但是其仍可以催化底物丙泊酚葡萄糖醛酸化，只是其催化活性要远低于人肝微粒体中UGT1A9。由于在大鼠肝微粒体中，丙泊酚葡萄糖醛酸化的动力学分析显示为双相模型，所以可能有超过一个亚型酶参与其代谢，即除了Ugt1a9以外，还有其他亚型酶参与了代谢。在大鼠肝微粒体中，尽管没有发现与人UGT2B7相对应的亚型，但是以齐多夫定作为底物，发现其可以被葡萄糖醛酸化，但是活性远低于人的UGT2B7酶的活性，一般用3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷葡萄糖醛酸化(3'-azido-3'-deoxythymidineglucuronidation，AZTG)表示其反应。人类和大鼠的UGT酶分类和功能存在差别，因此在使用大鼠进行实验时需要注意区别。

“Cocktail”方法是近年来兴起的一种高通量快速检测化合物的方法，其概念可追溯到1990年由Breimer等人提出。“Cocktail”探针药物法，是指同时将多种相对低剂量的探针药物(底物)进行共同孵育，测定样本中每个探针药物的代谢率，被广泛应用于药物对细胞色素P450酶活性影响评估、药物代谢途径确认、药物-药物相互作用预测等诸多研究方向。传统的单一探针药物研究方法，单次实验只能反映一种酶的活性，很难满足现代研究快速、准确、方便和经济的要求。“Cocktail”探针药物法具有同时测定多种同工酶活性的优势，使得多个酶的活性变化可通过单次实验获得，并将有效减小试验数据的波动，此方法可以快速、高效、全面的评价药物对多种酶活性影响以及药物的体内代谢情况。关于一相代谢酶CYP的cocktail方法已经有许多研究，是目前比较常用的快速研究CYP酶活性的方法。二相代谢酶UGT亚型比较繁多，每个亚型单独研究效率低下，因此本发明提出采用cocktail方法同时检测UGT多种主要的亚型(UGT1A1，UGT1A3，UGT1A6，UGT1A9，UGT2B7)的酶活，综合考虑化合物对多种UGT酶活性的影响。同时辅助以LC-MS/MS方法高效、快速、灵敏的优点，同时检测多个底物及其代谢物，有助于快速、大量筛选对UGT酶活性有抑制作用的化合物。

Cocktail方法中底物之间的相互作用是影响实验准确性的重要影响因素，因此选择合适的底物，如何组合底物及确定合适的底物浓度至关重要。由于UGT酶许多亚型之间的氨基酸同源性很高，催化的底物具有广泛的交叉性，因而本发明在选择专一性高的底物基础上，充分考察了底物之间相互作用，发现了合适的底物组合及其浓度，首次建立了在大鼠中检测五种UGT酶活的cocktail方法。此外，文献报道的人肝微粒体中UGT酶活检测的cocktail方法存在明显缺陷，不同亚型酶之间相互作用影响明显例如UGT1A3，并且阳性抑制剂在cocktail方法中抑制程度和单独孵育时存在较大差距，因此本发明对人肝微粒体中cocktail方法进行了完善和优化，显著降低了底物相互影响的程度。本发明建立了大鼠和人肝微粒体中五种UGT酶底物的cocktail方法，可用于快速筛选对UGT酶活性有影响的化合物，可以帮助研究大鼠和人中各种UGT酶的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、高效、方便和经济的测定UGT酶活性的cocktail方法，可用于检测大鼠和人肝微粒体中五种UGT亚型酶(UGT1A1/Ugt1a1，UGT1A3/Ugt1a3，UGT1A6/Ugt1a6，UGT1A9/Ugt1a9和UGT2B7/AZTG)的活性。

本发明提供了一种测定UGT酶活性的cocktail方法，包括：在含有Tris-HCl和氯化镁的孵育体系中，加入UGT酶、UDPGA和UGT酶的底物，在35-40℃下反应60-90分钟，液相色谱法测定UGT酶的活性。

其中，所述UGT酶为人肝微粒体中UGT酶或大鼠肝微粒体中UGT酶；所述UGT酶包括UGT1A1/Ugt1a1、UGT1A3/Ugt1a3、UGT1A6/Ugt1a6、UGT1A9/Ugt1a9、UGT2B7/AZTG。即，当所述UGT酶为人UGT酶时，所述UGT酶包括UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7中的一种或多种；当所述UGT酶为大鼠UGT酶时，所述UGT酶包括Ugt1a1、Ugt1a3、Ugt1a6、Ugt1a9、AZTG中的一种或多种。

其中，所述UGT酶的底物包括雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定中的一种或多种。即，UGT1A1/Ugt1a1的底物为雌二醇，UGT1A3/Ugt1a3的底物为鹅去氧胆酸，UGT1A6/Ugt1a6的底物为血清素，UGT1A9/Ugt1a9的底物为丙泊酚，UGT2B7/AZTG的底物为齐多夫定。

其中，所采用的底物与所要测定的UGT酶一一对应，即当所要测定的UGT酶中不包含某一亚型时，所采用的底物中相应地不包含该所述亚型的UGT酶的底物。例如，当所要测定的UGT酶中不包含UGT1A1/Ugt1a1时，所采用的底物中相应地不包含雌二醇。

其中，所述孵育体系由Tris-HCl和氯化镁组成，其中，所述孵育体系的pH值为7-8；优选地为7.4或7.5。

优选地，所述孵育的温度为37℃。

优选地，所述孵育的时间为60分钟(人肝微粒体中)或90分钟(大鼠肝微粒体中)。

优选地，将包含雌二醇和血清素的组合一单独和UGT酶孵育，将包含鹅去氧胆酸、丙泊酚和齐多夫定的组合二单独和UGT酶孵育，反应终止后，利用LC-MS/MS对UGT酶代谢物进行测定。

优选地，加入UGT酶后，可进行预孵育，预孵育的时间可选5min。

其中，所述UDPGA是指uridine diphosphate glucuronic acid(尿苷二磷酸葡萄糖醛酸)，可选浓度为5mM；反应过程中，所述UDPGA用于启动反应，具体作用为提供葡萄糖醛酸基，在生物体内，UGT酶将其结合到底物上，底物包括一些内源性物质和一些药物、环境污染物等外源性物质，形成水溶性比较高的结合物，有利于系统循环物质的清除代谢。

优选地，可加入终止剂终止反应。所述终止剂为含有内标的冰乙腈、冰甲醇、高氯酸等，其中，所述内标包括100ng/ml的茶碱和100ng/ml的氯磺丙脲(反应体系的终浓度)；优选地，为含有内标的冰乙腈。

其中，当所述的UGT酶的底物包括雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚和齐多夫定时，所述UGT酶的底物范围分别为分别为1.5-3.5μΜ、4-10μΜ、300-600μΜ、2-5μΜ、200-400μΜ(人肝微粒体中)，优选地，为2μΜ，5μΜ，500μΜ，2μΜ，300μΜ；当所述UGT酶为大鼠UGT酶时，所述UGT酶的底物雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定的摩尔浓度为1.5-4μΜ、2-5μΜ、20-50μΜ、2-5μΜ、150-300μΜ，优选地，为2μΜ，2μΜ，20μΜ，2μΜ，200μΜ。

本发明中，测定UGT酶的方法可以采用LC-MS/MS进行测定，UGT代谢物的质谱条件如表1所示。

表1：

本发明还提供了所述测定UGT酶活性的cocktail方法在评价化合物对UGT酶活性的影响中的应用。

本发明还提供了一种直接利用大鼠或人肝微粒体测定UGT酶活性的cocktail方法，包括以下步骤：在含有Tris-HCl和氯化镁的孵育体系中，加入大鼠肝微粒体、丙甲菌素、UDPGA和UGT酶的底物，在35-40℃下反应60-90分钟，测定UGT酶的活性。

其中，所述UGT酶为人UGT酶或大鼠UGT酶；所述UGT酶包括UGT1A1/Ugt1a1、UGT1A3/Ugt1a3、UGT1A6/Ugt1a6、UGT1A9/Ugt1a9、UGT2B7/AZTG。即，当所述UGT酶为人UGT酶时，所述UGT酶包括UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7中的一种或多种；当所述UGT酶为鼠UGT酶时，所述UGT酶包括Ugt1a1、Ugt1a3、Ugt1a6、Ugt1a9、AZTG中的一种或多种。

其中，所述UGT酶的底物包括雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定中的一种或多种。即，UGT1A1/Ugt1a1的底物为雌二醇，UGT1A3/Ugt1a3的底物为鹅去氧胆酸，UGT1A6/Ugt1a6的底物为血清素，UGT1A9/Ugt1a9的底物为丙泊酚，UGT2B7/AZTG的底物为齐多夫定。

其中，所采用的底物与所要测定的UGT酶一一对应，即，当所要测定的UGT酶中不包含某一亚型时，所采用的底物中相应地不包含该所述亚型的UGT酶的底物。如，当所要测定的UGT酶中不包含UGT1A1/Ugt1a1时，所采用的底物中相应地不包含雌二醇。

其中，所述孵育体系由Tris-HCl和氯化镁组成，其中，所述孵育体系的pH值为7-8；优选地，为7.4或7.5。

优选地，所述孵育的温度为37℃。

优选地，所述孵育的时间为60分钟(人肝微粒体中)-90分钟(大鼠肝微粒体中)。

优选地，将包含雌二醇和血清素作为组合一单独和UGT酶孵育，将包含鹅去氧胆酸、丙泊酚和齐多夫定作为组合二单独和UGT酶孵育，反应终止后，对UGT酶活性进行测定。

优选地，加入UGT酶后，可进行预孵育，预孵育的时间可选5min。

优选地，加入UGT酶后，可加入UDPGA启动反应。其中，所述UDPGA是指uridinediphosphate glucuronic acid(尿苷二磷酸葡萄糖醛酸)，可选浓度为4-5mM；优选地，为5mM。

优选地，可加入终止剂终止反应。所述终止剂为含有内标的冰乙腈、冰甲醇、高氯酸等；优选地，为含有内标的冰乙腈，其中内标包括茶碱和氯磺丙脲各100ng/ml(终浓度)。

优选地，可加入终止剂终止反应后，彻底涡旋混匀3分钟后，以14,000g转速在4℃离心10分钟，取60μl上清进行LC-MS/MS分析。

其中，当所述的UGT酶的底物包括雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚和齐多夫定时，所述UGT酶的底物范围分别为1.5-3.5μΜ、4-10μΜ、300-600μΜ、2-5μΜ、200-400μΜ(人肝微粒体中)，优选地，为2μΜ，5μΜ，500μΜ，2μΜ，300μΜ；当所述UGT酶为大鼠UGT酶时，所述UGT酶的底物雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定的摩尔浓度为1.5-4μΜ、2-5μΜ、20-50μΜ、2-5μΜ、150-300μΜ，优选地，为2μΜ，2μΜ，20μΜ，2μΜ，200μΜ。

当测定人肝微粒体时，所述人肝微粒体、丙甲菌素、Tris-HCl、氯化镁、UDPGA、雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定的终浓度分别为：0.2-1mg/ml，25μg/ml，50mM，5mM，4-5mM，1.5-3.5μΜ、4-10μΜ、300-600μΜ、2-5μΜ、200-400μΜ；优选地，为0.25mg/ml、25μg/ml、50mM、5mM、5mM、2μΜ、5μΜ、500μΜ、2μΜ、300μΜ；所用终止剂和孵育体系中其它物质的体积比为1：1，具体为100μl。

当测定大鼠肝微粒体时，所述大鼠肝微粒体中蛋白浓度为0.2-1mg/ml；优选地为，0.5mg/ml(蛋白浓度)。

所述大鼠肝微粒体、丙甲菌素、Tris-HCl、氯化镁、UDPGA、雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定的终浓度分别为：0.2-1mg/ml(蛋白浓度)，25μg/ml，50mM，5mM，4-5mM，1.5-4μΜ，2-5μΜ，20-50μΜ，2-5μΜ，150-300μΜ；优选地，所述大鼠肝微粒体、丙甲菌素、Tris-HCl、氯化镁、UDPGA、雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定的用量分别为0.5mg/ml(蛋白浓度)、25μg/ml、50mM、5mM、5mM、2μM、2μM：20μM、2μM、200μM。所用的终止剂和孵育体系的体积比为1：1，具体为100μl。

所述丙甲菌素的作用是促进人肝微粒体或大鼠肝微粒体中UGT酶的释放。所述丙甲菌素可由TritonX-100替代。

在本发明的一个具体实施方式中，所述直接利用大鼠肝微粒体测定UGT酶活性的方法，包括以下步骤：由0.5mg/ml(蛋白浓度)的大鼠肝微粒体、25μg/ml的丙甲菌素、50mMTris-HCl(pH 7.4)、5mM的氯化镁以及各种酶的底物组成。先将大鼠肝微粒体、丙甲菌素、Tris-HCl、氯化镁和各种UGT酶的底物放置冰上15min，使丙甲菌素发挥作用，将UGT酶从大鼠肝微粒体内质网膜上释放出来，之后放置孵育仪上预孵育5min，再用5mM的UDPGA启动反应，放在孵育仪上37℃反应90分钟。用含有内标的冰乙腈加入孵育体系中终止反应，彻底涡旋混匀3分钟后，以14,000g转速在4℃离心10分钟，取60μl上清进行LC-MS/MS分析。

本发明还提供了所述直接利用大鼠肝微粒体测定UGT酶活性的方法在评价化合物对UGT酶活性的影响中的应用。

本发明还提出了一种组合物，所述组合物包括雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定中的一种或多种。

本发明还提出了一种测定人肝微粒体中UGT酶的组合物，所述组合物包括含有雌二醇和血清素的组合一，以及含有鹅去氧胆酸、丙泊酚和齐多夫定的组合二；所述雌二醇、血清素的摩尔浓度分别为1.5-3.5μΜ、300-600μΜ；所述UGT酶的底物鹅去氧胆酸、丙泊酚、齐多夫定的摩尔浓度分别为4-10μΜ、2-5μΜ、200-400μΜ；优选地，所述雌二醇、血清素的摩尔浓度分别为2μΜ、500μΜ；所述UGT酶的底物鹅去氧胆酸、丙泊酚、齐多夫定的摩尔浓度分别为5μΜ、2μΜ、300μΜ。

本发明还提出了所述测定人肝微粒体中UGT酶活性的组合物在测定人肝微粒体中UGT酶活中的应用。

本发明还提供了所述测定人肝微粒体中UGT酶活性的组合物在评价化合物对UGT酶活性的影响中的应用。

本发明还提供了所述测定人肝微粒体中UGT酶活性的组合物在筛选UGT酶的抑制剂中的应用。

其中，所述人肝微粒体中UGT酶包括UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7中的一种或多种。

本发明还提出了一种测定大鼠肝微粒体中UGT酶活性的组合物，所述组合物包括含有雌二醇和血清素的组合一，以及含有鹅去氧胆酸、丙泊酚和齐多夫定的组合二；所述雌二醇、血清素的摩尔浓度分别为1.5-4μΜ、20-50μΜ、所述UGT酶的底物鹅去氧胆酸、丙泊酚、齐多夫定的摩尔浓度分别为2-5μΜ、2-5μΜ、150-300μΜ；优选地，所述雌二醇、血清素的摩尔浓度分别为2μΜ、20μΜ；所述UGT酶的底物鹅去氧胆酸、丙泊酚、齐多夫定的摩尔浓度分别为2μΜ、2μΜ、200μΜ。本发明还提出了所述组合物在测定大鼠肝微粒体中UGT酶活性中的应用。

本发明还提供了所述测定大鼠肝微粒体中UGT酶活性的组合物在评价化合物对UGT酶活性的影响中的应用。

本发明还提供了所述测定大鼠肝微粒体中UGT酶活性的组合物在筛选UGT酶的抑制剂中的应用。

其中，所述大鼠肝微粒体中UGT酶包括Ugt1a1、Ugt1a3、Ugt1a6、Ugt1a9、AZTG中的一种或多种。

本发明中，可根据所要测定的UGT酶的组分，相应地调整组合物中UGT酶的底物，例如，当所要测定的UGT酶中不包含UGT1A1/Ugt1a1时，所述组合物中相应地不包含雌二醇。

本发明提供了选择专属性很高的雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定作为UGT1A1/Ugt1a1，UGT1A3/Ugt1a3，UGT1A6/Ugt1a6，UGT1A9/Ugt1a9和UGT2B7/AZTG的底物，并且提供了特定的底物浓度，如人肝微粒体中，雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定浓度分别为1.5-3.5μΜ、4-10μΜ、300-600μΜ、2-5μΜ、200-400μΜ；大鼠肝微粒体中，雌二醇、鹅去氧胆酸、血清素、丙泊酚、齐多夫定浓度1.5-4μΜ、2-5μΜ、20-50μΜ、2-5μΜ、150-300μΜ。

本发明提供了底物相互作用影响程度测定方法，首先将底物单独进行孵育，与cocktail方法比较，如将UGT1A1底物单独孵育与cocktail(五种底物)方法孵育结果比较，即可以考察其它底物对UGT1A1酶活性的影响程度，从而判断每种酶活性受到其它四种底物的影响大小；其次将cocktail中五种底物取出一种，如从五种底物中取出UGT1A1底物可以用cocktail-1A1表示，将剩余的4种底物孵育，然后将实验结果与五种底物共孵育进行比较，考察UGT1A1底物对剩余四种底物的影响，从而反映UGT1A1底物对其它酶活性的影响。

本发明提供了大鼠肝微粒体中五种UGT底物的cocktail方法，将底物之间相互作用比较大的分开，相互作用小的一起孵育，即将UGT1a1，UGT1a6底物作为一个组合共同孵育，将UGT1a3，UGT1a9，AZTG底物作为一个组合(人肝微粒体中对应UGT2B7)共同孵育，以达到使底物之间相互作用最小的结果。

本发明首次建立了测定大鼠肝微粒体中5种Ugt亚型的cocktail方法，对于快速评价大鼠肝微粒体中UGT酶的活性具有重要意义。并且本发明在之前文献已报道的UGT酶在人肝微粒体中cocktail方法基础上，选择了更专属的底物和更合适的底物浓度，进一步发展了UGT酶在人肝微粒体中的cocktail方法，使得底物之间相互作用更小。

本发明通过建立大鼠和人肝微粒体中UGT酶活性的cocktail方法也能帮助了解UGT酶的种属差异，为利用大鼠模型进行药代动力学和毒代动力学的实验评估提供了参考。

本发明测定UGT酶活的方法为：LC-MS/MS分析法。LC-MS/MS具有高效、快速、灵敏的优点，能同时检测多个化合物，有助于快速、大量筛选对UGT酶活性有抑制作用的化合物，被频繁的应用在检测多种UGT底物和代谢物的实验中。本实验所用LC-MS/MS为安捷伦1290液相色谱-6460三重四级杆质谱联用仪。色谱柱为Phenomenex Kinetex XB-C18柱(100×4.6mm,2.6μM)，流动相选择为A：水(0.01％乙酸)和B：乙腈，流速为0.4ml/min。流动相梯度为0-1分钟，20％B；1-2.5分钟，20-30％B；2.5-5分钟，30-80％B；5-6分钟，80％B；6-6.5分钟，80-30％B；6.5-7分钟，30-20％B；7-9分钟，20％B。质谱条件为：正/负离子电喷雾离子化(ESI)模式下，选择多反映监测(MRM)模式监控母离子子离子，具体离子对信息如下表1所示。其他条件，干燥气温度：350℃；干燥气流速：10L/min；雾化气压力：35psi；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；碰撞气压力，1.6Mpa。

本发明测定UGT酶活的cocktail法的有益效果在于：

(1)高效性：本发明通过选择专一性高的底物，利用cocktail底物同时测定UGT的多种同工酶活性的优势，使得多个酶的活性变化可通过单次实验获得；可以考察如大鼠和人肝微粒体中五种UGT酶活性的变化，达到快速检测酶活性的目的。

(2)全面性：传统的单一探针药物研究方法，单次实验只能反映一种酶的活性，很难满足现代研究快速、准确、方便和经济的要求，而cocktail方法能同时反映化合物对多种酶的活性影响，并将有效减小实验数据的波动，具有全面的特点。

(3)高专属性：本发明通过考察底物之间相互作用选择合适的底物共同孵育，将底物之间有相互作用的分开来孵育，因此底物之间的相互作用几乎可以忽略不计，从而使得反应的专属性强，达到不影响其反应的目的。

本发明中，3'-Azido-3'-deoxythymidine(AZT,zidovudine)glucuronidation缩写为AZTG。

本发明中，cocktail-1A1表示cocktail(5种底物)方法中去掉UGT1A1的底物进行孵育的结果，即只含有UGT1A3，UGT1A6，UGT1A9和UGT2B7四种酶的底物共同孵育与完整的cocktail(5种底物)进行比较，其他同上。

附图说明

图1为五种UGT酶底物相互作用的关系；其中，图1A为大鼠肝微粒体中的测定结果，图1B为人肝微粒体中的测定结果。

图2为各种UGT酶的底物对其余四种底物的影响；其中，图2A为大鼠肝微粒体中的测定结果，图2B为人肝微粒体中的测定结果。

图3为本发明建立的cocktail方法实验结果；其中，图3A为大鼠肝微粒体中的测定结果，图3B为人肝微粒体中的测定结果。

图4为阳性抑制剂验证实验；其中，图4A为大鼠肝微粒体中阳性抑制剂的作用结果，图4B为人肝微粒体中阳性抑制剂的作用结果。

图5为不同底物浓度对五种Ugt酶的底物之间相互作用；其中，图5A为大鼠肝微粒体中底物相互作用的关系，图5B为大鼠肝微粒体中各种Ugt酶的底物对其余四种底物的影响结果。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：在大鼠肝微粒体中建立检测五种Ugt亚型酶活性的cocktail方法

(1)五种Ugt亚型酶的底物选择

Ugt1a1的底物选择为雌二醇，UGT1a3的底物选择为鹅去氧胆酸，UGT1a6的底物选择为血清素，UGT1a9的底物选择为丙泊酚，AZTG(具体对应亚型仍处于研究中)的底物选择为齐多夫定，选择各自底物浓度的1/5Km-1/2Km或者更低处进行孵育。

(2)孵育条件

孵育体系主要由0.5mg/ml(蛋白浓度)的大鼠肝微粒体、25μg/ml的丙甲菌素、50mMTris-HCl(pH 7.4)、5mM的氯化镁以及各种探针底物(UGT底物)组成。先将大鼠肝微粒体、丙甲菌素、Tris-HCl和氯化镁以及探针底物(酶的底物)放置冰上15min，使丙甲菌素发挥作用，将UGT酶从内质网膜上释放出来，之后放置孵育仪上预孵育5min，再用5mM的UDPGA启动反应，放在孵育仪上37℃反应90分钟。用含有内标的冰乙腈加入孵育体系中终止反应，彻底涡旋混匀3分钟后，以14,000g转速在4℃离心10分钟，取60μl上清进行LC-MS/MS分析。

实施例2在人肝微粒体中建立检测五种UGT亚型酶活性的cocktail方法

底物选择、孵育条件和操作流程与实施例1相同，只是将蛋白浓度改为0.25mg/ml，孵育时间为60min。底物浓度分别为雌二醇，2μM；鹅去氧胆酸，5μM；血清素，500μM；丙泊酚，2μM；齐多夫定，300μM。

实施例3五种底物共同孵育时的相互作用

在大鼠肝微粒体中，将五种底物混合到一起(底物最终浓度为：雌二醇，2μM；鹅去氧胆酸，2μM；血清素，20μM；丙泊酚，2μM；齐多夫定，200μM)，将其共同孵育，得到5个底物共同孵育的cocktail结果，与每个底物单独孵育所测定的酶活性进行比较，直观的得出cocktail方法与单独孵育的差异，如图1A所示，Ugt1a1在cocktail方法孵育中与单独孵育中比值接近250％，即受到底物之间相互作用影响较大，其他底物共同孵育和单独进行孵育比较都接近100％，即受到底物之间的相互作用影响较小。

在人肝微粒体中，将五种底物混合到一起(底物最终浓度为：雌二醇，2μM；鹅去氧胆酸，5μM；血清素，500μM；丙泊酚，2μM；齐多夫定，300μM)，将其共同孵育，得到5个底物共同孵育的cocktail结果，与每个底物单独孵育所测定的酶活性进行比较，直观的得出cocktail方法与单独孵育的差异，如图1B所示：UGT1A1，UGT1A9和UGT2B7受到相互作用的影响比较大，尤其是UGT1A9，从图中可知其cocktail方法孵育与单独孵育比值只有40％左右。即，五种底物共同孵育时，可能有其他酶的底物对其产生了较强烈的抑制。

实施例4每种底物对其他各种底物的作用

(1)在大鼠肝微粒体中，其他条件同实施例1，从五种底物中取出一种底物，将剩余的四种底物进行孵育，与五种底物共同孵育进行比较(底物最终浓度为：雌二醇，2μM；鹅去氧胆酸，2μM；血清素，20μM；丙泊酚，2μM；齐多夫定，200μM)，得出其中一种底物对剩下的4种底物的影响。如从五种底物中取出Ugt1a1，将剩余的4种底物孵育，然后与五种底物共孵育进行比较，考察Ugt1a1底物对剩余四种底物的影响。如图2A所示，在cocktail-1a1中，AZTG的反应与完整的cocktail(含有5种底物)比较，代谢物只有30％左右，说明在去掉Ugt1a1底物后，AZTG的反应活性下降了70％，即Ugt1a1和AZTG是有可能发生底物之间比较强烈的相互作用。而从图cocktail-1a6中发现，在去掉Ugt1a6底物后，对剩余底物的影响比较小，因此总结图2A，Ugt1a1底物容易受到影响，考虑到Ugt1a1底物容易与其他底物发生相互作用，而Ugt1a6底物与其他底物发生相互作用的可能性最小，本发明设计将Ugt1a1和Ugt1a6底物共同孵育，Ugt1a3，Ugt1a9和AZTG底物共同孵育，以降低底物之间相互作用的影响。

(2)在人肝微粒体中，实验方法同上，底物最终浓度不同，具体为：雌二醇，2μM；鹅去氧胆酸，5μM；血清素，500μM；丙泊酚，2μM；齐多夫定，300μM。结果如图2B所示，在cocktail-1A1中，UGT1A9与完整的cocktail(含有5种底物)比较，代谢物高达250％，表明，在去掉UGT1A1底物的情况下，UGT1A9的反应活性升高了许多，即UGT1A1底物和UGT1A9底物之间是可能有底物之间的相互作用的，而UGT2B7则下降了一些，表明UGT1A1底物和UGT2B7底物之间也有可能存在底物之间的相互作用。同理，在图cocktail-1A6中，可知UGT1A6底物和UGT2B7底物之间可能存在相互作用，而UGT1A6底物与其他底物之间相互作用较小，因此，我们尝试将UGT1A1和UGT1A6底物作为组合一共同孵育，而将UGT1A3，UGT1A9和UGT2B7底物作为组合二共同孵育，从而达到降低底物之间相互作用的目的。

实施例5 cocktail方法

(1)在大鼠肝微粒体中，由于Ugt底物之间的相互作用，Ugt1a1底物和AZTG底物相互作用比较明显，而Ugt1a6底物与其他底物之间相互作用均较小，因此本发明将底物分开进行孵育，其他条件同实施例1，具体为将UGT1a1和Ugt1a6底物放在一起孵育，将Ugt1a3，Ugt1a9和AZTG底物放在一起孵育，减少底物之间的相互作用。如图3A所示，当将Ugt1a1和Ugt1a6底物共同孵育时，与单独孵育相比Ugt1a1和Ugt1a6活性几乎没有变化，Ugt1a3，Ugt1a9和AZTG底物也是同样的情况。

(2)在人肝微粒体中，由于底物之间相互作用，同样将底物分开进行孵育，具体分组方法同大鼠肝微粒体中，具体为将UGT1A1和UGT1A6底物放在一起孵育，将UGT1A3，UGTA9和UGT2B7底物放在一起孵育，减少底物之间的相互作用。从图3B中，也可以发现该分组有效减少了底物之间的相互作用。

实施例6验证方法的可靠性

(1)在大鼠肝微粒体中，选择各种酶的阳性抑制剂：Ugt1a1的阳性抑制剂为胆红素(100μΜ)，Ugt1a3的阳性抑制剂为石胆酸(50μΜ)，Ugt1a6的阳性抑制剂为曲格列酮(250μΜ)，Ugt1a9的阳性抑制剂为尼氟酸(200μΜ)，AZTG的阳性抑制剂为酮康唑(500μΜ)，分别将阳性抑制剂对各酶的底物单独孵育的抑制效果与cocktail方法(五种酶的底物共同孵育)孵育的抑制效果进行比较。如图4A所示，cocktail方法加入阳性抑制剂孵育的结果与单独孵育加入阳性抑制剂的结果也是几乎相同的，说明抑制剂的抑制效果在两种孵育方法中并无本质的不同。

(2)在人肝微粒体中，抑制剂的浓度分别为：UGT1A1的阳性抑制剂胆红素，50μΜ；UGT1A3的阳性抑制剂石胆酸，10μΜ；UGT1A6的阳性抑制剂曲格列酮，50μΜ；UGT1A9的阳性抑制剂尼氟酸，5μΜ；UGT2B7的阳性抑制剂酮康唑50μΜ；实验结果如图4B所示，cocktail方法(五种酶的底物共同孵育)加入阳性抑制剂的抑制效果与单独孵育各酶的底物加入阳性抑制剂的结果几乎是相同的，说明抑制剂的抑制效果在两种孵育方法中并无本质不同，本发明的cocktail方法可以用于筛选UGT酶的抑制剂。

实施例7不同肝微粒体中蛋白浓度对UGT酶活性测定的影响

其他条件同实施例1，如当大鼠肝微粒体为0.05-0.5mg/ml之间时，即，具体蛋白浓度为0.05，0.1，0.2，0.5(mg/ml)，结果发现随着蛋白浓度的增高，代谢物的生成量增加，而反应速度却降低，同时AZTG代谢物生成量比较少，因此综上所述，本发明选择0.5mg/ml作为优选的最终的蛋白浓度。

实施例8不同反应时间对UGT酶活性测定的影响

其他条件同实施例1，如在大鼠肝微粒体中，当反应时间分别为15分钟，30分钟，60分钟和90分钟，结果发现随着时间的增加，代谢物的量增加，反应速度降低，考虑到AZTG反应比较慢，同时生成代谢物量比较少，因此本发明选择90分钟作为最终的反应时间。

实施例9不同底物浓度对UGT酶活性测定的影响

其他条件同实施例1，如在大鼠肝微粒体中，当底物浓度分别为：雌二醇，5μM；鹅去氧胆酸，10μM；血清素，50μM；丙泊酚，20μM；齐多夫定，200μM。本发明测定了底物之间相互作用程度，如图5A所示，发现在五种酶的底物单独孵育与cocktail孵育(五种酶的底物共同孵育)比较中，Ugt1a1和AZTG反应均受到较大影响，具体表现为Ugt1a1代谢物增加，而AZTG减少；如图5B所示，在减少一种底物与完整的cocktail方法比较中发现，如cocktail-1a1和cocktail-1a3中，AZTG受到较大的影响，在cocktail-1a6中，Ugt1a1和Ugt1a9均受到较大影响，在cocktail-1a9中，Ugt1a1和AZTG也受到影响，cocktail-AZTG中，Ugt1a1受到较大的影响，即彼此之间相互作用是比较明显的，因此底物浓度分别为：雌二醇，5μM；鹅去氧胆酸，10μM；血清素，50μM；丙泊酚，20μM；齐多夫定，200μM时，不适用于本发明的方法。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。