核酸在提高细胞巨核分化效率中的用途

摘要

本发明提出了核酸在提高细胞巨核分化效率中的用途以及提高细胞巨核分化效率的方法，所述细胞具有巨核分化的潜能，所述核酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。在细胞中过表达具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸，可显著提高具有巨核分化潜能细胞的分化效率。

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及核酸在提高细胞巨核分化效率中的用途以及提高细胞巨核分化效率的方法

背景技术

核辐射，武器伤，大剂量的化疗，异体组织器官移植，免疫系统和血液系统的一些疾病都会导致血小板数量的减少或者功能不良，引起内出血而危及生命。临床上多通过反复输注血小板，预防病人内出血的发生。因此，血小板的需求量巨大。目前常采用的机采血小板却存在着供者舒适度低，供应量少，保存时间短，会产生免疫反应及病原体污染等不利因素，要解决血液来源匮乏的问题，开发新的血源变得尤为迫切，其中干细胞研究为体外制备血小板提供了新的研究方向，包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)及脐带、骨髓、外周血来源的造血干祖细胞都可以作为种子细胞，通过大量诱导扩增生成可用于移植的巨核祖细胞、巨核细胞或者血小板。经研究证实，在体外扩增的造血干细胞，诱导其分化为巨核细胞和血小板，重新回输入体内，也可以发挥相应的凝血功能。虽然诱导干细胞获得巨核细胞和成熟血小板的研究不断见诸报导，但是目前的干细胞的巨核分化效率和细胞活性低，产生的有功能的细胞和血小板的生成量少，不能满足临床应用需要。因而，目前的诱导干细胞巨核分化的方法仍有待改进。

生理条件下，造血干细胞向巨核系定向分化的过程经历了如下过程：pluripotentstem cell(多能干细胞)→committed stem cell(定向干细胞)→CFU-GEMM(colonyforming unit-granulocyte,erythrocyte,monocyte and megakaryocyte：粒细胞，红细胞，单核细胞及巨核细胞集落形成单位；多能造血祖细胞)→BFU-MK(burst forming unit-megakaryocyte：爆式巨核细胞集落形成单位；前巨核细胞系祖细胞)→CFU-MK(colonyforming unit-megakaryocyte：巨核细胞集落形成单位；巨核细胞系祖细胞)→promegakaryoblast(前原始巨核细胞；前成巨核细胞)→megakaryoblast(原始巨核细胞；成巨核细胞)→promegakaryocyte(幼稚巨核细胞)→megakaryocyte(巨核细胞)→platelet(血小板)。

microRNA(miRNA)是一类由真核生物内源性表达产生的单链非编码RNA，长度约在18-25个核苷酸之间。miRNA能够以碱基互补配对的方式结合靶基因转录的mRNA的3’UTR区，极少数结合于5’UTR区或者ORF区，使靶基因的mRNA降解，或者抑制其翻译，从而下调目的蛋白的表达，来调节基因的表达，单个microRNA分子可调控的靶基因数量为200个以上。miRNA通过RNA聚合酶II转录作为加帽和聚腺苷酸化的pri-miRNA的一部分。pri-miRNA在Drosha核糖核酸酶III酶切割以产生约70nt的茎环前体miRNA(pre-miRNA)，其进一步被细胞质Dicer核糖核酸酶切割以产生成熟miRNA。

发明内容

本申请是基于发明人对以下问题和事实的发现而提出的：

发明人在实验中意外地发现，整个巨核分化的过程中有一种微小RNA(miR-1915-3p)的表达量逐渐增加。因此，发明人推测miR-1915-3p参与到了巨核分化的过程中。基于此发现，发明人在原代分离的造血干、祖细胞和人白血病细胞系中均过表达miR-1915-3p，发明人惊喜地发现，过表达组细胞能够显著提高成熟度更高的巨核细胞的分化效率。因而，发明人得出结论，miR-1915-3p能够显著增加造血干细胞或其他干细胞的巨核分化能力，提高造血干细胞或其他干细胞的分化效率。

在本发明的第一方面，本发明提出了核酸在提高细胞巨核分化效率中的用途，所述细胞具有巨核分化的潜能，所述核酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

CCCCAGGGCGACGCGGCGGG(SEQ ID NO：1)。

发明人发现，在细胞中过表达具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸，可显著提高具有巨核分化潜能细胞的分化效率。根据发明的具体实施例，具有SEQ ID NO：1核苷酸序列的核酸包括选自miR-1915-3p，pre-miR-1915-3p，pri-miR-1915-3p或包含miR-1915-3p，pre-miR-1915-3p，pri-miR-1915-3p任何构建体。

根据本发明的实施例，所述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述细胞包括选自造血干细胞、造血祖细胞、巨核前体细胞和人白血病细胞系的至少之一。发明人在实验中发现，在造血干细胞、造血祖细胞、巨核前体细胞和人白血病细胞系过表达具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸，其巨核分化的效率进一步显著提高。

根据本发明的实施例，所述造血干细胞、造血祖细胞、巨核前体细胞来源于外周血、脐带或骨髓。外周血、脐带或骨髓来源的造血干细胞、造血祖细胞和巨核前体细胞来源更加广泛，细胞纯度更高、巨核诱导分化效率更高。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种提高细胞巨核分化效率的方法，所述细胞具有巨核分化的潜能。根据本发明的实施例，所述方法包括：使所述细胞过表达核酸，所述核酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；以及使过表达所述核酸的细胞在诱导分化培养基中继续进行培养。利用根据本发明实施例的提高细胞巨核分化效率的方法，细胞巨核分化的效率高，获得的巨核细胞或血小板的活性好。

根据本发明的实施例，上述提高细胞巨核分化效率的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述培养是在在37摄氏度，5％CO₂条件下进行的。在上述培养条件下，可满足细胞基本的生活环境条件。

根据本发明的实施例，所述细胞包括选自造血干细胞、造血祖细胞、巨核前体细胞和人白血病细胞系的至少之一。如前所述，在造血干细胞、造血祖细胞、巨核前体细胞和人白血病细胞系过表达具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸，其巨核分化的效率进一步显著提高，获得的巨核细胞或血小板的活性更好。

根据本发明的实施例，所述造血干细胞、造血祖细胞、巨核前体细胞来源于外周血、脐带或骨髓。外周血、脐带或骨髓来源的造血干细胞、造血祖细胞和巨核前体细胞来源更加广泛，细胞纯度更高、巨核诱导分化效率更高，获得的巨核细胞或血小板的活性更好。

根据本发明的实施例，所述诱导分化培养基为Stemspan培养基，所述Stemspan培养基中含有100ng/mL重组人血小板生成素、100ng/mL干细胞生长因子、20ng/mL白细胞介素3、50ng/mL白细胞介素6和20ng/mL白细胞介素11。根据本发明的具体实施例，上述培养基作为待巨核诱导分化细胞的基础培养基，可提供原代分离的造血干细胞、造血祖细胞、巨核前体细胞基本的生长、扩增和巨核分化环境，在此基础上过表达具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸，上述细胞巨核分化的效率显著提高。

根据本发明的实施例，所述诱导分化培养基为MegaCult-C培养基，所述MegaCult-C培养基中含有1.1mg/ml的胶原蛋白、1％胎牛血清、10微克/ml的重组人胰岛素、200微克/ml的人铁传递蛋白、2mM的谷氨酰胺、10^-4M的2-巯基乙醇、50ng/ml的人重组血小板生成素、10ng/ml的人重组白细胞介素6和10ng/ml人重组白细胞介素3。根据本发明的具体实施例，上述培养基作为待巨核诱导分化细胞(如骨髓单个核细胞)的基础半固体培养基，可提供原代分离的造血干细胞、造血祖细胞、巨核前体细胞基本的生长、扩增和巨核分化环境，在此基础上过表达具有SEQ>

根据本发明的实施例，所述细胞预先进行巨核诱导。细胞预先进行巨核诱导，可使细胞预先适应巨核诱导环境，在此基础上过表达所述具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的核酸，细胞的存活效率更高、细胞的分化效率也会更高。

根据本发明的实施例，所述巨核诱导是通过如下方式实现的：使所述细胞在所述诱导分化培养基中进行诱导培养，所述诱导分化培养基为Stemspan培养基，所述Stemspan培养基中含有100ng/mL重组人血小板生成素、100ng/mL干细胞生长因子、20ng/mL白细胞介素3、50ng/mL白细胞介素6和20ng/mL白细胞介素11。预先巨核诱导在上述方式下进行，可使细胞的存活效率和巨核分化效率进一步提高。

根据本发明的实施例，所述诱导培养是在37摄氏度，5％CO₂条件下进行的，利用Stemspan培养基诱导培养所述细胞不多于20天，其中，隔天半量换液，使所述Stemspan培养基中各成分浓度不变。预先巨核诱导在上述条件下进行，可使细胞处于良好的巨核分化状态，在此基础上过表达所述核酸，细胞巨核分化的效率显著提高，获得的巨核细胞和血小板的活性更好。

根据本发明的实施例，使所述细胞过表达核酸是通过如下方式实现的：将携带有所述核酸的构建体通过电转、转染或转化的方式导入所述细胞。使所述细胞过表达所述核酸的方式不受特别限制，只要能够实验所述核酸有效导入受体细胞，并且保证良好的细胞状态即可。根据本发明的具体实施例，导入方式可以采用电转、转染或转化的方式进行。

附图说明

图1是根据本发明实施例的从人类基因中扩增出miR-1915-3p的前体的琼脂糖凝胶电泳结果；

图2是根据本发明实施例的载体图谱；

图3是根据本发明实施例的稳定表达miR-1915-3p的细胞系过表达miR-1915-3p结果；

图4是根据本发明实施例的造血干祖细胞向巨核诱导的0天，5天，10天进行miR-1915-3p转染后miR-1915-3p的过表达结果；

图5是根据本发明实施例的原代细胞过表达miR-1915-3p后，细胞巨核分化效率的提高的结果图；

图6是根据本发明实施例的原代细胞过表达miR-1915-3p后，细胞的形态变化结果图；

图7是根据本发明实施例的白细胞系中过表达miR-1915-3p，其具有巨核系细胞的比例增多的结果图；以及

图8是根据本发明实施例的骨髓单个核细胞过表达miR-1915后，巨核集落的数目明显高于对照组的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1造血干、祖细胞分离

1、无菌采集足月顺产胎儿断脐后的脐带血一份，将分离完上层血浆的脐带血，按照1:1的比例与PBS溶液混匀，再按4:1的比例与2.3％(w/v)的甲基纤维素，室温静置30分钟，待红细胞自然沉降至界限分明，沉降红细胞。

2、吸出上清，置50mL离心管中，25℃、20000rpm离心7分钟。在15mL的离心管中加入5mL Ficoll人淋巴细胞分离液，再缓缓沿管壁加入5mL细胞悬液，25℃、1800rpm离心25分钟，分离出单个核细胞。

3、收集界面单个核细胞，用PBS洗涤。此时获得为造血干、祖细胞，而后经过CD34磁珠孵育，并经过磁场分离，获得CD34阳性的造血干细胞，步骤如下：

4、从MNC细胞中分离脐带血造血干细胞(采用miniMACS分离系统，MiltenylBiotec)

(1)标记抗体，孵育

参照CD34⁺MicroBead>

(2)分离CD 34⁺细胞

向孵育体系内加入PBS，重悬至1.5ml，充分混匀后，1800rpm，离心5分钟，依照此方法，洗涤细胞2次。按照每108cells重悬于500μl体积细胞分离缓冲液重悬细胞。将分离柱MSColumn安装于磁力架上，使用2ml细胞分离缓冲液湿润分离柱后，将单个核细胞悬液缓缓沿分离柱内壁加入，避免产生气泡。待其自然流出后，使用1ml除气的PBS冲洗分离柱3次，以便将未结合的单个核细胞冲洗出分离柱。

实施例2巨核细胞的体外诱导

1、原代细胞的诱导

将实施例1分离得到的单个核细胞接种到6孔板细胞板中，每孔加入2ml密度为1×10⁷个/ml的单个核细胞，加入巨核诱导培养基2mL，然后置于37℃、5％CO₂孵箱中培养。

其中，该巨核诱导培养基是通过向Stemspan培养基中添加100ng/mL重组人血小板生成素(TPO)、100ng/mL干细胞生长因子(SCF)、20ng/mL白细胞介素3(IL-3)、50ng/mL白细胞介素6(IL-6)和20ng/mL白细胞介素11(IL-11)而获得的。视细胞生长水平，隔日半量换液，连续培养20天。

2、人白血病细胞系的诱导

用2ml UT-7细胞培养基(添加10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基)取3×10⁵个UT-7细胞，重悬后移至6孔板中，加入2nmol>

实施例3miR-1915-3p的过表达

1、在分离的原代细胞和人白血病细胞系中均进行miR-1915-3p的转染。其中，在分离的原代细胞中采用转染miR-1915-3p mimics(miRNA mimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，具有能增强内源性miRNA的功能)的方法进行miR-1915-3p过表达，在白血病细胞系中采用转染携带miR-1915-3p序列的质粒的方法进行miR-1915-3p过表达。人白血病细胞以添加10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基培养，每3天1：5传代。

2、转染时，取3×10⁵UT-7细胞以1.5ml培养基重悬，置于6孔板中，20pmol>

3、转染次日换液

其中miR-1915-3p的序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。CCCCAGGGCGACGCGGCGGG(SEQ ID NO：1)。

实施例4miR-1915-3p过表达载体的构建

在构建载体时，发明人所使用引物具有如下所示的序列。

pre-miR-1915-3p F：gaattcttccgttctcactcggactcc(SEQ ID NO：2)。

pre-miR-1915-3p R:gatatcttggtaactgtgctcaagaagat(SEQ ID NO：3)。

1.目的片段获取

1)在PCR专用管中配置体系如表1所示：

表1：

充分离心、混匀

2)将样品置于实时定量PCR仪中，并按如下程序进行，

顶盖温度：LID＝104℃，

预变性：95℃30s

扩增循环：95℃30s，58℃30s，68℃30s根据引物效率，重复30个循环

酶失活反应：68℃5min

冷却至4℃。

3)琼脂糖凝胶电泳：每管PCR产物加入4微升6×loading buffer，混合均匀，吸取全部混合液小心注入预先配置好的2％的琼脂糖凝胶样品孔中，在另一空白样品孔加入DL2000marker cDNA，连接电泳仪，设定电压为130mV，约30分钟，关闭电源，取出凝胶置于凝胶成像仪中，切下相应大小的目的条带。

从人类基因中扩增出miR-1915-3p的前体的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

2、目的片段与载体连接

1)酶切

PCR产物回收后同目的载体一起经EcoRⅠ和EcoRⅤ，酶切5小时后，再次胶回收。

2)连接

4μl目的片段与1μl目的载体与5μl SolutionⅠ混合，16℃连接2小时,载体图谱如图2所示。

3)目的质粒转化

(1)将目的质粒稀释至100ng/μl，取1μl加入到含30μl大肠杆菌感受态细胞悬液的EP管中，轻弹混匀，在冰上放置30min后，42℃热休克90s，再于冰上放置2min；

(2)每管加800μl无抗生素的液体LB培养基，150rpm 37℃震荡箱震荡45min；

(3)每个琼脂板中加入200-300μl菌液，用无菌弯头玻璃管将菌液均匀涂抹在含抗生素的琼脂板表面，37℃水平放置20min后，于37℃倒置12小时；

(4)在无菌大试管中，加入5ml LB培养基，并根据细菌抗性，加入相应抗生素；

(5)观察琼脂板表面的菌落，在其中选择独立饱满大小适中的克隆，用干净的小枪头挑取后，将小枪头放入相应大试管中，将试管放入气浴恒温震荡箱，牢固固定，200rpm37℃震荡12-14小时。

(6)按照质粒小提试剂盒中的产品说明中离心法纯化质粒DNA的步骤进行，提取后使用分光光度计测量质粒的浓度。

4)鉴定

将获得的目的质粒，进行序列检测。

获得的质粒中所连接的miR-1915-3p前体的序列如SEQ ID NO：4所示。

tcgctagggccgcccccgccgcgtcgccctggggcccacgggtgcacggcccgggcagcaaggcaaggtgcggcctctca(SEQ ID NO：4)。

实施例5稳定过表达miR-1915-3p的细胞系的建立

(1)将白血病细胞系细胞离心后计数，用培养基重悬至细胞密度为3×10⁵个/ml，按照每孔1.5ml加入标记好的6孔板中；

(2)取入4μg纯化的实施例4所获得的质粒并用Opti-MEM培养基补足至250μl(EP管1)，混匀；另取一个1.5ml EP管，加入240μl Opti-MEM培养基和10μl Lipofectamine2000(EP管2)，轻弹混匀，室温静置5min；

(3)将EP管1和2中的液体混合，轻柔混匀，室温静置20min后，将液体对应的逐滴加入准备好的6孔板中的细胞悬液中，轻柔震荡混匀后将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养；

(4)12小时后，将细胞取出，离心，换液，重悬后继续培养48小时；

(5)视细胞生长状态，确定药物筛选时间，当转染的细胞生长状态良好时，将细胞离心取出，视质粒抗性进行相应药物筛选，neomycin抗性质粒持续使用含G418的白血病细胞系培养基，puromycin抗性质粒持续使用含puromycin的培养基，3-4周，2-3天换液一次。

实施例6对于miR-1915-3p的表达量的检测

1、Trizol法提取个样本中的总RNA

2、miRNA的反转录

1)每个样品按照表2所示体系进行反转录，在PCR管中进行配置充分混匀、离心。

表2：

组成成分加入量5×miScriptHiFlex Buffer2μl10×miScriptNucleics Mix1μlmiScriptReverseTranscriptase Mix1μlmiRNA模板800ngNuclease-free Wate总体积补至10μl

2)按如下程序进行

顶盖温度：LID＝104℃，

逆转录反应：37℃1h，

酶失活反应：95℃5min，

冷却至4℃。

反应完成后，得到的cDNA溶液于-20℃保存，并可直接或稀释后用于PCR扩增反应。

3、实时定量PCR检测miRNA

实时定量PCR引物均由上海英骏公司合成，序列如表3所示：

表3：

所有基因的表达都以U6基因的表达量作为内参进行分析。

1)每个样品设置三个重复，在Q-PCR管中配置体系如表4所示，充分离心、混匀。

表4：

组成成分加入量All-in-oneq-PCRMix10μlH₂O8μlcDNA1μlmiRNA引物0.5μlU30.5μl

2)将样品置于实时定量PCR仪中，并按如下程序进行，

顶盖温度：LID＝104℃，

预变性：95℃10min

扩增循环：94℃15s，55℃30s，70℃30s重复40个循环

读取溶解曲线：55℃-95℃10s重复75个循环(每个循环递增0.5℃)

冷却至4℃。

3)收集数据，用BIO-RADiQ5软件进行分析。

实验结果如图3和图4所示。

图3显示了收集筛选出的稳定表达miR-1915-3p的细胞系(以UT-7细胞系为例)的实验组和转染空载体的对照组细胞，进行实时定量PCR的检测miR-1915-3p的相对表达量的结果，以对照组miR-1915-3p的表达量为1，结果显示细胞系中过表达了miR-1915-3p。

图4显示了分别在造血干祖细胞向巨核诱导的0天，5天，10天进行miR-1915-3pmimics和空载NC的转染，在20天的时候收集细胞，进行检测的结果，对照组miR-1915-3p的表达量为1，可见其他各组细胞中miR-1915-3p的表达量均高于对照组,图4结果表明：在各个阶段过表达了miR-1915-3p，过表达效果可以持续到20天细胞收集并检测中。

实施例7巨核细胞表面标志物统计与形态观察

发明人继续收集图4中的上述各组细胞，并检测他们巨核系相关表面标志(CD41和CD61)表达情况的结果如图5所示，图5结果说明miR-1915-3p过表达的细胞，巨核系相关的表面标志的表达量明显高于对照组，即过表达miR-1915-3p后，具有CD41⁺CD61⁺的特征的巨核系细胞比例增多。

发明人继续收集图4中的上述各组细胞通过瑞士吉姆萨染色，观察miR-1915-3p组与对照组细胞形态，结果如图6所示，图6结果显示：过表达miR-1915-3p组细胞更大，且多倍体细胞更多，较对照组有明显的巨核细胞特征。

发明人继续收集图3中各组细胞，检测他们巨核系相关表面标志(CD41和CD61)和相关巨核形态，实验结果如图7所示，结果显示同原代细胞瞬时转染的结果相同，白细胞系中过表达miR-1915-3p，其具有巨核系细胞的比例增多。

实施例8巨核集落统计

发明人对骨髓单个核细胞，进行了miR-1915的过表达后，接种至巨核集落培养基(为包含1.1mg/ml的胶原蛋白、1％胎牛血清、10微克/ml的重组人胰岛素、200微克/ml的人铁传递蛋白、2mM的谷氨酰胺、10^-4M的2-巯基乙醇、50ng/ml的人重组血小板生成素、10ng/ml的人重组白细胞介素6和10ng/ml人重组白细胞介素3的MegaCult-C培养基)，培养10天后，统计巨核集落的数量，结果如图8所示，图8结果显示，骨髓单个核细胞过表达miR-1915后，巨核集落的数目明显高于对照组。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所

<120> 核酸在提高细胞巨核分化效率中的用途

<130> PIDC3166081

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> miR-1915-3p的核苷酸序列

<400> 1

ccccagggcg acgcggcggg 20

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pre-miR-1915-3p上游引物序列

<400> 2

gaattcttcc gttctcactc ggactcc 27

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> pre-miR-1915-3p下游引物序列

<400> 3

gatatcttgg taactgtgct caagaagat 29

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 质粒中所连接的miR-1915-3p前体的序列

<400> 4

tcgctagggc cgcccccgcc gcgtcgccct ggggcccacg ggtgcacggc ccgggcagca 60

aggcaaggtg cggcctctca 80

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> U3 reverse序列

<400> 5

cgcttcggca gcacatatac ta 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> U6 forward 序列

<400> 6

cgcttcggca gcacatatac ta 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> miR-1915-3p forward序列

<400> 7

ccccagggcg acgcggcggg 20