一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器及其构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器及其构建方法和应用，属于生物制品的微生物制造领域。本发明构建了含有EGF和Ble双基因的载体pSP108‑EGF，并通过玻璃珠搅拌法进行莱茵衣藻的转化，成功获得经PCR和Southern Blot双重筛选确定的EGF‑Ble阳性转化子，衣藻转化子的EGF含量采用人EGF的ELISA试剂盒进行检测。采用本发明的方法制备EGF，可以克服现有技术以细菌生产EGF时产物的活性低、纯化过程复杂等缺点，更安全、有效，并具有成本低的优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器及其构建方法和应用。

背景技术

莱茵衣藻的细胞核转化技术衣藻是一种单细胞真核绿藻，因其培养条件简单、生长周期短、生长迅速、光合效率高而素有“光合酵母”之称,衣藻已完成基因组测序,序列结构比较清楚，是目前少数三套基因组(细胞核、叶绿体和线粒体)都能进行遗传转化的生物，其生物学特性为在短时间内获得大量遗传稳定的转基因后代，并进一步作为生物反应器提供了便利条件。将衣藻开发为生物反应器，生产各种活性蛋白质制品有以下潜在优势：一.作为光合自养微生物，生产成本低廉,经济划算；二.衣藻作为真核生物,具有复杂的翻译后修饰系统，可以对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰，使得重组表达的蛋白具有天然蛋白同等活性；三.衣藻本身不带有对人体有害的物质,如内毒素、免疫敏感蛋白等；四.衣藻反应器不产生有毒废弃物，培养、收集、提取过程简单，副产品无环境污染风险。现在已建立成熟的衣藻核转化技术，其技术有外源基因的转化技术(如电转化，玻璃珠转化，基因枪法，多聚物介导法)、衣藻转化的筛选基因研究(如內源筛选标记基因ARG7、NIT1、OEE1以及外源筛选标记基ble，hpt等)，在莱茵衣藻中成功表达的外源基因包括ble、aphVIII、hpt、金黄色葡萄球菌肠毒素C2，串联抗菌肽基因和phbB基因等。虽然衣藻的转化体系已经建立，但都是显著的在研究单个标记基因的表达模式，寻求更加快速、严谨、稳定的阳性子筛查方式，这是由于转化体系中携带标记基因和外源基因的双元基因载体的构造模式未能理论突破，也没有建立成熟的双元/多元转化模型，已报道的双元表达载体都是采用单个表达式简单的重复叠加形成，案例产生的衣藻转化子不稳定，难以成为生物反应器。

EGF的表达技术表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)是机体细胞合成和分泌的小分子多肽类物质，由53个氨基酸组成。研究表明，EGF对机体不同细胞具有促生长作用，参与各种细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程，其中最大特点在于EGF可刺激表皮细胞、内皮细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。

EGF临床上可促进受损表皮的修复与再生，在治疗消化道溃疡、角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合方面均取得了显著的疗效。同时由于EGF是一种人体产生的生物因子，故没有任何毒副作用，使用中未造成生物安全隐患，这使得EGF在化妆品领域中得到了广泛应用，可以起到延缓皮肤细胞衰老,使皮肤滋润光滑的作用，相比于一些其它的抗皱方法，安全是EGF卓越的优点。天然的EGF一般来自于动物体组织提取，但来源有限、成本较高、工艺复杂且产量甚微，远不能满足临床应用的需要，而采用基因工程方法生产EGF有望降低生产成本，增加产量，目前人表皮生长因子售价约为每克纯品30万港币，由于其生产具有巨大的经济效益和应用前景，很多企业和研究机构都在致力于EGF的基因工程产品研究和开发。

EGF基因已在几种宿主系统中得到克隆、表达与分泌，包括大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、蓝藻(cyanobacterium)等，由于表达系统之间特性各异，因此表达效果也有所不同。

由于EGF基因是一个真核基因，早期的研究均在真核细胞中表达EGF，得到具有生物活性的EGF，如酵母、蓝藻表达系统。但由于技术以及纯化条件等的限制，即使真核表达系统能够获得有活性的EGF蛋白，这些表达案例中普遍存在表达量不高、融合表达-纯化繁琐等缺陷,难以应用于产业化生产。

原核表达系统的遗传背景清楚，易于改造，工艺简单，成本低，流程短，蛋白表达水平高易于纯化，也是表达EGF基因的合适选择，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌表达系统。但由于在大肠杆菌中表达的EGF蛋白以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物，需要用变性剂处理，在适当条件下使其复性才能具有天然结构，限制了EGF的工业化生产及其应用。

为解决以上问题,目前在大肠杆菌中采用融合蛋白表达的方法，如与谷胱甘肽硫转移酶(GST)、金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)、天蚕素B等融合表达以期提高EGF的表达量和可溶度，但是，所获得的蛋白产物需要经过去标签，再折叠，多次纯化等处理过程，最终造成EGF比活的降低，未能改善EGF的生产现状。

根据现有研究，通过原核或真核系统表达EGF均存在表达量不高、活性低、纯化工艺复杂等缺陷。这不仅制约了EGF的临床研究和临床应用，也限制了EGF化妆品在消费人群中的进一步推广。因此，开发一种高效的EGF生产工艺不仅具有巨大的经济价值，也为EGF研究开发出更广阔的应用前景。

发明内容

本发明的发明人针对现有技术生产EGF存在的问题，研究并获得了一种可以用于生产EGF的衣藻生物反应器。具体而言，本发明的发明内容包括以下几个方面：

本发明的发明人首先提供了一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器，所述衣藻为莱茵衣藻，所述衣藻具有编码人表皮生长因子的核苷酸序列。具有EGF基因的阳性子衣藻能够生产具有活性的EGF蛋白，并且克服了大肠杆菌生产EGF活性低、纯化过程复杂和安全性低的缺点。

本发明实施例采用的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)为美国杜克大学提供的莱茵衣藻细胞壁缺陷型菌株CC400。

全文所述的“衣藻”和“莱茵衣藻”均代表莱茵衣藻。

本发明所述的人表皮生长因子的衣藻生物反应器，其具有的编码人表皮生长因子的核苷酸序列。

优选衣藻生物反应器具有的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器的构建方法，所述方法包括以下步骤：

1)以人EGF基因序列为基础，按照衣藻密码子偏好情况设计三对引物，PCR扩增获取EGF扩增产物，扩增产物连接pMD19-T载体得到pMD19-T-EGF；

2)用含有启动子Rbc pro、终止子Rbc term和基因ble的质粒pSP108与步骤1)的pMD19-T-EGF构造Rbc pro-EGF-Rbc term的EGF表达载体pEGF；

3)构造筛选标记基因Ble-EGF基因双元表达式载体：用pUC载体作为基础，将抗性基因Ble表达结构与EGF表达结构串联连接，形成融合表达式，设置单酶切位点于两侧，构造EGF的衣藻双元表达载体pSP108-EGF；

4)双元表达载体pSP108-EGF采用玻璃珠转化法转化衣藻，尝试线性化和环状载体的转化，筛选并获得阳性子。

本发明的发明人通过统计衣藻中成功转化使用的标记基因密码子使用情况，按照衣藻的密码子偏好性设计了三对引物EGF1/EGF2，EGF3/EGF4，以及EGF-sense-Msc I/EGF-anti-Xba I，它们的序列分别为

EGF1/EGF2：

ATGGCGAACTCCGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCACGACGGTTACTGCCTGCACGAC/GTACTTGTCCAGCGCTTCGATGTACATGCAAACACCGTCGTGCAGGCAGTAACCGTCG

EGF3/EGF4:

TCGAAGCGCTGGACAAGTACGCGTGCAACTGCGTTGTTGGTTACATCGGTGAACGGTG/TTACCGCAGTTCCCACCACTTCAGGTCCCGGTACTGGCACCGTTCACCGATGTAA

EGF-sense-Msc I/EGF-anti-Xba I:

TGGCCATGGCGAACTCCGACTCTGA/TCTAGATTACCGCAGTTCCCACCACTTCAGGTC。

上述引物依次对应序列表SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7。

根据本发明的一个具体实施例，步骤1)所述PCR扩增方法为：混合所有引物，以Ex-Taq进行PCR扩增，PCR程序为94℃，30秒，2个循环；40℃30秒，72℃30秒；94℃30秒，40℃30秒，72℃30秒，25个循环，获得的扩增产物。

根据本发明的一个具体实施例，步骤2)所述EGF表达载体pEGF的构造方法为：将含有启动子Rbc pro、终止子Rbc term和基因ble的质粒pSP108和pMD19-T-EGF经内切酶Msc I和Xba I切割后连接12小时，连接酶为T4连接酶，连接比例为EGF1：pSP108＝1:3，连接产物转化E.coli XL1，筛选阳性子后获得含有Rbc pro、终止子Rbc term和EGF的表达载体，即pEGF。

作为优选，步骤3)所述的双元表达载体pSP108-EGF的具体构建方法为：提取步骤2)所得的pEGF质粒进行PCR扩增，引物为Sense-Hind III/Anti-Pst IAAGCTTAGTACCGCACTGTCTCAGTGTGTAC/CTGCAGAGAAAGAGGCCAAAATCAAC，其序列分别对应序列表SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，PCR扩增程序为：94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30个循环，扩增产物为引入酶切点的EGF，将扩增产物连接pMD19-T载体后获得pExpEGF；将pSP108和pExpEGF分别以Hind III和Pst I酶切过夜后，回收酶切片段，以T4连接酶连接过夜，产物转化E.coli XL1，获得的阳性子为含有EGF和Ble双基因的双元表达载体pSP108-EGF。

作为优选，步骤4)转化衣藻的具体方法为：衣藻培养至1×10⁶个/mL的对数期，培养液经离心后加入TAP液体培养基重悬至浓度1×10⁸个/mL，重悬液与400μL>

筛选衣藻阳性子的方法可以是任何能实现筛选目的的方法，包括但不限于本发明的实施例所述的PCR和Southern Blot双重筛选法。

本发明的一个具体实施例用PCR和Southern Blot双重筛选衣藻阳性子的方法为：将步骤4)获得的衣藻单菌落接种于20mL TAP液体培养基，取10mL对数后期的衣藻培养液4℃离心，菌体以NET缓冲液重悬，然后用细菌基因组DNA提取的方法提取衣藻基因组DNA，以衣藻DNA为模板，引物为Check-sense/Check-anti：AGCTCGGAATTAACCCTCACTAAAG/TTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTG分别对应序列表中SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，PCR验证阳性子，PCR程序为94℃1分钟；94℃1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟，30个循环；72℃10分钟。PCR产物经电泳检测确定转化子，电泳结果转移至尼龙膜上进行southern杂交，杂交过程按文献进行，以地高辛标价的EGF基因和Ble基因为探针，以单基因EGF载体和EGF-Ble载体为对照，进一步确定衣藻转化的拷贝数和位置。

衣藻转化子表达的EGF含量采用人EGF的ELISA试剂盒进行测量，以两个非转基因衣藻为对照。根据本发明一个具体实施例的检测结果，衣藻转化子表达的EGF含量为15.8ng/g。

本发明所述的人表皮生长因子的衣藻生物反应器和其构建方法均可以用于生产EGF。

采用本发明的技术方案制造EGF具有以下优点：

1、用衣藻作为生物反应器生产EGF，可以克服以细菌生产EGF时产物的活性低、纯化过程复杂的缺点，衣藻作为真核细胞，能够对真核蛋白EGF进行正确的加工和折叠，这就保证了EGF蛋白的活性，同时衣藻作为安全性(GRAS)的反应器，相比具有内毒素的细菌反应器，其蛋白纯化过程相对简单，成本较低，具有较大的应用价值；

2、衣藻生物反应器的研究由于一直未能突破双基因转化体系的建立，因此对外源蛋白的表达极不稳定，以往研究的外源蛋白的表达常常由于基因沉默，转录效率低和蛋白不稳定而限制了外源蛋白和衣藻反应器的应用，本研究中的衣藻转化体系，以衣藻的NHEJ转化模式为基础，通过密码子优化、双基因串联表达载体获得了EGF稳定表达的衣藻生物反应器，可作为衣藻表达外源蛋白的范例，为进一步以衣藻生产其他活性蛋白提供理论和实验基础。

附图说明

附图1为衣藻生物反应器构建方法示意图；

附图2为衣藻EGF-BLe双元表达载体图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明，但不该将此理解为对本发明的限制。衣藻生物反应器构建方法参考附图1所示的示意图。

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)，实验动物常规手册(国家实验动物规范中心,2004年11月)：基本技术指南第五版(John Wiley&Sons，Inc，2005)中所述的条件及实验步骤，或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。

表1引物或目的基因序列表

实验材料

莱茵衣藻细胞壁缺陷型菌株CC400(美国杜克大学)，衣藻培养于含有100μg/mL精氨酸的TAP培养基中，20℃光照培养16小时，黑暗培养8小时至指数期。

实施例1构造EGF表达载体pMD19-T-EGF

以报道的人EGF基因序列(如表1SEQ ID NO.12所示，参考自NCBI)为基础，按照衣藻的密码子偏好性设计三对引物，即EGF1/EGF2、EGF3/EGF4、EGF-sense-Msc I/EGF-anti-Xba I(均由Invitrogen赛默飞世尔生物Thermo Fisher公司提供)，对应表1中SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.7。

混合所有引物，以Ex-Taq(购自Takara宝生物工程有限公司)进行PCR扩增，PCR程序为94℃，30秒，2个循环；40℃30秒，72℃30秒；94℃30秒,40℃30秒，72℃30秒，25个循环。扩增得到的片段大小168bp符合预期，片段连接pMD19-T载体后获得EGF表达载体pMD19-T-EGF。该载体转化E.coli JM109，测序结果经BLAST比对为EGF基因。

实施例2构造Rbc pro-EGF-Rbc term的EGF表达载体pEGF

将含有启动子Rbc pro、终止子Rbc term和基因ble的质粒pSP108(美国杜克大学)和实施例1得到的pMD19-T-EGF载体经内切酶Msc I和Xba I(购自Takara宝生物工程有限公司)切割后连接12小时，连接酶为T4连接酶(购自Takara宝生物工程有限公司)，连接比例为1EGF1：3pSP108，连接产物转化E.coli XL1(购自Takara宝生物工程有限公司)，筛选阳性子后获得含有Rbc pro、终止子Rbc term和EGF的表达载体，命名为pEGF。

实施例3衣藻双元表达载体pSP108-EGF

提取实施例2的pEGF质粒进行PCR扩增，引物为Sense-Hind III/Anti-Pst I，即表1的SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9(购自Invitrogen赛默飞世尔生物Thermo Fisher公司)；

PCR扩增程序为：94℃30秒55℃30秒，72℃30秒，30个循环。

扩增产物为引入酶切点的EGF，将扩增产物连接pMD19-T载体后获得pExpEGF。将pSP108和pExpEGF分别以Hind III和Pst I酶(购自Takara宝生物工程有限公司)切过夜后，回收酶切片段，按上述条件以T4连接酶连接过夜，转化E.coli XL1，获得的阳性子为含有EGF和Ble双基因的载体pSP108-EGF，见附图2。

实施例4衣藻转化和筛选

衣藻培养至1×10⁶个/mL的对数期，培养液经离心后加入TAP液体培养基重悬至浓度1×10⁸个/mL，重悬液与400μL>

将衣藻单菌落接种于20mL TAP液体培养基，取10mL对数后期的衣藻培养液4℃离心，菌体以NET缓冲液重悬，然后以细菌基因组DNA提取方法提取衣藻基因组DNA，以各衣藻DNA为模板，引物为Check-sense/Check-anti，即表1的SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11(购自Invitrogen赛默飞世尔生物Thermo Fisher公司)，PCR验证阳性子，PCR程序为94℃1分钟；94℃1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟，30个循环；72℃10分钟。PCR产物经电泳检测确定转化子，电泳结果转移至尼龙膜上进行southern杂交，杂交过程按文献(Sambrook等著的《分子克隆》)进行，以地高辛标价的EGF基因和Ble基因为探针，以单基因EGF载体和EGF-Ble载体为对照，进一步确定衣藻转化的拷贝数和位置。

实施例5衣藻生物反应器的EGF含量检测

将衣藻转化子在100mLTAP培养基中培养至对数期，培养液6000r/min离心6分钟，细胞以TEGN缓冲液重悬，超声破碎5min，破碎液以12000r/min离心7min，取上清液以0.22μm微孔滤膜过滤，作为样品。EGF含量检测采用Human EGF ELISA Kit(购自Dakewe达科为生物技术有限公司)，样品与试剂反应后测定OD450，以EGF标准品制作标准曲线，EGF含量结果为15.8ng/g。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川理工学院

<120> 一种人表皮生长因子的衣藻生物反应器及其构建方法和应用

<130> 2016

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 159

<212> DNA

<213> 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）

<220>

<221> 编码EGF的基因

<222> (1)..(159)

<400> 1

aattccgact ctgaatgccc gctgtctcac gacggttact gcctgcacga tggtgtttgc 60

atgtatatcg aagctctgga caaatacgcg tgcaactgtg ttgttggtta catcggtgaa 120

cgttgccagt accgtgacct aaagtggtgg gaacttcgt 159

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> EGF1 引物

<222> (1)..(57)

<400> 2

atggcgaact ccgactctga atgcccgctg tctcacgacg gttactgcct gcacgac 57

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> EGF2 引物

<222> (1)..(58)

<400> 3

gtacttgtcc agcgcttcga tgtacatgca aacaccgtcg tgcaggcagt aaccgtcg 58

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> EGF3 引物

<222> (1)..(58)

<400> 4

tcgaagcgct ggacaagtac gcgtgcaact gcgttgttgg ttacatcggt gaacggtg 58

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> EGF4 引物

<222> (1)..(55)

<400> 5

ttaccgcagt tcccaccact tcaggtcccg gtactggcac cgttcaccga tgtaa 55

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> EGF-sense-Msc I 引物

<222> (1)..(25)

<400> 6

tggccatggc gaactccgac tctga 25

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> EGF-anti-Xba I 引物

<222> (1)..(33)

<400> 7

tctagattac cgcagttccc accacttcag gtc 33

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> Sense-Hind III 引物

<222> (1)..(31)

<400> 8

aagcttagta ccgcactgtc tcagtgtgta c 31

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> Anti-Pst I 引物

<222> (1)..(26)

<400> 9

ctgcagagaa agaggccaaa atcaac 26

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> Check-sense 引物

<222> (1)..(25)

<400> 10

agctcggaat taaccctcac taaag 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> Check-anti 引物

<222> (1)..(25)

<400> 11

ttgtaaaacg acggccagtg aattg 25

<210> 12

<211> 159

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(159)

<400> 12

aacagtgatt cagaatgtcc tctctcacac gatggatact gcctccatga cggcgtgtgt 60

atgtatattg aagcactaga caaatacgca tgcaactgtg tagttggcta tattggtgaa 120

cgatgccagt accgagatct gaaatggtgg gaactgcga 159