利用PCR‑SSCP检测绵羊FTH‑1基因插入缺失多态性的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种利用PCR‑SSCP检测绵羊FTH‑1基因插入缺失多态性的方法及其应用：以包含FTH‑1基因的待测绵羊全基因组DNA为模板，PCR扩增绵羊FTH‑1基因片段，利用SSCP技术对PCR产物进行检测分型；根据电泳结果鉴定绵羊FTH‑1基因第639位插入缺失多态性。该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与绵羊的繁殖性能密切相关的分子遗传标记的方法，以用于绵羊的辅助选择和分子育种，加快绵羊良种繁育速度。

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以绵羊功能基因的插入缺失(indels)作为分子遗传标记，特别涉及小尾寒羊和湖羊绵羊FTH-1基因的4bp插入缺失(indels)多态性及其检测方法。

背景技术

在绵羊育种中，人们期望通过对繁殖性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

分子育种，即分子标记辅助选择育种(Molecular Mark-Assist Selection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。

基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。

插入缺失(Indels，insertion-deletions)标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。由于大多数情况下无法获得祖先序列，所以一般不能判断空位位点上哪些序列发生了插入，哪些序列发生了缺失，故统称为增减。由于这种类型的突变导致了更为严重的序列改变，对基因功能所产生的影响要大于因核苷酸替换而引起的影响。在以单基因为主的分子进化和系统发生研究中，通常忽略了序列的插入和缺失，即不考虑比对后的空位位点。近年来，随着基因组数据的大量涌现，插入和缺失变异开始受到了越来越多的关注。目前，尽管对indels研究还不够深入，但对其变异的研究已经涵盖了其发生频率、大小、分布模式、序列进化模型及应用等各个方面。现有的研究结果表明，基因组中出现的indels多位于非编码序列中，长度大小是可变的，插入和缺失发生的比例在不同类群的生物中不同，并与基因组大小具有相关性。人类基因组中已经确定了415,436个indels多态性位点，长度在1～9989bp之间变化，以平均每7.2kb有一个indels的密度分布在整个基因组中，其中148,000(35.7％)个indels位于已知基因序列中，5,542个indels位于启动子和外显子序列中。它们被分为5种：第一类是单碱基对的插入或缺失；第二类是仅单碱基对的扩增；第三类是2～15bp重复单位的多碱基对的扩增；第四类是转座子插入；第五类是随机DNA序列的插入或缺失。

目前，主要采用几种不同的路线来发现基因组上的多态性：即DNA序列测定方法、等位特异性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些遗传多样性检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的检测方法，但是，其检测费用昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

聚合酶链式反应-单链构象多态(Polymerase Chain Reaction-Single StrandConformation Polymorphism,PCR-SSCP)方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后设计上下游引物，利用PCR扩增目的片段基因，再通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测分型，就能准确地鉴别SNP位点。PCR-SSCP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、操作繁琐的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

FTH-1(Ferritin Heavy Polypeptide1)即铁蛋白重链多肽1，铁蛋白基因FTH-1编码铁蛋白重链亚基。铁蛋白是动植物体内广泛存在的一种可溶性组织蛋白，负责体内铁的存储和维持细胞内铁的平衡，也参与细胞增殖和免疫反应，此外FTH-1会对动物的生长和繁殖也产生影响。因此，FTH-1基因遗传变异或SNP位点在动物生产实践中对繁殖性状、生长发育性状具有重要的作用。关于动物FTH-1基因遗传变异的研究国内外多见于人、牛、鼠、等动物，而对于具有高繁殖力的绵羊未有FTH-1基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前绵羊FTH-1基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与繁殖性状关联的研究成为空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用PCR-SSCP检测绵羊FTH-1基因插入缺失多态性的方法及其应用。利用PCR-SSCP方法针对绵羊FTH-1基因位点上的插入缺失(Indels)多态性进行检测，从而为绵羊的分子标记辅助选择育种提供基础资料，加快中国绵羊的种质资源改良工作。

本发明通过以下技术方案来实现：

针对绵羊FTH-1基因第639位处存在AGAA的插入缺失，本发明提出的利用PCR-SSCP检测绵羊FTH-1基因插入缺失多态性的方法包括以下步骤：

以包含FTH-1基因的待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊FTH-1基因片段，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物；根据电泳结果鉴定绵羊FTH-1基因第639位的插入缺失多态性；

所述的引物对P为：

上游引物：5′-GGTTTCTGAACGAGAGGAG-3′19nt；

下游引物：5′-GATGCCAGCAGTTGTCAC-3′18nt。

所述的PCR扩增反应程序为：

94.0℃预变性5.0min；94.0℃变性30.0s，65.0℃退火20.0s，72.0℃延伸30.0s，34个循环；72.0℃延伸5.0min。

所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳采用质量浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶。

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，FTH-1基因第639位存在AA、AB、BB三种基因型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用PCR-SSCP方法简便、快速、灵敏、精确的检测插入缺失多态性。本发明提供的检测方法为FTH-1基因的插入缺失与性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国绵羊的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的绵羊种群。

本发明利用PCR-SSCP方法对绵羊FTH-1基因第639位点上的缺失突变可能产生编码蛋白构象发生变化的多态性进行检测，当639位点处存在AGAA的缺失时在转录过程相应位置的蛋白质编码氨基酸发生改变，使具有重要生理功能的FTH-1基因所编码蛋白的空间二、三级构型发生变化，以至影响蛋白的生物学功能，本发明对该插入缺失多态性位点进行了基因分型和基因频率分析，以及与绵羊繁殖性状(产羔数)之间进行了关联分析，结果表明该位点能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

附图说明

图1为绵羊血样基因组DNA电泳检测图，其中M为Marker；

图2为绵羊FTH-1基因PCR扩增的236bp片段的电泳图；

图3为绵羊FTH-1基因236bp PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图；

图4为绵羊FTH-1基因639位不同基因型测序峰图，其中，a对应野生型，b对应杂合型，c对应缺失突变型。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。

本发明以FTH-1基因保守序列设计引物扩增FTH-1基因236bp片段，以绵羊基因组为模板，进行PCR扩增，扩增产物经测序后寻找该扩增片段的插入缺失多态；针对发现的插入缺失进行性状关联性分析，并提供其检测方法，使得FTH-1基因的插入缺失多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有优质经济性状的绵羊种群提供依据。

a、绵羊FTH-1基因多态性的检测

1、绵羊血样的采集及处理

分别取小尾寒羊与湖羊血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。本发明采用小尾寒羊与湖羊品种，具体如表1所示。

表1小尾寒羊与湖羊样品来源表

2、血样基因组DNA的提取

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。DNA抽提缓冲液的配制：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌、调pH至8.0，4℃保存备用；

(3)加蛋白酶K 3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化至澄清；

(4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

(5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

(6)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

(9)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

3、DNA池的构建

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从小尾寒羊、湖羊10个浓度为50ng/μL DNA样品中取10μL混合分别构建成品种DNA池。

小尾寒羊与湖羊血样基因组DNA的检测结果见图1，从图中可以看出小尾寒羊与湖羊基因组DNA的质量非常高。

4、PCR扩增

以小尾寒羊与湖羊DNA池为模版，用设计的引物对P进行PCR扩增，PCR总反应体系为25.6μL，见表2；PCR反应程序，见表3。

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应程序

5、PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，可以清楚看到236bp的条带；然后进行PCR产物的SSCP分析。具体造作步骤如下：

(1)电泳装置准备。两玻璃板洗净晾干，放入电泳槽中，用夹子固定。

(2)用1％的琼脂糖凝胶封底。

(3)制胶：制备10％的聚丙烯酰胺凝胶(10％的聚丙烯酰胺凝胶配方：30％丙烯酰胺16.7mL，10×TBE 5.0mL，去离子水28.3mL，10％过硫酸铵300.0μL，TEMED 32.0μL)。

(4)将配制好的聚丙烯酰胺凝胶混匀后迅速向倾斜玻璃板缓慢灌入，避免气泡产生，插入梳子，在室温下放置40min～60min使之凝固，多余胶液回收保存。

(5)上样：将8.0μL PCR产物与8.0μL变性上样缓冲液充分混匀后，在PCR扩增仪中98℃充分变性10min，之后迅速置于-20℃冰箱冷却30min，将16.0μL混合液全部加到凝胶加样孔中。

(6)电泳：在4℃条件下，首先用250V电压电泳20min，转而在120V电压下电泳3h。

(7)固定：将胶卸下，放入70％乙醇中，在摇床上固定15min，用纯水漂洗2次，每次漂洗3min。

(8)染色：加入染色液染色10min，倒掉染色液，用纯水漂洗3次，每次漂洗3min。

(9)显色：加入显色液，至条带清晰时，倒掉显色液，加纯水漂洗3次，每次漂洗3min。

观察结果，进行拍照记录，然后将显色的凝胶回收，置于4℃保存。

根据PPCR-SSCP结果，把表现出不同带型个体(图3)的PCR纯化产物送上海生物工程有限公司进行双向测序。小尾寒羊与湖羊FTH-1基因不同基因型个体目的片段236bp的测序结果如图4所示。

对测序峰图进行分析，其中在同一位点有部分碱基的缺失的是发生了核苷酸突变；位于小尾寒羊与湖羊FTH-1基因的第639位出现了AGAA插入与未插入两种检测结果，即为筛查到的小尾寒羊与湖羊FTH-1基因的indels多态性。

b、小尾寒羊与湖羊FTH-1基因AGAA插入突变多态性的PCR-SSCP检测

1、PCR-SSCP引物设计

针对测序峰图包含的第639位的AGAA缺失突变，利用引物设计软件Primer5.0进行设计引物，在突变位点的上下游区段设计引物，具体引物设计为：

上游引物：5′-GGTTTCTGAACGAGAGGAG-3′19nt；

下游引物：5′-GATGCCAGCAGTTGTCAC-3′18nt。

上述引物能够扩增小尾寒羊与湖羊FTH-1基因236bp目的片段。

2、PCR-SSCP反应条件

PCR产物扩增体系和反应条件分别如表2和表3所述。

3、PCR扩增产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳分型

(1)聚丙烯酰氨凝胶的制备：30％丙烯酰胺16.7mL，10×TBE 5.0mL，去离子水28.3mL，10％过硫酸铵300.0μL，TEMED 32.0μL

(2)电泳条件：在4℃条件下，首先用250V电压电泳20min，转而在120V电压下电泳3h。

(3)上样：将8.0μL PCR产物与8.0μL变性上样缓冲液(95％甲酰胺、10mol/L EDTA、0.05％溴酚兰、0.05％二甲苯青)充分混匀后，在PCR扩增仪中98℃充分变性10min，之后迅速置于-20℃冰箱冷却30min，将16.0μL混合液全部加到凝胶加样孔中。

(4)将胶体进行染色显色

用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像分析系统照相分析，并判型、记录其基因型；

当小尾寒羊与湖羊的FTH-1基因第639位未发生AGAA缺失突变时，其基因型记为AA。由于小尾寒羊与湖羊为2倍体动物，所以当发生模板链AGAA的缺失时，可形成3种不同的基因型，分别为AA、AB、BB，其PCR-SSCP检测的凝胶结果如图3所示：

其中，AA基因型为野生型，具有一个条带；BB基因型为突变型，具有一个条带；AB基因型为杂合子，具有两个条带，且AA基因型的条带的位置与AB基因型靠近上样端的条带位置对应，而BB基因型的条带的位置与AB基因型远离上样端的条带位置对应。如图3所示的凝胶电泳检测结果能够很清楚的判定是否发生了AGAA的缺失，将三种基因型区分开，从而检测其插入缺失多态性。

(4)不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI 377和ABI 3730测序仪对不同基因型个体PCR产物分别进行正反双向测序；同时，进行序列分析，结果表明杂合子AB基因型个体其第639位的测序图表示为一条模板链AGAA的插入而另外一条缺失AGAA，如图4b；而BB基因型个体其第639位的测序图表示为两条模板链AGAA的缺失，如图4c所示；AA基因型个体其第639位的测序图表示为两条模板链都有AGAA的插入，如图4a所示。

c、不同绵羊群体的FTH-1基因第639位的插入缺失多态性作为分子标记的应用

1、群体核苷酸多态性的检测

利用上述的插入缺失多态性检测方法对小尾寒羊与湖羊共计365份DNA样品，进行插入缺失多态性的鉴定；统计其插入缺失位点的频率分布情况。

2、插入缺失位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+……+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；统计结果见表4。

表4小尾寒羊与湖羊FTH-1基因第639位插入缺失基因频率分布表

3、基因效应的关联分析

利用SAS(9.2)软件分析基因位点与繁殖性状(产羔数)的相关性。先对数据进行描述性统计分析，确定是否存在离群值，根据数据特征，利用t分析、方差分析或是多元线性模型分析基因型效应。在数据处理中，根据影响产羔数因素不同，考虑到环境效应、年龄、基因型效应及相关的互作效应，采用固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中：Y_ijk为个体表型记录；μ为群体均值；G_j为各位点的基因型效应；E_ijk为随机误差。

表5 FTH-1基因插入缺失多态性与绵羊繁殖性状之间的方差分析

参见表5，结果表明，在绵羊FTH-1基因组序列的第639位点上的不同基因型与绵羊产羔数关联分析表明，其中，AA、AB基因型个体的产羔数高于BB基因型。

核苷酸序列表

<110> 兰州大学

<120> 利用PCR-SSCP检测绵羊FTH-1基因插入缺失多态性的方法及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggtttctgaa cgagaggag 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gatgccagca gttgtcac 18