一种减少大曲用量，提升醋品质的大曲强化方法

摘要

本发明属于生物材料及其应用技术领域，为了解决纯大曲酿醋虽然风味好,但糖化能力和酒化能力低，出醋率低的问题，提供了一种减少大曲用量，提升醋品质的大曲强化方法。包括高产纤维素酶和淀粉酶的真菌菌株的分离：单菌株培养，产黄青霉和扣囊复膜孢酵母共同强化大曲，进行醋酸发酵。无需添加外源催化剂，减少大曲用量，提高原料利用率。操作简便，既保持了山西传统老陈醋独特的风味和品质，又提高了出品率，改善醋品质，降低了成本，增加了效益。其应用推广，必将带来山西传统老陈醋工艺的变革，助力山西老陈醋产业的发展，产生相应的经济效益和社会效益，其应用推广前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于生物材料及其应用技术领域，具体涉及一种减少大曲用量，提升醋品质的大曲强化方法。

背景技术

山西是中国最大的食醋生产和消费大省，食醋产量已达70万吨，占全国食醋总量的1/8。山西老陈醋为中国四大名醋之首，其传统酿造工艺的一大特点是以曲代粮，大曲用量至少在40%以上。大曲既是糖化剂，也是发酵剂。山西老陈醋专用大曲以大麦、豌豆为原料经微生物自然发酵而制成，其生产周期约为21天，大曲的品质决定了醋的产量和质量，是酿醋的核心材料，是“醋之灵魂”，大曲和由80多道工序组成的酿造工艺共同赋予了山西老陈醋作为“天下第一醋”的其他食醋无法比拟的诸多优良品质。纯大曲酿醋虽然风味好,但糖化能力和酒化能力低，出醋率低。

山西老陈醋国家标准对酸度的要求越来越高，2014年10月1日颁布并开始执行的山西老陈醋国家标准总酸含量由原来最低的4.5g/L提高到6g/L，要求大曲用量加到62.5%以上，这样才能生产出pH为3.6~3.9，最终总酸度为6度以上的食醋，从而确保山西老陈醋不用添加任何防腐剂，可长时间保存不坏，因而取消了保质期。山西老陈醋制曲约需21天，从原料到淋出醋也需要20多天，再经至少1年的陈酿，因此生产周期较长，以曲代粮更加剧了其成本代价。如何应用现代生物技术发掘、优化、规范山西老陈醋传统工艺，已被提到议事日程。

为了改造山西老陈醋落后的传统生产工艺，山西四眼井酿造实业有限公司将酶工程技术引入了山西老陈醋的先醪后固工艺，在原料液化阶段添加淀粉酶，将原料中的长链淀粉转化为短链淀粉；在糖化阶段添加糖化酶和红曲，使原料进一步转化为葡萄糖，加一定量的红曲为了保持传统山西老陈醋的风味，促进糖化过程；在酒化阶段添加40~50%的大曲和固定化酵母液。这些技术已申请了发明专利《采用多菌种生产山西老陈醋的方法》（专利号：ZL200610027012.9）和《前醪后固工艺生产山西老陈醋的方法及设备》（专利号：ZL200610048373.1）。

上述发明将酶工程技术引入山西老陈醋发酵工艺，减少了大曲用量，提高了原料利用率，降低了成本，增加了效益，但操作过程繁琐，淀粉酶、糖化酶和红曲、大曲分别在不同的阶段加入，操作繁琐，特别是大曲的加入比较晚，作为山西老陈醋酿造过程中的糖化剂，限制了其中多种微生物及其酶的作用。上述专利在添加大曲之前，原料已被大量转化成可发酵糖类位置，接入大曲后，各种微生物迅速活化，特别是酵母菌快速发酵，发酵过猛使品温迅速升高，酒度快速上升，限制了大量微生物的代谢，影响了各种香气成分和功能性成分的释放和积累。山西老陈醋味道醇厚，食之绵、酸、香、甜、鲜，这些品质除了用料考究外，主要是由于大曲中丰富的微生物区系作用所致，所以山西老陈醋在整个酿造过程中完全依靠微生物的自然发酵，不会有任何化学催化剂的介入。

发明内容

本发明为了解决纯大曲酿醋虽然风味好,但糖化能力和酒化能力低，出醋率低的问题，提供了一种减少大曲用量，提升醋品质的大曲强化方法。

本发明由如下技术方案实现：一种减少大曲用量，提升醋品质的大曲强化方法，包括如下步骤：

（1）菌种分离：从山西老陈醋专用大曲中分离筛选出高产纤维素酶和淀粉酶的真菌菌株，具体分离方法为：采集传统山西老陈醋工艺发酵的酒精发酵24h的酒醅10g于盛有90ml无菌水的三角瓶中，并放入无菌玻璃珠震摇20min，制备菌悬液；移液枪吸取1ml菌悬液于装有9ml无菌水的试管中，振荡1～2min，使其充分混匀，依次制成浓度为10^-1～10^-7梯度的菌悬液；吸取并涂布100μl各稀释浓度菌悬液于Martin培养基平板，每个稀释度做2个平行，静置10min，30℃培养3d；选择菌落特征明显的单菌落挑取霉菌，用Martin平板纯化2~3次，直至获得纯种菌种，将纯种用PDA培养基斜面保藏，备用，其中Martin培养基配方为：孟加拉红（1mg/ml）0.33ml、琼酯粉1.2g、葡萄糖7g、蛋白胨0.5g、KH₂PO₄·3H₂O>4·7H₂O0.05g、水100ml，自然pH，使用前再加入预先灭菌的2%的去氧胆酸钠溶液2ml和0.33ml链霉素溶液（1万单位/mL），112℃灭菌25min备用；经过了两批次的分离纯化实验，获得高产纤维素酶菌株，通过镜检、菌落形态观察、rRNA基因D1/D2区序列分析鉴定，最终鉴定为：产黄青霉（Penicillium>)M4，扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis>) M8；

（2）制备产黄青霉（Penicillium>)M4和扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis>) M8麸曲：将麸皮、稻壳、水以质量之比为20:1:16混合搅拌均匀，蒸20 min，取出后趁热打散，冷却到30℃；分别接种等体积浓度为10⁷个/ml的M4、M8菌株的孢子悬液或菌悬液，搅拌均匀，30℃培养12～15>

（3）醋酸发酵：采用步骤（2）制备的M4和M8麸曲强化大曲，进行醋酸发酵，发酵配料时，大曲与麸曲的总添加量为发酵所用主料的40%，其中大曲占主料的25.1%，M4麸曲的添加量为主料的8.09%，M8麸曲的添加量为主料的6.81%，安琪酵母添加量为主料的0.06%，加水量为主料的3倍；主料按照传统老陈醋工艺先进行蒸料处理，然后25℃发酵7天，稀醪继续醋酸固态发酵，填充辅料稻壳和麸皮，稻壳、麸皮与主料之比为15:20:12；然后继续25℃发酵16天，醋酸固态发酵完毕后用2倍于醋醅总体积的水进行淋醋，头醋用总水量的70%淋出，其余30%的水用于下次淋醋，然后合并醋液。

所述发酵所用的主料为玉米、质量比为3:7的玉米和高粱混合料或者高粱。所述淋醋用水中加入5%的食盐。

所述产黄青霉（Penicillium>)M4在麦芽汁琼脂培养基上生长快，25℃黑暗条件下培养7天，菌落直径32-40mm，质地绒状；产孢结构大量形成，孢子面深灰绿色；菌落背面浅褐色，无水溶性色素；分生孢子梗特化不明显，宽2.5-4.0µm，壁光滑；帚状枝3-4轮生，松散，瓶梗7.0-11.7×2.2-3.0µm；分生孢子近球形、宽椭圆形，浅绿色，表面光滑，2.8-4.0µm，未见有性孢子。PDA培养基上，菌落成毡状，隆起，菌丝致密。菌落初期为白色，渐变为黛绿色。菌丝体、分生孢子梗均有横隔；帚状体单轮或多次分枝，对称或不对称；无足细胞；所述产黄青霉（Penicillium>)M4保藏编号为：CGMCC NO. 12375，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是201６年４月２８日。

所述扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis>)M8在麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞球形、卵形、腊肠形，大小为（4.0-7.0）×（3.6-7.0）µm；麦芽汁琼脂斜面25℃培养一个月，菌落坚韧状，白色，表面绒毛状，不反光，边缘须状；玉米粉琼脂Dalmau平板培养，产生真菌丝；在PDA培养基上菌落中央凸起，呈放射状、草帽状；颜色为白色，表面呈皮膜状，菌落直径19.3-19.8mm；在固体麦芽汁培养基上呈酯泥状或皮膜状，呈白色；在液体麦芽汁培养基中培养1d，产白色醭；具有真菌丝，有的有分枝和横隔；节孢子单生或链生，有方形、长筒形或椭圆形，两端圆钝；所述扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis>)M8保藏编号为：CGMCC NO. 12408，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是201６年４月２８日。

本发明所述M4和M8菌株分离自传统的山西老陈醋专用大曲中，经中科院微生物研究所鉴定为：产黄青霉（Penicillium>)M4，扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis>) M8。

山西老陈醋新国标颁布和实施（2014年10月1日）之前，一般醋厂大曲用量在50%左右。本发明对当以玉米为主料时的大曲用量进行了单因素试验，以酒精度为考察指标，大曲添加量并非越高越好，40%为最佳，通过麸曲强化，大曲用量仅为20.08%，大大减少了大曲用量，实验结果表明还可减少高粱用量，提高原料利用率，节约了生产成本。食醋中的总酸含量、不挥发酸含量、可溶性固形物含量、氨基态氮含量以及总酯含量均比大曲单独发酵提高，改善醋品质。当以高粱为主料时，未经熏醅和陈酿工艺，在实验室条件下，模拟某醋厂实际生产工艺，酸度便可达到6g/L以上，节约生产成本。

本发明无需添加外源催化剂，从微生物学角度对传统酿醋工艺进行改良，从山西老陈醋专用大曲中分离并筛选出高产纤维素酶和淀粉酶的真菌菌株，制作麸曲，强化大曲，达到与外源添加淀粉酶和糖化酶一样的功效，减少大曲用量，提高原料利用率，使新醋中的总酸、不挥发酸、还原糖、可溶性固形物、氨基态氮、总酯的含量提高。本发明操作简便，只需制备M4和M8麸曲，与大曲和安琪酵母粉一并加入主料，无需分段添加。既保持了山西传统老陈醋独特的风味和品质，又提高了出品率，降低了成本，增加了效益。其应用推广，必将带来山西传统老陈醋工艺的变革，助力山西老陈醋产业的发展，产生相应的经济效益和社会效益，其应用推广前景广阔。

附图说明

图1为不同料水比对酒精发酵的影响；图2为大曲添加量对酒度的影响；图3为大曲与麸曲添加比例对酒度的影响；图4为各菌株强化大曲酒精共发酵；图5为M8麸曲、M4麸曲和大曲添加比例对酒度的影响响应曲面图；图6为M8麸曲、M4麸曲和大曲添加比例对酒度的影响等值曲线图；图7为M4 在PDA培养基上菌落特征和个体形态；图8为M8在PDA培养基和麦芽汁培养基上的菌落特征；图9为M8在麦芽汁培养基上个体形态。

具体实施方式

实施例1：一种减少大曲用量，提升醋品质的大曲强化方法，包括如下步骤：

（1）菌种分离：从山西老陈醋专用大曲中分离筛选出高产纤维素酶和淀粉酶的真菌菌株，具体分离方法为：采集传统山西老陈醋工艺发酵的酒精发酵24h的酒醅10g于盛有90ml无菌水的三角瓶中，并放入无菌玻璃珠震摇20min，制备菌悬液；移液枪吸取1ml菌悬液于装有9ml无菌水的试管中，振荡1～2min，使其充分混匀，依次制成浓度为10^-1～10^-7梯度的菌悬液；吸取并涂布100μl各稀释浓度菌悬液于Martin培养基平板，每个稀释度做2个平行，静置10min，30℃培养3d；选择菌落特征明显的单菌落挑取霉菌，用Martin平板纯化2~3次，直至获得纯种菌种，将纯种用PDA培养基斜面保藏，备用，其中Martin培养基配方为：孟加拉红（1mg/ml）0.33ml、琼酯粉1.2g、葡萄糖7g、蛋白胨0.5g、KH₂PO₄·3H₂O>4·7H₂O0.05g、水100ml，自然pH，使用前再加入预先灭菌的2%的去氧胆酸钠溶液2ml和0.33ml链霉素溶液（1万单位/mL），112℃灭菌25min备用；经过了两批次的分离纯化实验，获得高产纤维素酶菌株，M4、M5、M6和M8为分离并筛选到的高产纤维素酶（M4）和糖化酶（M5、M6、M8）菌株；M4在所有产纤维素酶菌株中，产纤维素酶的能力最强，在30℃和25℃的纤维素酶酶活分别为57.90±2.65>

30℃时，M6、M5、M8、M15、M2的糖化酶酶活大于对照菌株M0（AS3.4309），糖化酶酶活分别为3582.49±30.67 U/mL（M6），1326.53±18.56U/mL（M5）和1108.35±14.21U/mL（M8）、1069.08±20.41 U/mL（M15）﹥842.17±20.44 U/mL（M2），M0为754.90±21.82 U/mL。M4的糖化酶酶活为658.90±22.40 U/mL，略低于M0。M8还具有生成乙醇的能力。

（2）制备产黄青霉（Penicillium>)M4和扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis>) M8麸曲：将麸皮、稻壳、水以质量之比为20:1:16混合搅拌均匀，蒸20 min，取出后趁热打散，冷却到30℃；分别接种等体积浓度为10⁷个/ml的M4、M8菌株的孢子悬液或菌悬液，搅拌均匀，30℃培养12～15>

（3）醋酸发酵：采用步骤（2）制备的M4和M8麸曲强化大曲，进行醋酸发酵，发酵配料时，大曲与麸曲的总添加量为发酵所用主料的40%，其中大曲占主料的25.1%，M4麸曲的添加量为主料的8.09%，M8麸曲的添加量为主料的6.81%，安琪酵母添加量为主料的0.06%，加水量为主料的3倍；主料按照传统老陈醋工艺先进行蒸料处理，然后25℃发酵7天，稀醪继续醋酸固态发酵，填充辅料稻壳和麸皮，稻壳、麸皮与主料之比为15:20:12；然后继续25℃发酵16天，醋酸固态发酵完毕后用2倍于醋醅总体积的水进行淋醋，头醋用总水量的70%淋出，其余30%的水用于下次淋醋，然后合并醋液。

所述发酵所用的主料为玉米；所述淋醋用水中加入5%的食盐。

所述产黄青霉（Penicillium>)M4在麦芽汁琼脂培养基上生长快，25℃黑暗条件下培养7天，菌落直径32-40mm，质地绒状；产孢结构大量形成，孢子面深灰绿色；菌落背面浅褐色，无水溶性色素；分生孢子梗特化不明显，宽2.5-4.0µm，壁光滑；帚状枝3-4轮生，松散，瓶梗7.0-11.7×2.2-3.0µm；分生孢子近球形、宽椭圆形，浅绿色，表面光滑，2.8-4.0µm，未见有性孢子。PDA培养基上，菌落成毡状，隆起，菌丝致密。菌落初期为白色，渐变为黛绿色。菌丝体、分生孢子梗均有横隔；帚状体单轮或多次分枝，对称或不对称；无足细胞。

所述扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis>)M8在麦芽汁液体培养基中25℃培养三天，细胞球形、卵形、腊肠形，大小为（4.0-7.0）×（3.6-7.0）µm；麦芽汁琼脂斜面25℃培养一个月，菌落坚韧状，白色，表面绒毛状，不反光，边缘须状；玉米粉琼脂Dalmau平板培养，产生真菌丝；在PDA培养基上菌落中央凸起，呈放射状、草帽状；颜色为白色，表面呈皮膜状，菌落直径19.3-19.8mm；在固体麦芽汁培养基上呈酯泥状或皮膜状，呈白色；在液体麦芽汁培养基中培养1d，产白色醭；具有真菌丝，有的有分枝和横隔；节孢子单生或链生，有方形、长筒形或椭圆形，两端圆钝。

实施例2：一种减少大曲用量，提升醋品质的大曲强化方法，醋酸发酵时，选用的主料为质量比为3:7的玉米和高粱混合料，其余方法同实施例1所述制备方法。

实施例3：一种减少大曲用量，提升醋品质的大曲强化方法，醋酸发酵时，选用的主料为高粱，其余方法同实施例1所述制备方法。

酒精发酵结束后，玉米为主料时酒醪酒度达到11.2%，质量比为3：7的玉米和高粱为主料时酒度达11.8%，高粱为主料时酒度为12.2%，为醋化搅拌提供了良好的酒度，而一般醋厂酒度为9%~11%之间。酒度提高，说明原料利用率提高，经测定发酵结束后醋糟淀粉仍含量很高，因此酒化过程中原料利用率提高，不会造成后续醋酸发酵过程中淀粉不足的问题。酒精发酵阶段原料利用率分别为55.28%（玉米）、57.76%（玉米+高粱）、59.98%（高粱），各原料的总利用率分别为83.42%（玉米粉)、玉米粉+高粱粉(84.63%)、高粱粉(85.39%)。

实验例1：制作各试验菌株麸曲，确定最佳的料水比

M0作为本研究的对照菌株，为山西老陈醋生产过程中快曲菌种AS。3.34309，研究表明，M0不产纤维素酶。

各试验菌株麸曲的制备：麸皮、稻壳、水的质量之比为20:1:16，拌匀，蒸20min，取出后趁热打散，冷却到30℃。分别接种筛选出的等体积的M0、M2、M4、M5、M6、M8、M15各菌株的孢子悬液或菌悬液（10⁷个/mL），搅拌均匀，30℃培养12～15h长出白色菌丝，然后扣瓶培养2～5h，至表面布满白色菌丝或产生少量孢子时取出备用。

廖液浓度对酒精发酵有很大的影响，根据某醋厂生产工艺，设定三个料水比梯度1︰3、1︰4和1︰5。按某醋厂酒精发酵工艺操作如下：称取80g玉米粉于50ml烧杯中，加48ml水，混匀，室温润料12h，蒸1h，超净工作台中鼓风冷却，无菌操作，将蒸熟的玉米粉、酵母0.05g、大曲14g、麸曲15.5g加入装有240ml、320ml和400ml无菌蒸馏水的500ml三角瓶中，搅拌均匀后，用八层纱布封口，放入25℃恒温生化培养箱中培养。前3天每天搅拌一次，第3天搅拌完后用双层塑料布封口，25℃继续培养4天，第8天测定酒精度。

不同料水比发酵条件下接种各菌株的酒精发酵酒度见图1，结果显示：料水比为1︰3时，发酵廖液的酒度最高，且接种M8、M6和M4的发酵酒度比M0高，有显著性差异。加水量较高时，底物浓度较低，不利于菌株的生长和代谢。同一料水比对各菌株的影响不同。为了提高原料的利用率和产量，必须选择合适的料水比，为微生物的生长代谢和产酶提供最有利的环境。根据刘忠义的研究结果发现料水比低于1︰3时，发酵廖液太稠，不利用酒精发酒，故选择最佳的料水比为1︰3，这与其论文中的研究结果相吻合。

实验例2：大曲添加量的确定

设定大曲的添加量为20%、30%、40%、50%，料水比为1︰3，玉米粉80g、酵母0.05g，不加麸曲，发酵温度25℃，发酵时间7d，第8天测定酒精度，操作步骤如实验例1。

大曲是酒精发酵阶段主要的糖化发酵剂，添加大曲不但可以提高出酒率还能改善醋的风味，但大曲制作成本高、生产周期长，且在酒精发酵过程中大曲添加过少使得发酵时间延长，大曲添加过量又会造成浪费且生产成本增加，因此，通过试验确定大曲添加量就显得尤为重要，既可以最大限度的利用原料发酵，又可以减少大曲的用量，降低成本。实验结果见图2，从实验结果来看，酒度随着大曲添加量的增加先升高后降低，在大曲添加量为40%时达到最高，为10.1%（v/v）。大曲添加量较少时使得酒精发酵不完全或发酵周期延长，添加量过高时不利于微生物生长代谢，故大曲的最佳添加量为40%。

实验例3：大曲与麸曲添加比例的确定

本试验的目的之一在于用麸曲来代替部分大曲，减少大曲的用量，提高原料利用率和改善醋的品质。某醋厂现生产工艺中，大曲与麸曲的添加量比例约为1︰1，本发明在接种总量相同的情况下，用M0麸曲来代替部分大曲，设定大曲与麸曲的添加量比例为2︰1、1︰1、1︰2、1︰3四个梯度，料水比1︰3，其它同实验例1。

为了降低成本、减少大曲的用量，本试验试通过增加麸曲的添加量来减少大曲的用量。以M0麸曲为代表，大曲和麸曲的总添加量为原料的40%（32g）进行研究，试验结果见图3。由图可知，大曲和麸曲的添加量为2︰1时，酒精发酵的酒度接近于只加40%大曲的酒精发酵酒度，差异不显著，并且经济，故设定以下试验中大曲与麸曲的添加比例为2︰1。

实验例4：大曲与麸曲最佳比例下的酒精发酵

将各菌株按实施例1所述方法制成麸曲。按以下添加量进行酒精发酵，玉米粉80g、水240ml、酵母0.05g、大曲21.3g、麸曲10.7g，大曲与麸曲比例2︰1（总添加量为原料的40%），发酵温度25℃，发酵时间7d，第8天测定酒精度，操作步骤如实验例1。

用各菌株麸曲与大曲共发酵。测得各酒度如图4所示。可以看出M8、M6和M4的酒度最高。除M8外，其它5株菌株的酒精发酵酒度高低与其糖化酶酶活力大小同等。M8酒度最高，分析原因可能是菌株本身就能利用葡萄糖生成酒精，且其产糖化酶活力较高，使葡萄糖转化率提高。产糖化酶能力分析结果表明M6菌株产糖化酶能力最高；M4产糖化酶能力也高于M0。三株菌中由于M4产纤维素酶能力最强，而M6不产纤维素酶，故选取M8和M4用作混合发酵菌株。

表1 酒度较高菌株酒精发酵酒的质量指标

从表1可以看出，除总酸外，大曲单独发酵酒液中的其它指标值均低于大曲＋M8共发酵的指标；除总酯和氨基态氮外，大曲＋M0的其它指标值均高于大曲＋M4、大曲＋M6和大曲＋M8的；大曲＋M6的氨基态氮含量最高。因此，下一步探讨将M8和M4制成麸曲，与大曲按一定比例添加到酒精发酵中，检验提高酒度的同时产出的醋的质量。

大曲、大曲＋M0、大曲＋M4、大曲＋M6和大曲＋M8酒精发酵阶段的原料利用率分别为21.24%、46.52%、46.94%、50.07%和53.05%，分别提高了25.28%（M0）、25.70%（M4）、28.83%（M6）、31.81%（M8）。按添加比例为2︰1时，至少可节约37.25%的大曲用量。

实验例5：大曲与M4、M8最佳添加比例的确定

将M4和M8分别制成麸曲，与大曲按一定比例接种于酒精发酵中，由Minitab16混料回归设计确定三者的添加比例，操作步骤按实验例1，玉米粉80g、水240ml、酵母0.05g，曲总量32g，发酵温度25℃，发酵时间7d，第8天测定酒精度。

大曲与麸曲最佳添加比例2︰1，故采用极端顶点设计法，设置大曲上限为1，下限为0.5，M8麸曲和M4麸曲的上限为0.4，下限为0.1。大曲与麸曲的总添加量为原料的40%。利用Minitab 16 实现混料回归设计，确定M8麸曲（X₁）、M4麸曲（X₂）和大曲（X₃）添加量，试验结果如表2所示。

表2 M8麸曲、M4麸曲、大曲Minitab 16混料回归设计酒精发酵试验结果

由表2可得，大曲添加量为0.5～0.6时，酒度较高。M8麸曲的添加量比M4麸曲对酒度的影响大。

混料设计可根据各添加物的三元等值线观察各添加物添加量对酒度的影响。图5为M8麸曲、M4麸曲和大曲不同添加比例条件下酒度的响应曲面，从图可以看出，三种添加物按一定比例接种于酒精发酵，酒度比单独接种M8麸曲、M4麸曲和大曲的酒度高。图6为M8麸曲、M4麸曲和大曲不同添加比例下酒度的等值曲线，从图中可以看出M8麸曲、M4麸曲和大曲之间的交互作用比较明显。M8麸曲和M4麸曲在较低添加比例时对酒精发酵的酒度影响较大。这可能因为大曲中微生物种类较多，添加过量时，由于底物浓度的限制不利于微生物发酵，或大量的外来物种改变了大曲中微生物种群结构，抑制了某些微生物的生长繁殖，不利于发酵；但加入少量M8麸曲或M4麸曲可对发酵起到促进作用。酒精发酵的酒度随着大曲添加量的增加先增大后减小；添加少量的M8麸曲或M4麸曲有利于酒度的提高。

表3 回归方程的方差分析结果

Table 3 Variance analysis of regression modle equation of alcohol content

从回归方程的方差分析结果来看，P﹤0.01，表明试验所选用模型有高度的显著性，故可用此模型来确定M8麸曲（X₁）、M4麸曲（X₂）和大曲（X₃）的添加比例。从回归方程模型可得，二次项的系数均为正数，表明M8麸曲和M4麸曲、M8麸曲和大曲、M4麸曲和大曲的交互作用较明显，且二次项回归系数绝对值大小为X₁X₃﹥X₂X₃﹥X₁X₂。说明在酒精发酵时，M8麸曲和大曲的添加比例对酒度的影响最大，M4麸曲和大曲的添加比例对酒度的影响次之，M8麸曲和M4麸曲的添加比例对酒度影响最小。

利用Minitab 16软件对表2试验数据进行回归拟合分析，得一次交互回归方程模型为：酒度＝－63.31X₁－58.7X₂－7.73X₃＋72.95X₁X₂＋157.19X₁X₃＋153.56X₂X₃。

利用线性规划求解上述方程，约束条件为：X₁＋X₂＋X₃＝1.0；0≤X₁≤0.1；0≤X₂≤0.1；0≤X₃≤0.5；求解得出X₁＝0.170249，X₂＝0.202217，X₃＝0.627534，

即在80g原料中，按40%的比例添加曲共32g，其中大曲20.08g、M8麸曲5.45g、M4麸曲6.47g时，酒度的三元二次方程能取得最大值。

即发酵配料时，大曲与麸曲的总添加量为主料的40%，其中大曲占主料的25.1%，M8麸曲添加量为主料的6.81%，M4麸曲的添加量为主料的8.09%，安琪酵母添加量为主料的0.06%，加水量为主料的3倍，可获得最大酒度。

实验例6：大曲与M4、M8最佳添加比例下的发酵试验

以上酒精发酵中原料均为玉米粉，但传统山西老陈醋生产原料多为高粱，故分别以玉米粉、玉米粉和高粱粉、高粱粉为原料做发酵试验。玉米粉和高粱粉比例由某醋厂得。玉米粉80g、水240ml、酵母0.05g、大曲20.08g、M4麸曲6.47g、M8麸曲5.45g，发酵温度25℃，发酵时间7d，第8天测定酒精度。剩余的廖液进行醋酸发酵，主料、稻壳和麸皮按12︰15︰20比例于8 L的桶内混匀，接入原料重量1/6的发酵24 h的醋醅，加盖，25℃培养。待温度升到40℃左右时进行翻醅，每天翻醅1～2次，发酵16d。加入原料5%的食盐和2倍醋醅总重的水，泡24 h，淋醋（分两次进行，第一次加入7成泡12h，淋出头醋，第二次加3成水泡12h，再淋出）。将两次淋出的醋进行混合，测定醋的质量指标。因实验室条件限制，不进行熏培。大曲与M4、M8最佳添加比例下醋酸发酵及其质量指标结果见表4。

表4 醪液酒的质量指标

在上述最佳添加比例下，以不同原料进行发酵，酒精发酵的酒度均大于11%（v/v），与三元一次方程所预测的值相吻合。同等条件下单独用大曲发酵，酒精度分别为7.7%（v/v）、7.9%（v/v）和8.2%（v/v）。可见，当用M8麸曲和M4麸曲代替部分大曲时，不仅没使酒精度降低，反而还会升高，除总酯外，其它各项指标值均随着高粱用量的增加而增大。

表5不同主料强化大曲发酵与大曲发酵醋质量指标比较

注：除总酯单位为g/L外，其他指标单位为g/100mL；A表示大曲单独发酵，B表示M8+M4+大曲共发酵；玉米粉和高粱粉按3:7配料。

由表5可知，不同主料强化大曲发酵醋中的总酸、不挥发酸、还原糖、可溶性固形物、氨基态氮以及总酯的含量均高于大曲单独发酵；随着高粱用量的增加，除总酯外，各项指标值也相应增大，以玉米粉为原料的发酵醋中的总酯含量最高。感官评价时，随着高粱用量的增加，新淋醋闻起来越香，且随着高粱用量的增加，上述各项指标值也相应增加，说明了山西老陈醋传统酿造技术使用高粱为主料的工艺精华。当以玉米粉为原料时，强化大曲发酵醋的各项指标值已非常接近于玉米粉和高粱粉大曲发酵醋的品质，进一步说明了M8+M4+大曲发酵不仅可降低老陈醋酿造过程中的大曲用量，还可降低高粱用量。本试验所取醋样为白醋醅浸泡24 h，用纱布过滤，滤液静置24 h，取上清液，即为醋样。所以可溶性固形物含量可能比实际要高。由于试验条件限制，未进行熏培使得总酯和一些香气物质较少。

原料利用率检测显示：每80g原料中，大曲的添加量仅为20.08g，减少了37.25%（(32-20.08)/32×100%）的用量，降低了生产成本。且同等发酵条件下，当以玉米为原料进行发酵时，大曲+M8麸曲+M4麸曲发酵后的酒度11.2%（v/v）>大曲+M8麸曲10.9%（v/v）>大曲+M4麸曲10.3%（v/v）>大曲+M0麸曲8.4%（v/v）。酒精发酵阶段，各原料的利用率分别为55.28%（玉米粉）、57.76%（玉米粉+高粱粉）、59.98%（高粱粉），高粱粉的原料率比玉米粉的利用率高4.70%。用各原料发酵的总原料利用率分别为玉米粉83.42%、玉米粉+高粱粉84.63%、高粱粉85.39%。

以上实验结果显示：大曲添加量为40%，料水比为1:3时，酒精发酵醪酒度最高。为减少大曲用量，用麸曲替代部分大曲，大曲与麸曲（AS.3.4309)之比为2:1，添加总量为40%时，酒度最高。将M2、M4、M5、M6、M8、M15制备成麸曲，与大曲按1:2比例配合（总添加量为40%），料水比1:3进行发酵，结果表明M4、M6、M8强化大曲酒精发酵醪中的酒度显著高于其他菌株。为了提高原料利用率，考虑到M4和M8可产生纤维素酶，而M6不能，故选取M4和M8做双菌种强化研究。Minitab 16 混料回归设计实验结果表明，大曲添加量为主料的25.1%，M8麸曲添加量为主料的6.81%，M4麸曲的添加量为主料的8.09%时，酒精发酵醪的酒度可超过11%（V/V)。大曲用量由40%降低至25.1%。分别以玉米、玉米和高粱（3:7），高粱为主料，以大曲单独发酵为对照进行验证试验，结果表明，醋液中总酸、不挥发酸、还原糖、可溶性固形物、氨基态氮、总酯的含量均高于对照。随着高粱用量的增加，除总酯含量外，各指标值均有上升趋势，原料总利用率显著提高，因此M4和M8共同强化大曲，在食醋酿造过程中可减少大曲和高粱用量，提高原料利用率，改善醋品质，使成本进一步降低。

上述实验例中所述酒度的测定方法为：量取100ml发酵液于装有5～6粒沸石的蒸馏瓶中，用150ml水润洗量筒2～3次，洗液一并加入蒸馏瓶中，加热至沸，转为小火，用干燥量筒收集100ml蒸馏液。将酒度计和温度计同时放入量筒中，保持5min左右，待酒度计和温度计度数稳定后，记录度数，再查表校正为20℃时的酒精度。

上述实验例中所述质量指标的测定方法为：醋液中各指标测定均按照国标规定方法进行，其中总酸的测定按照GB/T 5009.41-2003；不挥发性酸的测定按照GB18187-2000；还原糖的测定按照GB19777-2005；氨基态氮按照GB/T5009.39-1996，总酯含量按照GB19777-2005方法测定。

上述实验例中原料利用率的测定方法为：称取总料5g（酒糟和醋糟10g）于250ml三角瓶中，加入80ml蒸馏水和20ml 20%的盐酸，摇匀，接上冷凝管（约1m）,沸水浴30min，立即冷却，用脱酯棉过滤，滤液定容至500ml。取20.0ml滤液测定还原糖含量，测定方法按照GB19777-2005方法测定。酒糟和醋糟在80℃烘干。总料按发酵原料、辅料和填充料的比例配制。

原料利用率（%）（酒精发酵）=（总料还原糖含量-酒糟还原糖含量）/总料还原糖含量×100%；

总原料利用率（%）=（总料还原糖含量-醋糟还原糖含量）/总料还原糖含量×100%。

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