豚鼠补体C1q‑B单克隆抗体60G4的制备与应用

摘要

本发明涉及一种豚鼠补体C1q‑B单克隆抗体60G4(60G4单抗)。60G4单抗是通过用大肠杆菌的工程菌重组表达豚鼠的补体C1q‑B，再以表达的C1q‑B免疫小鼠，将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选后获得了抗体分泌性能良好的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞分泌的60G4单抗对豚鼠补体C1q具有良好的亲和力。应用所述单克隆抗体60G4对豚鼠补体C1q‑B 60G4的检测技术及方法具有良好的特异性、敏感性、可操作性，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及以分子克隆手段表达的豚鼠补体C1q-B为免疫原免疫小鼠，获得杂交瘤细胞株60G4及其产生的单克隆抗体。60G4单抗与豚鼠补体C1q具有高度亲和力，可以应用于对豚鼠补体C1q的检测中，本发明主要对60G4单抗在补体结合酶联免疫吸附试验(CF-ELISA)中的应用进行了实例验证。本发明属生物制品领域。

技术背景

单克隆抗体技术是1975年英国科学家Mi l stein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学奖。单克隆抗体具有高度的特异性，定向性。通过单克隆抗体可以获得高特异，准确定位的免疫学检测技术。本专利通过采用原核表达的豚鼠补体C1q-B免疫小鼠，取小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌抗豚鼠补体C1q-B单克隆抗体的杂交瘤细胞。从而获得可用于检测豚鼠补体C1q的单克隆抗体。

目前，豚鼠补体是补体结合类试验的关键试剂。补体结合类试验在免疫学检测中有广泛应用，包括传统的补体结合试验，新型CF-ELISA技术等。单克隆抗体具有高度的反应特异性，补体结合试验也被公认为是一种特异性较高的检测特异性抗原抗体反应的技术。本发明可将2者结合，有利于获得高特异性的检测结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和力及高特异性的抗豚鼠补体C1q单克隆抗体，及其在免疫检测、补体结合实验方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株60G4已于2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为(CGMCC N0.11186)。

本发明还提供了一种高亲和力高特异性的结补体的C1q单克隆抗体60G4，由上述杂交瘤细胞株产生。

另外，上述本发明提供的单克隆抗体或所述杂交瘤细胞株在制备用于检测或辅助检测豚鼠补体C1q-B的免疫检测工具时的应用，也属于本发明的保护范围。其中，所述免疫检测工具具体为试剂、试剂盒、芯片或试纸。

上述本发明提供的单克隆抗体在制备用于检测豚鼠补体C1q-B的免疫检测产品中的应用、在制备用于诊断豚鼠补体C1q-B相关性的免疫疾病的产品中的应用、在制备检测或辅助检测布鲁氏菌病CF-ELISA的免疫检测工具中的应用，也属于本发明的保护范围。其中，所述免疫检测工具具体为试剂、试剂盒、芯片或试纸。

另外，本发明还保护一种布鲁氏菌病检测试剂盒，该试剂盒中含有前述本发明提供的单克隆抗体。

本发明以分子克隆手段表达了豚鼠补体C1q-B，免疫小鼠并融合骨髓瘤细胞后获得了能分泌豚鼠补体C1q单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为豚鼠补体C1q-B 60G4单克隆抗体。

本发明所述的单克隆抗体的制备方法如下：

1、豚鼠补体C1q-B基因的克隆、表达；根据豚鼠补体C1q-B基因序列(XM_003471337.3.)，设计一对引物，以cDNA为模板进行PCR扩增；上下游引物分别引入EcoR I和Xhol酶切位点，插入表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)plys sS感受态细胞，筛选提取阳性克隆菌pET-32a(+)-C1q-B-BL21，用0.1mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达，取诱导后菌液离心取沉淀进行超声，超声后沉淀即为超声豚鼠补体C1q-B；

其中，豚鼠补体C1q-B基因序列(XM_003471337.3.)的具体序列如下：

2、杂交瘤细胞株建立与豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4的鉴定；采用原核表达豚鼠补体C1q-B重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，经有限稀释法获得能分泌抗豚鼠补体C1q-B特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为60G4，豚鼠补体C1q-B单克隆抗体60G4为IgG(IgG1)类型，抗体轻链亚型均为κ链；杂交瘤细胞株60G4接种小鼠的腹水，检测效价及亲和常数，验证该单克隆抗体的灵敏度及特异性。

本发明的另一个目的在于提供一种所述单克隆抗体60G4在制备用于检测豚鼠补体C1q-B的免疫检测工具时的应用。

进一步的，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

本发明还提供了所述单克隆抗体60G4在制备用于检测豚鼠补体C1q-B的免疫检测方法时的应用。

本发明还提供了所述单克隆抗体60G4在制备用于诊断豚鼠补体C1q-B相关性的免疫疾病中的应用。

本发明还提供了所述单克隆抗体在布鲁氏菌病CF-ELISA检测技术中应用。

本发明还对豚鼠补体C1q-B 60G4单抗用于CF-ELISA检测布鲁氏菌病抗体等的检测进行了验证试验，结果显示此检测技术具有良好的特异性、敏感性、可操作性，具有良好的应用前景。

有益效果：

本发明通过采用原核表达的豚鼠补体C1q-B免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌高亲和力的抗豚鼠补体C1q-B单克隆抗体的杂交瘤细胞株。从而获得可用于检测豚鼠补体C1q的单克隆抗体。本发明所述单克隆抗体60G4，可与豚鼠补体C1q-B特异性结合，提高了实验的特异性和可靠性。应用所述单克隆抗体60G4对豚鼠补体C1q-B 60G4的检测技术及方法具有良好的特异性、敏感性、可操作性，具有良好的应用前景。

保藏说明

参据的生物材料(株)：参据NCBI中已上传的C1q-B基因序列(XM_003471337.3.)

科学描述：此豚鼠补体C1Q杂交瘤细胞能稳定的分泌特异性的单克隆抗体

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年9月8日；

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.11186

附图说明

图1豚鼠脾脏cDNA扩增结果；其中1-3泳道为C1q-B

图2菌落PCR鉴定结果；其中1-3泳道为C1q-B

图3双酶切鉴定结果；其中泳道1为pET-32a(+)空质粒，泳道2为pET-32a(+)-C 1q-B重组质粒

图4 pET-32a(+)-C1q-B-BL21(plysS)重组菌诱导表达SDS-PAGE结果；其中泳道M为170KDa蛋白Marker，泳道1为空白质粒诱导后水浴，泳道3为重组菌诱导后超声沉淀；泳道4为诱导前超声沉淀

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1、豚鼠补体C1q-B基因的克隆及表达

采用Tri zol(天根，北京)试剂提取豚鼠脾脏组织样本总RNA。使用Takara(大连)Prime Script TM one step RT-PCR试剂盒，以脾总RNA为模板，采用adapter-T合成cDNA第一链，合成方法参照说明书。根据豚鼠补体C1q-B基因序列，设计一对引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增出的片段大小约为为750bp，与预期大小(746bp)一致(见图1)。

以GENBANK中的豚鼠补体C1q-B基因序列的编码区为模板，设计针对其编码区的特异性引物，上游引物：5‘-CCGGAATTCATGAAGATCCCGTGGG-3’，下游引物：5‘-CCGCTCGAGTCACAGCTCCACATCCG3’，上下游引物分别引入EcoR>

PCR反应试剂选用2*Es Taq Master Mix(Takara，大连)，扩增体系包括12.5ul 2*Es Taq Master Mix，9.5ul DEPC水，上、下游引物及模板各1ul。反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s。共30个循环，最后72℃延伸10min，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离检测，用胶回收试剂盒(Takara，大连)回收。

将PCR胶回收产物、pET-32a(+)载体分别同时进行EcoR I和Xhol限制性内切酶双酶切，并对酶切产物进行胶回收。用常规方法将酶切后胶回收目的片段和载体进行连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞，进行氨苄青霉素抗性筛选，对抗性菌落按常规碱裂解法提取质粒，EcoR I和Xhol双酶切和PCR同时鉴定，对阳性质粒pET-32a(+)-C1q-B送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。菌落PCR(结果见图2)，空质粒及重组质粒双酶切测序结果(见图3)

将阳性克隆菌液pET-32a(+)-C1q-BL21(plysS)在37℃恒温摇床中震荡培养，待OD600接近1.0时。用0.1mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达。取诱导后菌液及诱导前菌液离心后取沉淀进行取超声裂解上清和超声裂解沉淀(包涵体)，进行SDS-PAGE分析(结果见图4)，45KDa处出现条带，与预期大小一致。

实施例2、杂交瘤细胞株建立与豚鼠补体C1q-B单抗60G4鉴定

将原核表达豚鼠补体C1q-B重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠，测定小鼠血清中抗体的效价，当效价达到1:4.2×10⁵后，取脾脏制成单细胞悬液，将1×10⁸脾细胞与2×10⁷-5×10⁷骨髓瘤细胞SP2/0融合。融合后第8天，采用ELISA法检测融合细胞的培养液，选择强阳性孔进一步克隆，经有限稀释法3次克隆，筛选出1株强阳性单克隆细胞株，命名为豚鼠补体C1q-B杂交瘤细胞株60G4，所分泌的单克隆抗体为豚鼠补体C1q-B单抗60G4。杂交瘤细胞株60G4经连续传代30代，能稳定分泌单抗60G4。

豚鼠补体C1q-B单抗60G4为IgG(IgG1)类型，抗体轻链亚型均为κ链；杂交瘤细胞株60G4接种小鼠的腹水效价≥1:200(OD_450nm值≥2.00)；亲合常数(Ka)在10⁸～10¹¹M^-1之间。

所述杂交瘤细胞株60G4已于2015年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为(CGMCC N0.11186)。

实施例3、BALB/c小鼠的豚鼠补体C1q-B 60G4单抗腹水效价测定

1.试验方法

(1)用1:10稀释豚鼠补体包被酶标板，每孔100μl，2～8℃包被18小时以上，用200μl/孔洗涤液洗涤5次。弃洗涤液，用10％的小牛血清200μL/孔在2～8℃封闭18小时以上。200μl/孔洗涤液洗涤5次。

(2)用样品稀释液将待测豚鼠补体C1q-B单抗60G4倍数稀释至1:8192以上，分别加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次。

(3)每孔加HRP标记抗鼠IgG抗体100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次。

(4)每孔加底物A、B液各50μl，混匀，室温避光显色10min。

(5)每孔加入终止液50μl，混匀后测定OD_450nm。

2.试验结果

试验成立条件为空白对照的OD₄₅₀值＜0.20。当OD_450nm值≥2.00的豚鼠补体C1q-B单抗60G4最高稀释度为其效价，结果见表1。

表1 3批豚鼠补体C1q-B单抗60G4效价测定结果

经对3批豚鼠补体C1q-B单抗60G4效价测定显示，其效价均可达1:512以上，能满足CF-ELISA使用要求。

实施例4、豚鼠补体C1q-B单抗60G4在布鲁氏菌病CF-ELISA试剂盒中的使用

1.试验方法

(1)取抗原包被板，将20倍浓缩洗涤液用无菌蒸馏水稀释20倍后，200μl/孔洗板一次；

(2)用样品稀释液将待检血清样品1:100稀释后加入板孔中，每孔100μl。将阴性血清、强阳性对照血清、弱阳性对照血清1:100稀释后各加两孔，每孔100μl。另设空白对照各两孔。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；

(3)用样品稀释液将豚鼠补体待1:10稀释后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；

(4)用样品稀释液将HRP标记豚鼠补体C1q-B单抗60G4应用浓度加入板孔中，每孔100μl。置37℃反应30min后，用200μl/孔洗涤液洗涤5次；

(5)每孔加底物A、B液各50μl，混匀，室温避光显色10min；

(6)每孔加入终止液50μl，混匀后测定OD_450nm。

2.结果判定

试验成立条件为阴性对照血清的OD_450nm值＜0.20，强阳性对照血清的OD_450nm值应≥1.00，弱阳性对照血清的OD_450nm值应在0.4～0.80之间。

样本Cutt off值(S/P)≥2.1P为阳性。检测结果见表2

表2 88份来自感染牛群血清样品的检测结果

注：a＝强阳性对照血清；b＝弱阳性对照血清；c＝阴性对照血清；d＝空白对照；

根据Cut off值(S/P)＝2.1P＝2.1×(0.098+0.096)＝0.204判定，88份来自感染牛群血清样品中，17份样品为布鲁氏菌病阳性。结果见表3。

表3 88份来自阴性牛群血清样品的检测结果

123456789101112A0.1470.1210.1010.1100.0910.0880.0960.0990.1060.0970.1141.298^aB0.1700.0990.0840.0930.0880.1200.0920.0990.1090.1100.0811.397^aC0.0860.0870.0890.0810.0850.0860.1020.0920.0820.0870.0930.597^bD0.0970.0830.1090.0790.0900.0750.0920.0770.0800.0780.0800.602^bE0.0990.1580.1100.0740.0720.0820.1230.0760.0970.0810.0950.098^cF0.1600.1460.0840.1550.0840.0910.0920.0810.0900.0860.1270.099^cG0.1380.0750.1070.1180.1020.1430.1430.0990.0910.0890.0770.109^dH0.1460.1040.1000.0950.0910.0900.0710.1450.0870.1030.1000.097^d

注：a＝强阳性对照血清；b＝弱阳性对照血清；c＝阴性对照血清；d＝空白对照；

根据Cutt off值(S/P)＝2.1P＝2.1×(0.098+0.099)＝0.207判定，88份来自阴性牛群血清样品全部为布鲁氏菌病阴性。

3.结果讨论

利用基于豚鼠补体C1q-B单抗60G4建立的布鲁氏菌病CF-ELISA试剂盒对88份感染牛群血清及88份阴性牛群血清进行检测，在试验对照成立的条件下，判定88份来自感染牛群血清样品中，17份样品为布鲁氏菌病阳性；判定88份来自阴性牛群血清样品全部为布鲁氏菌病阴性。证实此单抗的确可以用于建立布鲁氏菌病CF-ELISA抗体检测试剂盒。