一种利用植物源烟水促进茶藨子叶状层菌中多糖类有效成分积累的方法

摘要

本发明公开了一种利用植物源烟水促进茶藨子叶状层菌中多糖类有效成分积累的方法，将斜面培养后生长的较好的茶藨子叶状层菌菌丝团接种到液体培养基中，每1L液体培养基接种7‑8个菌丝团，在液体培养第3天向液体培养体系中加入植物源烟水，每1L液体体系中加入0.5‑1.5mL植物源烟水，在液体培养第7天再次向液体培养体系中加入植物源烟水，每1L液体体系中加入0.15‑0.25mL植物源烟水，液体培养共9‑10天。本发明在茶藨子叶状层菌发酵培养过程中加入植物源烟水，低浓度的植物源烟水对茶藨子叶状层菌的生长是个“微逆境”，促使多糖类物质的合成，从而提高了作为药用的茶藨子叶状层菌的质量。

说明书

技术领域

本发明涉及一种促进茶藨子叶状层菌中活性物质积累的方法，具体涉及一种利用植物源烟水促进茶藨子叶状层菌中活性物质——多糖类积累的方法。

背景技术

茶藨子叶状层菌（Phylloporia>（Schumach:Fr.）Ryvarden）为锈革孔菌科叶状层菌属真菌，该菌主产于山东平邑，寄生于忍冬植株老干或裸露的根部，当地人称之为“银花蛾子”，用药历史悠久，可用于消炎、解毒、止痛，当地居民用其治疗咽炎、喉炎、肝炎及癌症。茶藨子叶状层菌中含有多糖类、甾醇类、和三萜类等有效成分，具有清热解毒、消肿利咽、降血糖和抗肿瘤等作用。真菌多糖类物质具有抗癌、抗氧化、增强免疫活性，在抗肿瘤方面具有重要作用。有研究人员发现茶藨子叶状层菌中含有能明显抑制人卵巢癌细胞（SKOV-3）、人乳腺癌细胞（MDA231）、HepG2细胞增值的多糖类化合物，而且茶藨子叶状层菌多糖具有显著的免疫增强作用，对小鼠肿瘤具有一定的抑制作用，可改善环磷酰胺对荷瘤小鼠造成的免疫损伤。

随着茶藨子叶状层菌的开发利用，市场需求量非常大，野生资源远远满足不了工业化生产，人工发酵培养技术已取得突破，在人工发酵培养过程中采取有效措施提高茶藨子叶状层菌中多糖类成分的含量，将有利于该类菌的开发利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用植物源烟水促进茶藨子叶状层菌中多糖类有效成分积累的方法，该方法在茶藨子叶状层菌发酵培养过程中加入适量的植物源烟水，提高了茶藨子叶状层菌中多糖类物质的含量，该方法对提高茶藨子叶状层菌的品质具有重要意义。

植物源烟水是指植物材料焖烧产生的烟溶于水中形成的水溶液，植物源烟水的生理生态作用已成为国际生态学界研究的热点，它能有效提高作物种子萌发率，提高幼苗活力，以及提高药用植物体内药物活性物质的积累，在提高作物和中药材品质方面表现出巨大的潜力，然而其对真菌体内活性物质的积累尚未有研究报道。发明人经过研究发现，在人工培养茶藨子叶状层菌的特定发酵时期加入适量的植物源烟水进行培养，该种培养方式大幅度的提高了茶藨子叶状层菌中多糖类活性物质的含量，发现了烟水的又一新用途，同时为高品质茶藨子叶状层菌的培养提供了新的思路。

本发明具体技术方案如下：

一种利用植物源烟水促进茶藨子叶状层菌中多糖类有效成分积累的方法，该方法是将茶藨子叶状层菌Phylloporia>(Schumach.:Fr.) Ryvarden进行斜面培养，斜面培养后，将所得菌丝体接种到液体培养基中进行液体培养，液体培养过程如下：将斜面培养后生长的较好的茶藨子叶状层菌菌丝团接种到液体培养基中，每1L液体培养基接种7-8个菌丝团，在液体培养第3天向液体培养体系中加入植物源烟水，每1L液体体系中加入0.5-1.5mL植物源烟水，在液体培养第7天再次向液体培养体系中加入植物源烟水，每1L液体体系中加入0.15-0.25mL植物源烟水，液体培养共9-10天。

本发明方法中，所述茶藨子叶状层菌以野生状态下忍冬植株上生长的茶藨子叶状层菌Phylloporia ribis (Schumach.:Fr.) Ryvarden子实体为菌种，或者以保藏号为CGMCC NO 1195的茶藨子叶状层菌Phylloporia ribis (Schumach.:Fr.) Ryvarden为菌种。

本发明方法中，所述植物源烟水是将6-7kg的植物源焖烧50-60min所产生的烟通入500ml冷水中得到的水溶液，所述植物源是质量比为3:2:2的山楂核、国槐枝干和楝树枝干。

进一步的，植物源烟水的制备方法还包括以下具体步骤：将山楂核、国槐枝干和楝树枝干晾干，堆放在黑屋中，用紫外光照射24h，然后用80-90℃的热气流处理7-8h；处理后，将山楂核、国槐枝干和楝树枝干按照3:2:2的质量比混合，取6-7kg的混合物作为植物源，将6-7kg的植物源焖烧50-60min所产生的烟通入500mL冷水中，所得的水溶液即为植物源烟水。其中，热气流为热空气或热富氧空气。一般的，制得的植物源烟水在4℃避光保存备用。

本发明方法中，在液体培养时共加入2次植物源烟水，第一次是第3天的时候，第二次是第7天的时候，植物源烟水均一次性加入。

本发明方法中，液体培养时所用的液体培养基由以下重量百分含量的组分组成：麦芽糖1.5-2.5%，味精0.8-1.2%，KH₂PO₄0.03-0.06%，MgSO₄•7H₂O>3>

本发明方法中，液体培养时，在第1次加入植物源烟水前（即第3天的时候），在光照强度300-350Lux、27-29℃、140-160rpm的条件下进行培养，在第1次加入植物源烟水后，在黑暗、24-25℃、140-160rpm的条件下培养12-14h，然后转至光照强度300-350Lux、27-28℃、140-160rpm的条件下培养，直至第2次加入植物源烟水。在第2次加入植物源烟水后，在黑暗、24-25℃、140-160rpm的条件下培养12-14h，然后转至光照强度300-350Lux、27-28℃、140-160rpm的条件下培养，直至液体培养结束。

本发明方法中，整个液体培养过程中，保持液体培养体系的pH为6.5-7.0。尤其是加入植物源烟水后，因为烟水本身PH值低，为了防止加入之后整个培养基的PH过低影响菌的生长，需要同时调整pH。

本发明方法中，为了避免植物源烟水中带入不利于菌种生长的成分，先对植物源烟水进行以下处理后，再加入液体培养基中：先将植物源烟水在121℃下进行高压灭菌20min，然后将植物源烟水煮沸30min，放凉后再加入液体培养基中。

本发明方法中，斜面培养时，将茶藨子叶状层菌菌种加入斜面培养基中，在29℃培养7天。所用的斜面培养基由以下重量百分含量的组分组成：土豆20%、琼脂1.5%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、维生素1×10^-3%，水余量，PH为6.5。

本发明在茶藨子叶状层菌发酵培养过程中加入植物源烟水，本发明植物源烟水由山楂核、国槐枝干和楝树枝干制成，该植物源烟水中含有多种微量的有机酸等活性物质。当植物源烟水浓度低时，其中的部分成分对茶藨子叶状层菌的生长形成“微逆境”，成为“启动”茶藨子叶状层菌中活性物质—多糖类物质生物合成程序的“诱导子”。多糖类物质在茶藨子叶状层菌体内担任“抗逆分子”，植物源烟水的存在促使茶藨子叶状层菌提高体内多糖类物质的合成来抵御“微逆境”，因此我们的目标药物活性物质多糖类物质的含量会增加，从而提高了作为药用的茶藨子叶状层菌的质量。本发明首次提出植物源烟水对茶藨子叶状层菌活性物质积累的作用，该方法原料来源广泛、操作方便，易于实施，对提高茶藨子叶状层菌质量具有重要意义。

附图说明

图1 本发明烟水制取装置的结构示意图。

图中，1、桶状铁质容器，2、盖子，3、横向隔板，4、点火口，5、遮烟盖，6、缓冲瓶，7、接收瓶，8、真空抽滤装置。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步说明，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限制。

实施例1

本发明植物源烟水可以采用专利ZL. 2013 1 0631035.0中记载的装置进行植物源烟水的制备，也可以采用图1中所示的装置进行植物源烟水的制备。图1中烟水制取装置包括桶状铁质容器1，其上端开口并带有盖子2，用于盛放植物材料，盖子上带有把手，桶状铁质容器1的空腔下部内设有放置植物源的横向隔板3，横向隔板上带有通气的孔，桶状铁质容器1还具有点火口4，点火口4位于横向隔板3的下面，点火口上设有可自动调节供氧量的点火口阀门，点火口上带有遮烟盖5，桶状铁质容器1的上部设有出烟口，出烟口与缓冲瓶6相连，从出烟口排出的烟经缓冲瓶6进入多个串联的接收瓶7，接收瓶7中装有冷水，最右端的接收瓶与真空抽滤装置8连接。

植物源烟水的制备方法如下：取山楂核、国槐枝干和楝树枝干，晾干，晾干后按照3:2:2的质量比混合，然后将混合物堆放在黑屋中，用紫外光照射24h，然后用80-90℃的热空气处理8h；处理后，取6kg的混合物作为植物源，将6kg的植物源放入烟水制取装置中，盖好盖子，从点火口点火，点燃植物源，点火后用遮烟盖将点火口盖上，控制供氧量，防止烟从点火口溢出。点燃的植物源因为氧气不足，所以不能充分的燃烧，火很快会熄灭，仅留火星，植物源仅能靠火星进行燃烧，此时会产生大量的烟，在真空抽滤装置的作用下，燃烧过程产生的烟通入接收瓶。将焖烧60min所产生的烟通入500mL冷水中进行吸收，所得的水溶液即为植物源烟水，将其在4℃避光保存，备用。

实施例2

按照实施例1的方法制备植物源烟水，不同的是：植物源是6kg的质量比为3:2:1的国槐枝干、黄刺玫枝干、垂柳枝干。

实施例3

发酵培养茶藨子叶状层菌，方法如下：

1、培养基的制备

斜面培养基的制备：在市场上购买土豆，削去外皮，切成1cm见方小块，将土豆块加入水中，121℃灭菌后煮沸30min（注意火力的控制，可适当补水），用纱布过滤取滤液。在滤液中加入琼脂、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素，用玻璃棒不断搅拌，加热溶解，补足水分，调整pH值至6.5，装入试管，灭菌后冷却，制成斜面培养基；斜面培养基配方为（wt%）：土豆20%、琼脂1.5%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、维生素1×10^-3%，水余量。

液体培养基配方为（wt%）：麦芽糖2%，味精1%，KH₂PO₄0.05%，MgSO₄•7H₂O>3>

、发酵培养茶藨子叶状层菌

2.1：接种工作在净化工作台上进行。当以野生状态下忍冬植株上生长的茶藨子叶状层菌Phylloporia>(Schumach.:Fr.) Ryvarden子实体为菌种时，接种前先用紫外灯对子实体消毒40min，在无菌状态下将子实体边缘正在生长的部分组织接种于含斜面培养基的试管中，在29℃培养7天。当以保藏号为CGMCC NO 1195的茶藨子叶状层菌Phylloporia>ribis(Schumach.:Fr.)>

2.2：取实施例1的植物源烟水，在121℃高压灭菌20min，然后煮沸30min，放凉后备用；

2.3：取上述斜面试管中固体培养生长情况较好的茶藨子叶状层菌菌丝团进行接种，接种到液体培养基中，注意剔除底部含有琼脂的斜面培养基，菌丝团的直径大约为1-2mm，尽量使所取菌丝团的大小保持一致，每1L液体培养基接种8个菌丝团，接种后，在光照强度320Lux、28℃、转速150rpm的条件下先培养2天，第3天将上述灭菌处理后的植物源烟水加入液体培养基中，每1L液体培养基中加入1mL植物源烟水，第7天第2次加入上述灭菌处理后的植物源烟水，每1L液体培养基中加入0.2mL植物源烟水，在第1次加入植物源烟水后，在黑暗、24-25℃、150rpm的条件下培养12h，然后转至光照强度320Lux、28℃、150rpm的条件下培养，直至第2次加入植物源烟水。在第2次加入植物源烟水后，在黑暗、24-25℃、150rpm的条件下培养12h，然后转至光照强度320Lux、28℃、150rpm的条件下培养，直至液体培养结束，整个液体培养过程保持pH为6.5-7.0，整个液体培养的时间为10天。

2.4：液体培养后，将所得的发酵液进行抽滤，所得滤饼在60℃下进行干燥，直至全干，即得茶藨子叶状层菌。

实施例4

按照实施例3的方法发酵培养茶藨子叶状层菌，不同的是：所用植物源烟水为实施例2制备的植物源烟水。

实施例5

按照实施例3的方法发酵培养茶藨子叶状层菌，不同的是：液体培养基为：麦芽糖1.5%，味精1.2%，KH₂PO_{4>0.03%，MgSO4•7H2O>3}>

实施例6

按照实施例3的方法发酵培养茶藨子叶状层菌，不同的是：液体培养基为：麦芽糖2.5%，味精0.8%，KH₂PO_{4>0.06%，MgSO4•7H2O0.02%，葡萄糖1.2%，酵母膏0.2%，玉米浆0.15%，甘露醇1.8%，CaCO3>}

实施例7

按照实施例3的方法发酵培养茶藨子叶状层菌，不同的是：液体培养的过程为：取斜面试管中固体培养生长情况较好的茶藨子叶状层菌菌丝团进行接种，接种到液体培养基中，注意剔除底部含有琼脂的斜面培养基，菌丝团的直径大约为1-2mm，尽量使所取菌丝团的大小保持一致，每1L液体培养基接种8个菌丝团，接种后，在光照强度350Lux、27℃、转速140rpm的条件下先培养2天，第3天将上述灭菌处理后的植物源烟水加入液体培养基中，每1L液体培养基中加入0.5mL植物源烟水，第7天第2次加入上述灭菌处理后的植物源烟水，每1L液体培养基中加入0.25mL植物源烟水，在第1次加入植物源烟水后，在黑暗、24-25℃、140rpm的条件下培养14h，然后转至光照强度350Lux、27℃、140rpm的条件下培养，直至第2次加入植物源烟水。在第2次加入植物源烟水后，在黑暗、24-25℃、140rpm的条件下培养14h，然后转至光照强度350Lux、27℃、140rpm的条件下培养，直至液体培养结束，整个液体培养过程保持pH为6.5-7.0，整个液体培养的时间为10天。

实施例8

按照实施例3的方法发酵培养茶藨子叶状层菌，不同的是：液体培养的过程为：取斜面试管中固体培养生长情况较好的茶藨子叶状层菌菌丝团进行接种，接种到液体培养基中，注意剔除底部含有琼脂的斜面培养基，菌丝团的直径大约为1-2mm，尽量使所取菌丝团的大小保持一致，每1L液体培养基接种8个菌丝团，接种后，在光照强度300Lux、29℃、转速160rpm的条件下先培养2天，第3天将上述灭菌处理后的植物源烟水加入液体培养基中，每1L液体培养基中加入1.5mL植物源烟水，第7天第2次加入上述灭菌处理后的植物源烟水，每1L液体培养基中加入0.15mL植物源烟水，在第1次加入植物源烟水后，在黑暗、24-25℃、160rpm的条件下培养12h，然后转至光照强度300Lux、29℃、160rpm的条件下培养，直至第2次加入植物源烟水。在第2次加入植物源烟水后，在黑暗、24-25℃、160rpm的条件下培养12h，然后转至光照强度300Lux、29℃、160rpm的条件下培养，直至液体培养结束，整个液体培养过程保持pH为6.5-7.0，整个液体培养的时间为10天。

对比例1

按照实施例3的方法发酵培养茶藨子叶状层菌，不同的是：液体培养时不使用植物源烟水，液体培养的过程为：取斜面试管中固体培养生长情况较好的茶藨子叶状层菌菌丝团进行接种，接种到液体培养基中，注意剔除底部含有琼脂的斜面培养基，菌丝团的直径大约为1-2mm，尽量使所取菌丝团的大小保持一致，每1L液体培养基接种8个菌丝团，接种后，在有光（320Lux）、28℃、转速150rpm的条件下培养10天。

对比例2

按照实施例3的方法发酵培养茶藨子叶状层菌，不同的是：液体培养的过程为：取斜面试管中固体培养生长情况较好的茶藨子叶状层菌菌丝团进行接种，接种到液体培养基中，注意剔除底部含有琼脂的斜面培养基，菌丝团的直径大约为1-2mm，尽量使所取菌丝团的大小保持一致，每1L液体培养基接种8个菌丝团，接种后，在光照（320Lux）、28℃、转速150rpm的条件下先培养2天，第3天将实施例1灭菌处理后的植物源烟水加入液体培养基中，每1L液体培养基中加入1.5mL植物源烟水，加入后继续在光照（320Lux）、28℃、转速150rpm的条件下培养，直至液体培养结束，整个液体培养过程保持pH为6.5-7.0，整个液体培养的时间为10天。

对比例3

按照实施例3的方法发酵培养茶藨子叶状层菌，不同的是：液体培养时，植物源烟水用量为：第1次加入植物源烟水的量为每1L液体培养基中加入4.5mL植物源烟水，第2次加入植物源烟水的量为每1L液体培养基中加入2.5mL植物源烟水。

下面，对上述实施例和对比例发酵培养得到的茶藨子叶状层菌多糖类物质含量进行检测。

茶藨子叶状层菌菌丝中多糖的含量检测方法如下：取各实施例和对比例得到的干燥茶藨子叶状层菌菌丝粉末，分别精密称定0.3 g，分别用70%乙醇回流提取1.5 h，过滤，菌丝粉用70%乙醇洗涤，再用100 mL水加热提取1h，过滤，洗涤，洗液并入滤液，将滤液移入250 mL容量瓶中，稀释至刻度，作为供试品溶液备用。精密吸取供试品溶液1 mL置于10 mL具塞试管中，加入蒸馏水1 mL，加入5%的苯酚1mL，混匀，迅速滴加浓硫酸5 mL，即刻摇匀，于70℃水浴中加热25min，采用冷水浴冷却后于490nm处比色测吸光值。

采用苯酚-硫酸法测定多糖，以葡萄糖作为标准品测定菌丝多糖的含量如下表1所示。

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