一种桃叶卫矛花粉超低温保存方法

摘要

本发明涉及一种桃叶卫矛花粉超低温保存方法，将新鲜桃叶卫矛花粉从发育良好的母树采集后装入1.8ml的冻存管中，然后将冷冻管放入盛有硅胶干燥剂的干燥皿内，干燥10h后使花粉含水量保持在4％～4.5％；将装有花粉的冻存管投入﹣196℃液氮罐中保存，随后采用室温化冻30min的方式进行化冻；化冻后花粉萌发所用的培养液配方为蔗糖100g/L+硼酸150mg/L。本发明操作简单、占用空间小、安全稳定、保存成本低且大大延长花粉的保存时间，使花粉的长期贮运和交换成为可能，同时经过超低温保存后的花粉能保存其遗传完整性和稳定性。此外低温环境还可以避免病虫害的引入，在桃叶卫矛杂交育种以及分子研究方面上具有重要的实践与推广意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种花粉长期保存方法，具体是一种桃叶卫矛花粉超低温保存方法。

背景技术

桃叶卫矛，又名白杜、丝绵木，是卫矛科卫矛属的一种小乔木，是我国常见的观赏类庭园树种之一，其叶形秀丽，植株繁茂，包被有红色假种皮的果实可长期宿存于枝头，到了冬季，白雪红果相映，十分美丽，为冬季的北方园林增添了不少色彩。桃叶卫矛在耐寒、抗旱、抗风等方面具有良好的适应性；桃叶卫矛果实总皂苷对人肝癌细胞系-SMMC、人宫颈癌细胞系-HeLa和乳腺癌细胞系-MCF7有明显的抑制生长作用；桃叶卫矛的种子含丰富的脂肪类物质，含油率高达40％以上，可用做工业用油；木材细腻坚韧，可用于雕刻、制帆杆或滑车等；种子及根药用，可用于治疗膝关节痛、漆疮等疾病。由此可见，桃叶卫矛是一种集工业、药用、观赏应用于一体的植物，具有较高的推广价值。若采用传统的种植保存，极易使其受到病菌或虫害的影响，进而造成极大的人力财力的损失,成熟的花粉含有植物的全部遗传品质信息，花粉超低温保存操作简单，是进行种质资源保存的一条新途径，是目前唯一可行的长期而稳定地保存种质资源的方法。

植物种质资源超低温保存是指将植物细胞、组织或器官在液氮(-196℃)的超低温条件下进行保存。在如此低的温度下，植物材料中参与新陈代谢的各种生物酶的活性受到极大抑制，生物体新陈代谢基本停止，处于“假死”状态，利用该方法可以实现植物种质资源的永久保存。目前成功进行超低温保存的材料类型有种子、休眠芽、茎尖分生组织、花粉、合子胚(胚轴)、体细胞胚、悬浮细胞、愈伤组织、原生质体等。其中花粉超低温保存操作简单，可保持特定的基因型。

将超低温保存技术应用于花粉保存，其优点：操作简单易行、占用空间小、安全稳定保存成本低可以大大延长花粉的保存时间，使花粉的贮运和交换成为可能，同时还能很好服务于育种工作，提高育种效率经过低温保存的花粉能保持其遗传完整性和稳定性低温条件下还可以避免病虫害的引入，为地区间、国际间的种质交换提供方便。

桃叶卫矛花粉超低温保存目前还未见报道。因此，研发一种适合于桃叶卫矛花粉的可行的超低温保存方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

将不同时间采集的桃叶卫矛新鲜花粉放入1.8ml的冻存管中，花粉的体积不超过冻存管容量的2/3，然后将冷冻管放入盛有硅胶干燥剂的干燥皿内干燥不同的时间后获得不同含水量的花粉，干燥皿规格为V＝410mm×410mm×310mm、Φ＝300mm；将装有花粉的冻存管投入﹣196℃液氮罐中保存；取出冻存管进行不同化冻处理；化冻后将花粉在不同浓度的蔗糖和硼酸培养液中测定萌发率。

所述不同采集时间，1d中不同时间所采集的花粉萌发率不同，我们分别采集了6:00、8:00、10:00、12:00、14:00、16:00、18:00的桃叶卫矛花粉。

所述干燥不同的时间分别为干燥2h、4h、6h、8h、10h、12h。

所述不同含水量，为桃叶卫矛花粉干燥的时间不同，得到的含水量。

所述不同化冻方式，分别为三种：(1)室温化冻30min；(2)40℃水浴化冻2min；(3)自来水冲洗8min。

所述不同蔗糖和硼酸浓度，以桃叶卫矛花粉为材料，去离子水作为溶剂，加入不同浓度的蔗糖和硼酸，采用二因素完全随机的方法，共设计了16种不同培养基。分别为：蔗糖50g/L+硼酸0mg/L；蔗糖50g/L+硼酸100mg/L；蔗糖50g/L+硼酸150mg/L；蔗糖50g/L+硼酸200mg/L；蔗糖100g/L+硼酸0mg/L；蔗糖100g/L+硼酸100mg/L；蔗糖100g/L+硼酸150mg/L；蔗糖100g/L+硼酸200mg/L；蔗糖150g/L+硼酸0mg/L；蔗糖150g/L+硼酸100mg/L；蔗糖150g/L+硼酸150mg/L；蔗糖150g/L+硼酸200mg/L；蔗糖200g/L+硼酸0mg/L；蔗糖200g/L+硼酸100mg/L；蔗糖200g/L+硼酸150mg/L；蔗糖200g/L+硼酸200mg/L。

通过对以上技术方案进行实验找出最佳一种桃叶卫矛花粉超低温保存方法，用于权利要求。

具体实施方式：

以下对本发明结合具体的实例作进一步的详细说明，并介绍本发明的相关研究结果。

1.以东北林业大学校内的桃叶卫矛花粉为例对本发明作进一步的详细说明。

1)不同采集时间对桃叶卫矛花粉萌发率的影响

从桃叶卫矛开花的一天中选定不同的时段，即6:00、8:00、10:00、12:00、14:00、16:00、18:00每隔两小时采集花粉，观察其萌发率。

表1 不同采集时间对桃叶卫矛花粉萌发率的影响

2)经不同干燥时间得不同含水量花粉超低温保存前后萌发率

首先采用烘干法测得桃叶卫矛花粉的最大含水量后，利用硅胶干燥法进行花粉不同含水量梯度的配制，然后测定花粉的萌发率；后将其投入液氮罐中保存一段时间后取出，经化冻后测定桃叶卫矛花粉经超低温保存后的萌发率。

表2 不同干燥时间得不同含水量花粉超低温保存前萌发率

表3 不同干燥时间得不同含水量花粉超低温保存后萌发率

3)不同化冻方式对花粉萌发率的影响

采用了3种化冻方式(1)室温化冻30min；(2)40℃水浴化冻2min；(3)自来水冲洗8min对桃叶卫矛花粉超低温保存24h后的进行化冻试验，比较3种化冻方式对花粉萌发力的影响。

表4 不同化冻方式对花粉萌发率的影响

4)不同蔗糖和硼酸浓度对桃叶卫矛花粉萌发率的影响

以桃叶卫矛花粉为材料，去离子水作为溶剂，加入不同浓度的蔗糖和硼酸，采用二因素完全随机的方法，共设计了16种不同培养基。在培养液上均匀地撒播桃叶卫矛花粉，然后将其放置在25℃人工气候箱中光照培养一段时间后观察花粉萌发状况，根据花粉的萌发率从而确定桃叶卫矛花粉萌发的最适培养液。

表5 不同浓度蔗糖和硼酸对桃叶卫矛花粉萌发率的影响

2.实验结果

1)由表1可知，由于采集的时间的不同，花粉萌发率是不同的，其大致趋势为：6:00-12：00时段为下降趋势，在12:00花粉萌发率降至最低；而在12:00-16：00时段花粉萌发率呈上升趋势，并在16:00时到达最高；在随后的16:00-18:00时段，花粉萌发率逐步下降。由此可得出，16:00的桃叶卫矛花粉萌发率最高。

2)由表2，表3可以看出不同含水量的桃叶卫矛花粉在保存前的萌发率在液氮保存前的萌发率没有显著的差异，但当花粉经过液氮保存后，出现了显著的差异。当桃叶卫矛花粉含水量为初始状态(14.56％)时，液氮保存后的花粉全部死亡，随着花粉含水量的进一步降低，在12.32％-4.14％的含水量区间内，超低温保存后的花粉萌发率呈现出逐步升高的趋势。而当花粉含水量进一步从4.14％降低至1.67％时，超低温保存后的花粉萌发率又开始降低，并最终全部死亡，因此将装有花粉的冻存管放入盛有硅胶干燥剂的干燥皿内干燥10h，使花粉含水量保持在4％～4.5％之间；花粉的萌发率最高。

3)由表4可知，化冻方式对保存后的桃叶卫矛花粉萌发率有极显著影响，采用室温化冻30min后桃叶卫矛花粉萌发率可达14.34％，其效果要优于40℃水浴化冻2min和室温化冻30min这两种化冻方式。由此可以推断室温化冻30min的化冻效果较好。

4)由表5可知，桃叶卫矛花粉在不同配方的培养液中萌发情况有差异。花粉在蔗糖浓度为100g/L时萌发率达到最高，而随着蔗糖浓度的进一步增加，花粉的萌发率又降低。结合桃叶卫矛花粉的萌发率，最终我们筛选出叶卫矛花粉培养液中蔗糖浓度和硼酸浓度最适配比为：蔗糖100g/L+硼酸150mg/L。