一种提高西瓜未授粉子房胚状体诱导率方法

摘要

本发明提供了一种提高西瓜未授粉子房胚状体诱导率方法，该方法包括：在接种前，进行春季西瓜未授粉子房的选样和预处理；所述选样为选择留取全部果柄的西瓜未授粉子房；所述预处理的步骤为：（1）将选样所得未授粉子房置于浓度为0.02 mg/ml的TDZ中处理5‑10 min；（2）将步骤（1）所得物置于10℃下处理2 d，或置于15‑20℃下处理1‑2 d。本发明可以大幅度的提高春季西瓜未授粉子房胚状体的诱导率，最高可达15.9 %，同时，所得胚状体的生长状况良好。

说明书

技术领域

本发明属于作物培育领域，具体涉及一种提高春季西瓜未授粉子房胚状体诱导率方法。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus)是葫芦科重要的蔬菜作物之一，具有丰富的营养和保健功能从而深受消费者喜爱，中国作为西瓜的生产和消费大国，其产量占世界总产量的60%以上，市场前景广阔。但是，我国西瓜育种水平相对滞后，品种类型无法完全满足市场需求，因此提高我国西瓜育种水平、增强西瓜产业国际竞争力具有重要意义。

单倍体植株进行加倍处理后获得双单倍体(DH)株系对于加速育种进程、创新种质资源、遗传图谱构建等方面均具有重要意义。人们尝试用多种方法获得单倍体，通常采用的有离体雄核培养和离体雌核培养，其中以花粉或花药为外植体的离体雄核培养研究较为深入，应用也更加普遍，特别是在十字花科和禾本科作物上。但是，在葫芦科作物上通过离体雄核培养来诱导单倍体的形成非常困难，直至目前还没有建立起较为成熟的诱导体系，因此研究较多的是以未授粉子房或胚珠为外植体的离体雌核培养。

离体雌核培养过程中再生植株的产生方式有两种，一种是诱导形成愈伤组织后再分化产生芽，最后形成完整再生植株；另一种是以胚状体发育途径直接形成再生植株。相关研究表明，愈伤组织途径形成的再生植株大部分起源于体细胞，而以胚状体发育途径产生的再生植株中单倍体植株的比例显著高于以愈伤组织途径形成的再生植株。这提醒我们在进行西瓜未授粉子房离体培养以创制单倍体植株的过程中，提高胚状体的诱导率是一个需要解决的关键问题。

虽然现有的研究可以将秋季西瓜未授粉子房胚状体的诱导率提高到20%左右，然而，对于春季西瓜未授粉子房胚状体，现有技术所获得的诱导率多在5 %以下，严重的限制了相关研究和产业的发展进程。

因此，以春季西瓜未授粉子房为研究对象进行探究，力争找到提高春季西瓜未授粉子房胚状体诱导率的方法，以期能够加速西瓜单倍体育种进程，为我国西瓜种质资源创新、新品种选育、基因工程相关研究提供帮助，是本领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高春季西瓜未授粉子房胚状体诱导率方法，该方法包括：

在接种前，进行春季西瓜未授粉子房的选样和预处理；

所述选样为选择留取全部果柄的未授粉子房；

所述预处理的步骤为：

（1）将选样所得未授粉子房置于浓度为0.02 mg/ml的TDZ中处理5-10 min；

（2）将步骤（1）所得物置于10℃下处理2 d，或置于15-20℃下处理1-2 d。

所述西瓜未授粉子房为开花前一天的西瓜未授粉子房。

优选的，所述预处理步骤（1）的处理时间为10 min。

优选的，所述预处理步骤（2）为：将步骤（1）所得物置于10℃下处理2 d，或置于15℃下处理1-2 d，或置于20℃下处理1 d。更优选的，所述预处理步骤（2）为：将步骤（1）所得物置于15℃下处理2 d。

所述方法还包括：在接种前切除经过预处理的未授粉子房的外表皮，然后进行切片，切片厚度为1 mm，再进行消毒处理。优选的，所述消毒处理为：用3%的次氯酸钠溶液消毒2 min。

所述方法还包括进行接种和培养步骤。优选的，所述接种和培养步骤为：接种于MS+30g/L 蔗糖+7 g/L琼脂粉+0.04mg/L TDZ的诱导胚状体发生的培养基上，35℃黑暗条件下热激5天后转到组培室培养。

所述培养的时间为28天。

举例而言，当不采用本发明预处理方法，仅进行下述处理时，秋季西瓜未授粉子房胚状体的诱导率最高可达20.2%，但春季西瓜未授粉子房胚状体的诱导率仅为3.5%：

取开花前一天的西瓜未授粉子房为材料，流水冲洗30min后在超净工作台上用75%的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，去除子房外表皮后横切成1mm左右的薄片，然后在3%的次氯酸钠溶液中消毒2min，无菌水冲洗5次后接种于MS+30g/L 蔗糖+7 g/L的琼脂粉+0.04mg/LTDZ的诱导胚状体发生的培养基上，35℃黑暗条件下热激5天后转到组培室培养，28天。

本发明的有益效果：

本发明可以大幅度的提高春季西瓜未授粉子房胚状体的诱导率，最高可达15.9 %，同时，所得胚状体的生长状况良好。

附图说明

图1为不同果柄长度对胚状体诱导率的影响结果图；

图2为未经预处理春季西瓜未授粉子房胚状体诱导情况结果图；

图3为经本发明预处理春季西瓜未授粉子房胚状体诱导情况结果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1. 材料与方法

1.1 试验材料

供试西瓜品种为早佳8424，由湖南省西瓜甜瓜研究所提供。试验材料于2016年4月10日定植在湖南省西瓜甜瓜研究所科研基地的塑料大棚中，5月20日第二雌花出现时开始取样接种。

1.2 试验方法

1.2.1 果柄长短对胚状体诱导率的影响

取样时，分别摘取留取全部果柄、留取1/2果柄、去除果柄三种类型的西瓜未授粉子房为材料，用0.02%的TDZ溶液浸泡10 min后置于15℃恒温条件下2天，然后按照已建立的技术体系进行接种，28天后分别统计西瓜未授粉子房胚状体诱导率以探究不同果柄长度对春季西瓜未授粉子房胚状体诱导率的影响。

1.2.2激素预处理方式对胚状体诱导率的影响

以留取全部果柄的西瓜未授粉子房为材料，分别用0.00%、0.01%、0.02%、0.03%的TDZ溶液浸泡5、10、15 min后置于15℃恒温条件下2天，以不进行激素预处理的材料为对照，然后按照已建立的技术体系进行接种，28天后分别统计西瓜未授粉子房胚状体诱导率以探究激素预处理方式对春季西瓜未授粉子房胚状体诱导率的影响。

1.2.3 温度预处理方式对胚状体诱导率的影响

以留取全部果柄的西瓜未授粉子房为材料，用0.02%的TDZ溶液浸泡10 min后分别置于10、15、20℃的恒温条件下处理不同时间（1、2、3天），以置于室内变温条件下的材料为对照，然后按照已建立的技术体系进行接种，28天后分别统计西瓜未授粉子房胚状体诱导率以探究不同温度预处理对春季西瓜未授粉子房胚状体诱导率的影响。

上述已建立的技术体系为：

取开花前一天的西瓜未授粉子房为材料，流水冲洗30min后在超净工作台上用75%的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，去除子房外表皮后横切成1mm左右的薄片，然后在3%的次氯酸钠溶液中消毒2min，无菌水冲洗5次后接种于MS+30g/L 蔗糖+7 g/L的琼脂粉+0.04mg/LTDZ的诱导胚状体发生的培养基上，35℃黑暗条件下热激5天后转到组培室培养，28天后统计胚状体诱导率。

1.3数据分析

分别统计不同处理条件下春季西瓜未授粉子房的胚状体诱导率，采用SPSS软件对以上各数据进行方差分析和Duncan，s多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同果柄长度对胚状体诱导率的影响

西瓜未授粉子房取下后有一个预处理的过程，不会立刻接种。作者以不同果柄长度的未授粉子房为试验材料，进行果柄长度对胚状体诱导率影响的研究，结果如图1 所示。

由图1可以看出，果柄长度不同胚状体诱导率存在显著差异，留取全部果柄时其胚状体诱导率最高达13.8%，而去除果柄子房的胚状体诱导率仅为2.6%，留取1/2果柄子房的诱导率为4.4%，由此说明果柄长度能够对春季西瓜未授粉子房的胚状体诱导率产生影响，果柄长度越长预处理后其胚状体诱导率越高。

2.2 激素预处理方式对胚状体诱导率的影响

激素预处理方式不同，胚状体诱导率之间存在显著差异，结果如表1所示。由表1可知，当TDZ浓度为0时，不同预处理时间之间差异不显著且均处于较低水平，胚状体生长状况一般，总体不利于再生植株的获得。TDZ浓度为0.01 mg/ml时，相较于不用激素处理，其胚状体诱导率显著提高，当预处理时间达到15min时，诱导率最高可达6.0%，但随着TDZ浓度的进一步提高，胚状体诱导率仍有上升的空间。在TDZ浓度为0.02或0.03 mg/ml条件下，预处理时间为10或15min时，各处理之间胚状体诱导率差异不显著且均处于较高水平，最高可达16.7%，与未使用激素预处理的相比较显著提高了胚状体诱导率，由此说明激素预处理能够显著提高胚状体诱导率；但试验过程中发现，TDZ浓度达0.03 mg/ml或激素预处理时间大于15min时，虽然胚状体诱导率较高但再生的胚状体存在严重的畸形，无法形成正常再生植株，不利于单倍体植株的获得。综上所述认为，0.02 mg/ml的TDZ溶液预处理10min能够显著提高春季西瓜未授粉子房的胚状体诱导率，是最佳的激素预处理方式。

表1 不同激素预处理方式对胚状体诱导率的影响

注：不同小写字母表示在5%水平上差异显著；一般指胚状体特征不明显、生长缓慢；良好指胚状体特征明显、生长迅速

2.3温度预处理方式对胚状体诱导率的影响

温度预处理方式不同，春季西瓜未授粉子房胚状体诱导率之间存在显著差异，结果如表2所示。由表2可知，在相同预处理温度下，不同预处理时间之间胚状体诱导率差异显著并呈现出一定的趋势，预处理时间为2天时胚状体诱导率均最高，可达15.9%，预处理时间达3天时诱导率均急剧下降，这可能是由于预处理时间过长时子房生理状态明显下降造成的。相同预处理时间时，随着预处理温度的上升，胚状体诱导率呈现出先上升后下降的趋势，在15℃条件下达到峰值，诱导率最高可达15.9%，由此说明15℃是较适宜于春季西瓜未授粉子房预处理的温度。试验过程中还发现，如果西瓜子房置于室内变温条件下放置一段时间，其胚状体诱导率显著下降，放置时间达到3天时其诱导率仅为2.8%，并且胚状体存在严重的畸形现象，由此说明西瓜未授粉子房的生理状态对胚状体的诱导率存在显著影响。综上认为，在15℃条件下预处理2天，能够显著提高春季西瓜未授粉子房的胚状体诱导率，有利于再生植株的获得。

表2 不同温度预处理方式对胚状体诱导率的影响

注：不同小写字母表示在5%水平上差异显著；一般指胚状体特征不明显、生长缓慢；良好指胚状体特征明显、生长迅速

一般而言，小孢子培养过程中一般使用4℃进行预处理，能够取得较好的效果。大孢子培养时一般使用35℃进行预处理，但预处理效果有不同报导。

本试验采用的预处理方式，取得了较好的效果，这可能是春季西瓜未授粉子房发育时所处环境温度变化较大，最低气温低从而影响其生理状态，本发明的预处理方式显著提高了春季西瓜未授粉子房的胚状体诱导率。

预处理完成后用已建立的诱导体系进行接种培养，能够显著改善春季西瓜未授粉子房胚状体诱导率低的问题。通过上述预处理手段，能够将春季西瓜未授粉子房的胚状体诱导率从3.5%（图2）最高提高到15.9%(图3)。