microRNA 标志物组及其在制备检测胃癌淋巴结转移试剂盒中的应用

摘要

本发明涉及microRNA标志物组及其在制备检测胃癌淋巴结转移试剂盒中的应用。microRNA标志物组，由miR‑27b‑5p，miR‑128‑3p，miR‑100‑5p和miR‑214‑3p组成，miR‑27b‑5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR‑128‑3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，miR‑100‑5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，miR‑214‑3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明首次构建了检测胃癌淋巴结转移的包含4个microRNA标志物的microRNA标志物组，对胃癌淋巴结转移的预测有极高的准确性和特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及microRNA标志物组及其在制备检测胃癌淋巴结转移试剂盒中的应用，属于医学分子生物学技术领域。

背景知识

胃癌是我国最常见的肿瘤之一，在我国发病率居各类消化道肿瘤的首位。胃癌高死亡率最主要的原因是患者诊断明确时已经处于胃癌晚期，胃癌患者的存活率非常低，大约5％-15％。虽然胃癌的诊断和治疗有所改善，但是胃癌患者的预后非常差，尤其是有远处转移的患者。早期胃癌指癌组织仅局限于粘膜层和粘膜下层，判断早期胃癌的标准不是其面积的大小和是否有局部淋巴结转移，而是其浸润的深度。内镜粘膜下剥离术是近年来出现的一项新的治疗手段，也是临床应用前景很好的技术，广泛应用于早期胃癌的治疗。内镜粘膜下剥离术是在内镜下，使用高频电刀与专用器械，将胃部早期肿瘤与其下方正常的粘膜下层逐步剥离，以达到将病灶完整切除的目的。内镜粘膜下剥离术允许早期胃癌病变超过2厘米及破溃的病变，并且可对切除癌组织进行准确的组织学分级的评估。另外，由于内镜粘膜下剥离术创伤小的优点，对年老者及高手术风险的患者非常有利。但是，在早期胃癌患者进行内镜粘膜下剥离术后，患者可能会发生淋巴结转移从而导致胃癌复发及转移，影响胃癌患者预后。目前为止，内镜粘膜下剥离术的胃癌患者是否伴随着淋巴结转移的发生是不清楚的。但是，淋巴结转移是胃癌患者不良预后的主要原因，并且淋巴结转移是重要单一的预后不良因子。因此，合适的分子标志物可为预测胃癌患者淋巴结转移提供重要的线索和依据，促进胃癌患者个体化治疗目标的实现。

miRNAs是近几年研究的热点，它是真核生物中发现的一类短链内源性非编码RNA，长约22个碱基左右，主要通过与靶基因3’UTR完全或不完全配对，降解靶基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生理及病理过程。越来越多的研究表明miRNAs在肿瘤转移，发展和进展过程中发挥着重要作用。Khan等人认为miR-27b-5p与神经母细胞瘤的转移相关。许多研究显示miR-101-5p在多种肿瘤中能抑制促转移基因，例如EZH2，VEGF-C和HMGA2等基因。同样地，miR-128-3p能调控上皮间质化并且抑制癌细胞的迁移和浸润能力。miR-100-5p在多种肿瘤中通过抑制多个靶基因被认为是抗转移的调控者。除了以上提到的miRNAs，miR-145-5p在肺癌中表达降低，并且与淋巴结转移相关。Xing等人报道miR-145-5p可抑制胃癌的浸润和转移。Wang等人研究表明miR-214-3p在胃癌中表达降低，与癌细胞的迁移，浸润及胃癌的淋巴结状态有关。

研究表明miRNAs表达谱能够作为许多肿瘤诊断和预后的标志物。Wei等人发现miRNAs表达谱检测为肝癌患者的诊断和预后提供了可行的方法。Yu等人也表明miRNAs表达谱可以很好的预测非小细胞肺癌患者的预后。miRNAs表达谱在胃癌中的研究揭示miRNAs的表达与胃癌发生，进展及个性化治疗有密切关系。例如，Li等人检测了7个miRNAs(miR-10b,miR-21,miR-223,miR-338,let-7a,miR-30a-5p,miR-126)表达谱与胃癌患者总体生存和无瘤生存时间密切相关，并且这种预后相关的miRNAs表达谱可应用于胃癌患者个体化治疗。Liu等人发现5个miRNAs表达谱(miR-1,miR-20a,miR-27a,miR-34and miR-423-5p)可作为胃癌检测的新的诊断指标，并且基于5个miRNAs的生物标记可预测在肿瘤进展分期。

然而，miRNAs表达谱在预测胃癌淋巴结转移的报道非常少，并且表达谱的研究较新，该领域的研究目前处于空白，未发现相关的应用性研究。此外，该领域研究需还要克服以下几个技术难点：

1、大样本临床标本、临床资料的获取(小样本由于个体差异难获得阳性结果或一致结果)，长期的随访；

2、单个miRNA的局限性，低敏感性和特异性；

3、许多研究多关注miRNA表达谱在癌与正常的作用，少有研究miRNA表达谱在淋巴结转移与非转移的作用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种microRNA标志物组及其在制备检测胃癌淋巴结转移试剂盒中的应用。该microRNA标志物组可用于预测胃癌淋巴结转移的预测、检测或筛查；通过实时定量PCR检测胃癌标本中标志物组中所涉及的4个miRNA(miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p)的表达状况，用于评判胃癌患者的淋巴结转移情况。

本发明技术方案如下：

microRNA标志物组，由miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p组成，miR-27b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR-128-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，miR-100-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

上述microRNA标志物组在制备检测胃癌淋巴结转移试剂盒中的应用。

一种检测胃癌淋巴结转移的试剂盒，包括：

上述microRNA标志物组；

以及microRNA快速提取试剂、反转录试剂、实时定量PCR试剂、人RNU6B miRNA引物。

上述microRNA快速提取试剂、反转录试剂、实时定量PCR试剂、人RNU6B miRNA引物均可采用本领域常规市售试剂，如microRNA快速提取试剂可采用Bioteke公司销售的货号RP5301的试剂；反转录试剂(包括反应缓冲液，DNA聚合酶，反转录酶复合物，去离子水)可采用TaKaRa公司销售的货号RR066A的试剂；实时定量PCR试剂(包括反应缓冲液，qPCR复合物，去离子水)可采用GeneCopoeia公司销售的货号AOMD-Q020的试剂；人RNU6B miRNA引物可采用GeneCopoeia公司销售的货号HmiRQP9001的试剂。

microRNA标志物组中各microRNA标志物的筛选过程：

发明人通过实时定量PCR检测胃癌标本中6个miRNA的表达状况，结果显示miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p的表达水平在发生淋巴结转移的胃癌患者中表达下调。发明人也发现miR-101-5p和miR-145-5p在ROC曲线(受试者工作特性曲线)分析中无统计学意义，将4个miRNA标志物：miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p通过Logistic回归构建了风险公式。该公式可以很好的区分胃癌淋巴结转移与否，比传统的检测单一miRNA指标具有更高的准确性和特异性。

有益效果

1、本发明首次构建了检测胃癌淋巴结转移的包含4个microRNA标志物的microRNA标志物组，对胃癌淋巴结转移的预测有极高的准确性和特异性。针对上述4个miRNA标志物的检测结果与已经建立的风险公式进行比较，可以很好地区分胃癌淋巴结转移与否，极大提高预测的准确性。

2、本发明通过对所述microRNA标志物组研制相对应的检测试剂盒，用于胃癌患者淋巴结转移的预测，提供个性化治疗方案，具有重要的临床意义和很大的开发价值。

附图说明

图1、采用qRT-PCR方法在初筛(51例)样本中检测了6个miRNA的表达结果柱状图及这6个miRNA在初筛(51例)样本中的ROC曲线分析图；

图中：A为miR-27b-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

B为miR-101-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

C为miR-128-3p的表达结果图和ROC曲线分析图；

D为miR-100-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

E为miR-145-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

F为miR-214-3p的表达结果图和ROC曲线分析图；

图2、采用qRT-PCR方法在验证(51例)样本中检测了6个miRNA的表达结果柱状图及这6个miRNA在验证(51例)样本中的ROC曲线分析图；

图中：A为miR-27b-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

B为miR-101-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

C为miR-128-3p的表达结果图和ROC曲线分析图；

D为miR-100-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

E为miR-145-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

F为miR-214-3p的表达结果图和ROC曲线分析图；

图3、采用qRT-PCR方法在合并(102例)样本中检测了6个miRNA的表达结果柱状图及这6个miRNA在合并(102例)样本中的ROC曲线分析图；

图中：A为miR-27b-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

B为miR-101-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

C为miR-128-3p的表达结果图和ROC曲线分析图；

D为miR-100-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

E为miR-145-5p的表达结果图和ROC曲线分析图；

F为miR-214-3p的表达结果图和ROC曲线分析图；

图4、高风险组和低风险组进行ROC曲线分析图；

图中：A为高风险组的胃癌患者比低风险的患者更易于发生淋巴结转移；

B为高风险组和低风险组ROC曲线分析图；

图5、miR-27b-5p，miR-101-5p，miR-100-5p和miR-145-5p组成的表达谱在合并(102例)样本中进行ROC曲线分析图；

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

用于实时定量PCR的102例胃癌组织石蜡标本均取自山东大学齐鲁医院2004-2007年手术切除病例。其中，65例胃癌患者发生淋巴结转移，37例患者未发生淋巴结转移。102例患者手术前均未接受放、化疗。以上石蜡组织均经HE染色后病理证实。本研究中胃癌患者临床参数，如表1所示。

表1、4个miRNAs标志物组在合并组(102例)标本中的临床病理参数分析

实施例2

1、胃癌标本组织中miRNA的提取：采用Bioteke公司的石蜡包埋组织中miRNA的提取试剂盒。

(1)切片：将胃癌标本的已包好石蜡组织切成4μm的薄片8-10张。

(2)脱蜡脱水：组织切片放在65℃恒温箱2-4小时，然后依次放在二甲苯浸泡2次用于脱蜡，每次10min左右。然后依次浸泡在梯度酒精如75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇，每个梯度酒精缸浸5分钟、100％无水乙醇2次，各5min，此步骤用于脱蜡，取出后待其自然晾干。

(3)染色：待切片晾干后，将其放在苏木素缸里(根据苏木素使用时间长短，估计染色时间)，大约染色1min后，再用自来水温和冲洗切片3min。

(4)挑取：提前准备好1ml注射器针头并配置好240μlPTL溶液和10μl蛋白酶K混合液，于显微镜下观察切片，找到所需的组织在用针头将其轻轻刮下，放于混合液的EP中，涡旋混匀。

(5)miRNA提取：

1)将EP管放于55℃水浴孵育15min，取出后放于80℃水浴孵育10min。

2)用移液器吸取750μl裂解液MRL加入到EP管中，吹打充分混匀，于室温放置3min。

3)继续向EP管中加入200μl氯仿，震荡器剧烈震荡20秒左右，于室温静置2min。

4)提前将4℃离心机预冷，EP管放于12000rmp离心15min，缓慢取出，可观察到样品分为三层，分别为上层的无色的水相层，中间层，以及有机相层，实验所需的RNA在无色水相层存在。随即把水相移到新的RNase free-EP管中估计其体积，勿吸出中间层。

5)将体积浓度为70％的乙醇加入到新的RNase free-EP管，约水相的0.6倍体积，充分混匀后，将所得液体小心移入RA吸附柱。

6)将RA吸附柱放于4℃离心机，12000rmp离心45s，收集下滤液置于新的RNasefree-EP管中，肉眼评估下滤液的体积后，向EP管中加入2/3下滤液体积的无水乙醇，上下颠倒几次达到充分混匀效果，将混合液小心移入RB吸附柱中，4℃离心机10000rmp离心30s弃掉废液。

7)往RB吸附柱中加入700μl漂洗液RW，12000rmp，4℃离心1min，弃掉废液。

8)重复上一步骤，达到充分漂洗的目的。

9)将吸附柱RB放回空收集管中，4℃12000rmp离心2min,掀开离心柱盖,室温放置3-5min，尽量除去漂洗液，让乙醇挥发。

10)将RB吸附柱取出后，放入一个新的RNase free EP管中，加入30μl左右RNasefree water(事先在65℃水浴5-10min效果更好)，室温放置3min，4℃12000rmp离心1min。收集得到miRNA，用光度计测miRNA的纯度及浓度后保存于-80℃备用)。

2、qRT-PCR检测：采用All-in-one^TM>

(1)RT反应条件：37℃1h；85℃5min。体系如下：

(2)6种miRNAs(miR-27p-5p，miR-101-5p,miR-128-3p，miR-100-5p,miR-145-5p和miR-214-3p进行实时定量PCR验证，其序列信息如表2所示。

表2

表3：相关miRNAs的引物信息

序号miRNAs名称上游引物序列7miR-27p-5pAGAGCTTAGCTGATTGGTGAACAA8miR-101-5pCAGTTATCACAGTGCTGATGCTAAA9miR-128-3pTCACAGTGAACCGGTCTCTTTAA10miR-100-5pCGTAGATCCGAACTTGTGAA11miR-145-5pAGTTTTCCCAGGAATCCCTAAA12miR-214-3pCAGGCACAGACAGGCAGTAA

PCR反应(总体系20μL)：

反应条件：95℃预变性10min；95℃变性10sec，60℃退火20sec，72℃延伸10sec共40个循环。

(3)数据处理：记录各样本平均CT值，按公式△CT＝CT(miRNA)-CT(U6)和2^-△CT计算每个样本中6种miRNA的相对表达量。使用t检验分析，以P<0.05认为有统计学意义。

(4)实验结果：在51例初筛组样本中，与没有淋巴结转移组相比，miR-27b-5p,miR-101-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p在淋巴结转移组中表达下调。随后在51例验证组样本中进行了实时定量PCR检测，并综合分析了102例样本中6种miRNA的表达情况，实验结果表明miR-27b-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p的表达水平在发生淋巴结转移的胃癌患者中表达下调。

实施例3

利用GraphPad Prism 5软件对6种miRNA区分化疗效果的特异性和灵敏性进行了受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)分析。在51例初筛组中，结果显示miR-27b-5p,miR-101-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p(曲线下面积AUC＝0.7161,0.7210,0.7839,0.7150和0.7081P均<0.05)，具有较好的区分化疗效果的特异性和灵敏性，如图1；而miR-145-5p的分析结果显示其AUC＝0.6161(P>0.05)，差异没有显著统计学意义，如图1所示。在51例验证组中，结果显示miR-27b-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p(曲线下面积AUC＝0.7474,0.6972,0.7768和0.7776，P均<0.05)，具有较好的区分化疗效果的特异性和灵敏性，如图2；而miR-101-5p和miR-145-5p的分析结果显示AUC分别为0.6246和0.5956(P>0.05)，差异没有显著统计学意义，如图2所示。综合分析102例胃癌组织标本，结果显示miR-27b-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p(曲线下面积AUC＝0.7343,0.7193,0.7414和0.7306，P均<0.05)，如图3。综合上述三组实验结果，除去miR-101-5p和miR-145-5p，将其余4个指标采用Logistic回归模型构建了淋巴结转移的风险公式：

miRNA score＝(12.92×the level of miR-27b-5p)+(3.686×the level ofmiR-100-5p)–(0.972×the level of miR-128-3p)+(1.789×the level of miR-214-3p)-1.5。

根据该公式，我们将102中的每例患者的miRNA score计算出来，并根据cut-offvalue(敏感性和特异性最大值减去1所得)做为截点，将102例中的病例分成高风险组和低风险组。结果显示高风险组的胃癌患者比低风险的患者更易于发生淋巴结转移(图4A)。而后再对高风险组和低风险组进行ROC曲线分析，结果显示以这4种miRNA形成的标志物组具有较好的预测胃癌淋巴结转移的特异性和灵敏性(AUC＝0.760，P<0.0001)，比单一miRNA预测胃癌淋巴结转移的准确性好，如图4B。

实施例4

一种评价胃癌淋巴结转移的试剂盒，包括：

microRNA标志物组；

以及microRNA快速提取试剂、反转录试剂、实时定量PCR试剂、人RNU6B miRNA引物。

上述microRNA快速提取试剂采用Bioteke公司销售的货号RP5301的试剂；反转录试剂(包括反应缓冲液，DNA聚合酶，反转录酶复合物，去离子水)采用TaKaRa公司销售的货号RR066A的试剂；实时定量PCR试剂(包括反应缓冲液，qPCR复合物，去离子水)采用GeneCopoeia公司销售的货号AOMD-Q020的试剂；人RNU6B miRNA引物采用GeneCopoeia公司销售的货号HmiRQP9001的试剂。

所述microRNA标志物组，由miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p构成，miR-27b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR-128-3p的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，miR-100-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

对比例

如实施例4所述的评价胃癌淋巴结转移的试剂盒，不同之处在于：

所述microRNA标志物组，由miR-27b-5p，miR-101-5p，miR-100-5p和miR-145-5p构成，miR-27b-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，miR-101-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，miR-100-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，miR-145-5p的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

实验例

采用实施例4及对比例的试剂盒同时检测了102例胃癌样本中miRNA的表达情况。综合对比例中的4个miRNA，采用Logistic回归模型构建了淋巴结转移的风险公式：

Risk score＝(5.013×expression of miR-27b-5p)+(6.451×expression ofmiR-101-5p)+(0.186×expression of miR-100-5p)-(0.746×expression of miR-145-5p)-1.397。

根据该公式，计算每例患者的风险系数，进行ROC曲线分析，结果显示在102例胃癌样本中，以对比例这4种miRNA形成的标志物组具有虽然较好的区分胃癌淋巴结转移的特异性和灵敏性；但相比于实施例4构成的模型，曲线下面积较小，预测效力较弱，如图5所示。提示实施例4的标志物组预测价值要优于对比例。