一种以牛大力花药为外植体的再生方法

摘要

本发明属植物组培技术领域，涉及一种以牛大力花药为外植体的再生方法，是以牛大力花药为材料经愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导及增殖，将增殖后的胚性愈伤组织诱导形成胚状体，再由胚状体诱导发育形成小植株，最后将小植株进行壮苗培养形成正常植株。本发明以牛大力花药为外植体，通过愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导、胚发育和胚萌发成苗的过程，建立了一种牛大力的再生体系，并创建了子叶型胚的二次诱导体系，能长期提供胚性愈伤组织，可为牛大力诱变育种、转基因育种以及牛大力的产业化发展提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明属植物组培技术领域，涉及一种以牛大力花药为材料的再生方法，具体是一种利用牛大力花药诱导分化胚性愈伤组织后，再诱导胚状体萌发，萌发的胚状体发育为植株的组织培养方法。

背景技术

牛大力(Callerya speciosa)，学名美丽鸡血藤，又名猪脚笠、金钟根、山莲藕、倒吊金钟、大力薯，为豆科(Leguminosae)鸡血藤属(Callerya)植物。牛大力是一种药食两用植物，我国野生分布在广东、广西、云南、福建和海南等地，《本草纲目》记载，牛大力具有健脾润肺、养肾补虚、舒筋活络之功效，适用于肾虚，血气不旺，风湿骨痛，经常咳嗽患有急慢性支气管炎及吸烟人士。国内南方各省，包括香港，民间有时常用牛大力泡酒、煲汤的饮食习惯，能强身健体，增强体质，提高抗病力。随着市场需求量的不断增加，野生资源已经接近枯竭，人工种植已成为牛大力产业化发展的有效途径,如何获取牛大力优良新品种已成为亟待解决的问题。

长期以来牛大力一直处于野生状态，优良新品种稀缺，从杂合度很高的牛大力野生资源中获得纯化株系，需要很长时间的自交过程，严重影响了产业的发展。因此，通过组织培养技术培育牛大力优良无性系是获得牛大力新品(系)种的有效途径。经检索尚未见以牛大力花药为外植体进行再生的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种以牛大力花药为外植体的再生方法，利用牛大力花药进行培养并再生，可以在短时间内纯化牛大力种质，为不同种质间杂交育种提供材料。

本发明所采用的技术方案：

一种以牛大力花药为外植体的再生方法，包括牛大力花药获取、愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导及增殖、胚状体诱导及发育和萌发成苗的过程，其具体步骤如下：

1、外植体获取

在牛大力盛花期，选取花瓣即将露出花萼或露出花萼1mm以内的花蕾，用0.1％HgCl₂消毒10min后，无菌水冲洗4次，吸干水分后取花药；或75％酒精喷雾，于超净工作台吹干后取花药；或直接依次剥掉花萼和部分花瓣，用尖头镊子小心的取花药。污染率低于5％，存活率(不变黑或不变白者)90％以上。

2、愈伤组织及胚性愈伤组织诱导

将获取的牛大力花药接种在愈伤组织培养基上，培养温度24～26℃，暗培养。培养25天时，肉眼可见花药分化出少量愈伤组织；继续培养，60天后，部分愈伤组织形成胚性愈伤组织。所述愈伤组织培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加2,4-D 3.5mg/L以下、6-BA 0.2～2.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。

3、胚性愈伤组织增殖诱导

将胚性愈伤组织转接子叶胚诱导培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育为子叶型胚；将子叶型胚切成2×2～5mm的小块，接入增殖培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养40天后，可二次分化出胚性愈伤组织，从而实现胚性愈伤组织增殖。所述子叶胚诱导培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加6-BA>

4、胚状体的诱导

将增殖后的胚性愈伤组织转接到胚诱导培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育胚状体。所述胚诱导培养基以改良的MS为基本培养基，添加6-BA>

5、胚状体发育诱导及壮苗培养

将诱导出的胚状体单个转接到胚发育培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养90天后，形成具有芽和根的完整小植株。将发育成的小植株转接到壮苗培养基上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养60天后，小植株茎伸长至5cm以上，叶片数2-3，部分展开，根系发育良好，形成壮苗。所述胚发育培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加6-BA>

上述改良的MS培养基是在MS培养基的基础上，在其它成分和含量不变的条件下将肌醇浓度提高到原来的2倍，即肌醇的浓度为200mg/L。

本发明以牛大力花药为外植体，通过愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导、胚发育和胚萌发成苗的过程，建立了一种牛大力的组织培养体系，并创建了子叶型胚的二次胚性愈伤组织诱导体系，能长期提供胚性愈伤组织，可为牛大力诱变育种、转基因育种以及牛大力的产业发展提供技术支持。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

一、牛大力花药培养及植株再生

本发明实施例中所采用的改良的MS培养基是在MS培养基的基础上，将其中的肌醇浓度提高到原来的2倍，即肌醇的浓度为200mg/L，其它成分和含量不变。

实施例一

1、外植体获取

在牛大力盛花期，取花瓣即将露出花萼或露出花萼1mm以内的花蕾，用0.1％HgCl₂消毒10min后，无菌水冲洗4次，吸干水分后，依次剥掉花萼和部分花瓣，用尖头镊子小心的取花药。

2、愈伤组织及胚性愈伤组织诱导

将花药接种在愈伤组织培养基(改良MS+1.5mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上，培养温度24～26℃，暗培养。培养25天时，肉眼可见花药分化出少量愈伤组织；在不更换培养基、不继代的条件下继续培养，60天后，部分愈伤组织形成胚性愈伤组织。

3、胚性愈伤组织增殖诱导

将胚性愈伤组织转接子叶胚诱导培养基(改良MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+1.0mg/L CH+0.5mg/L Glu+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉胶，pH5.8)上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育为子叶型胚。将子叶型胚切成2×2～5mm的小块，接入增殖培养基(改良MS+2.0mg/L>-2·s^-1。培养40天后，多数外植体可分化出胚性愈伤组织，部分外植体可分化出次生子叶型胚。

4、胚状体的诱导

将增殖后的胚性愈伤组织转接到胚诱导培养基(改良MS+0.3mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+1.0mg/L CH+0.5mg/LGlu+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育成胚状体。

5、胚状体发育诱导及壮苗培养

将诱导出的胚状体单个剥离并转接到胚发育培养基(改良MS+0.15mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉胶，pH 5.8)上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养90天后，形成具有芽和根的完整小植株。将发育成的小植株转接到壮苗培养基(改良MS+0.15mg/L>-2·s^-1。培养60天后，小植株茎伸长至5cm以上，叶片数2-3，部分展开，根系发育良好，形成壮苗。

实施例二

1、外植体获取

在牛大力盛花期，取花瓣即将露出花萼或露出花萼1mm以内的花蕾，用75％酒精喷雾，于超净工作台吹干后取花药，依次剥掉花萼和部分花瓣，用尖头镊子小心的取花药。

2、愈伤组织及胚性愈伤组织诱导

将花药接种在愈伤组织培养基(改良MS+2.0mg/L 2,4-D+1.0mg/L 6-BA+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上，培养温度24～26℃，暗培养。培养25天时，肉眼可见花药分化出少量愈伤组织；在不更换培养基、不继代的条件下继续培养，60天后，部分愈伤组织形成胚性愈伤组织。

3、胚性愈伤组织增殖诱导

将胚性愈伤组织转接子叶胚诱导培养基(改良MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+1.0mg/L CH+0.5mg/L Glu+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉胶，pH5.8)上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育为子叶型胚。将子叶型胚切成2×2～5mm的小块，接入增殖培养基(改良MS+2.0mg/L>-2·s^-1。培养40天后，多数外植体可分化出胚性愈伤组织，部分外植体可分化出次生子叶型胚。

4、胚状体的诱导

将增殖后的胚性愈伤组织转接到胚诱导培养基(改良MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+1.0mg/L CH+0.5mg/LGlu+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育成胚状体。

5、胚状体发育诱导及壮苗培养

将诱导出的胚状体单个剥离并转接到胚发育培养基(改良MS+0.2mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉胶，pH 5.8)上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养90天后，形成具有芽和根的完整小植株。将发育成的小植株转接到壮苗培养基(改良MS+0.2mg/L>-2·s^-1。培养60天后，小植株茎伸长至5cm以上，叶片数2-3，部分展开，根系发育良好，形成壮苗。

实施例三

1、外植体获取

在牛大力盛花期，取花瓣即将露出花萼或露出花萼1mm以内的花蕾，直接在超净工作台上剥取花药：依次剥掉花萼和部分花瓣，用尖头镊子小心的取花药。

2、愈伤组织及胚性愈伤组织诱导

将花药接种在愈伤组织培养基(改良MS+3.0mg/L 2,4-D+1.5mg/L 6-BA+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上，培养温度24～26℃，暗培养。培养25天时，肉眼可见花药分化出少量愈伤组织；在不更换培养基、不继代的条件下继续培养，60天后，部分愈伤组织形成胚性愈伤组织。

3、胚性愈伤组织增殖诱导

将胚性愈伤组织转接子叶胚诱导培养基(改良MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+1.0mg/L CH+0.5mg/L Glu+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉胶，pH5.8)上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育为子叶型胚。将子叶型胚切成2×2～5mm的小块，接入增殖培养基(改良MS+2.0mg/L>-2·s^-1。培养40天后，多数外植体可分化出胚性愈伤组织，部分外植体可分化出次生子叶型胚。

4、胚状体的诱导

将增殖后的胚性愈伤组织转接到胚诱导培养基(改良MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+1.0mg/L CH+0.5mg/LGlu+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养60～90天，部分胚性愈伤组织发育成胚状体。

5、胚状体发育诱导及壮苗培养

将诱导出的胚状体单个剥离并转接到胚发育培养基(改良MS+0.4mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+10％CW+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉胶，pH 5.8)上，培养条件：温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1。培养90天后，形成具有芽和根的完整小植株。将发育成的小植株转接到壮苗培养基(改良MS+0.3mg/L>-2·s^-1。培养60天后，小植株茎伸长至5cm以上，叶片数2-3，部分展开，根系发育良好，形成壮苗。

二、牛大力花药培养效果鉴定

1、愈伤组织诱导效果鉴定

为鉴定牛大力花药诱导形成愈伤组织、胚性愈伤组织的效果，对上述实施例的诱导分化情况进行观察，统计花药诱导愈伤组织诱导数、胚性愈伤组织数，计算诱导率，结果见表1。

表1牛大力花药诱导情况

上述结果表明，本发明采用牛大力花药作为外植体诱导形成愈伤组织，继续培养后，愈伤组织形成胚性愈伤组织，具有较高的诱导率。

2.子叶胚诱导及增殖效果鉴定

为鉴定胚性愈伤组织诱的增殖效果，对上述实施例的胚性愈伤组织诱导子叶胚及子叶胚切块诱导增殖情况进行观察，统计诱导数，计算诱导率、增殖系数，结果见表2、表3。

表2子叶胚的诱导情况

项目胚性愈伤组织块数形成子叶胚的块数诱导率实施例一10220％实施例二10440％实施例三10330％

表3子叶胚的增殖情况

项目子叶胚切块数形成胚性愈伤组织的块数诱导率增殖系数实施例一1005050％120倍实施例二1009090％150倍实施例三1007638％140倍

上述结果表明，本发明利用胚性愈伤组织诱导形成子叶胚后，诱导子叶胚二次分化胚性愈伤组织的方式进行增殖，效果明显。

3、胚性愈伤组织的发育效果鉴定

为考察增殖后的胚性愈伤组织的发育情况，对上述实施例中胚性愈伤组织诱导成胚状体情况进行观察，统计胚状体数，计算诱导率。结果见表4。

表4胚性愈伤组织的发育情况

项目胚性愈伤组织块数形成胚状体的块数诱导率实施例一2005628％实施例二2008040％实施例三2006432％

上述结果表明，本发明以增殖后的胚性愈伤组织为材料，诱导形成胚状体的效果较为明显，诱导率最高可达40％。

4、胚状体发育及壮苗培养效果鉴定

为鉴定所胚状体的发育情况，对上述实施例中的胚状体进行诱导培养，并对萌发的胚状体进行壮苗培养，统计萌发数和壮苗数，计算萌发率及壮苗形成率，结果见表5。

表5胚状体萌发及壮苗培养情况

上述结果表明，本发明利用胚状体诱导形成小植株并进行壮苗培养，具有较高的胚状体萌发率和壮苗形成率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。