通过检测HURP1基因表达分析对虾是否受缺氧胁迫的方法

摘要

本发明提供了一种通过检测HURP1基因表达分析对虾是否受缺氧胁迫的方法，其步骤如下：步骤一.获得凡纳滨对虾HURP1基因的开放阅读框序列，并设计、合成序列特异性的荧光定量PCR引物；步骤二.获得拟进行检测的凡纳滨对虾血淋巴细胞，提取其总RNA并逆转录为cDNA，制备荧光定量PCR模板；步骤三.进行荧光定量PCR分析，以分析凡纳滨对虾血淋巴细胞中HURP1的表达情况。本发明的方法可通过检测HURP1基因的表达情况，更简便、更快捷、更准确地判断凡纳滨对虾是否处于低氧胁迫状态。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种通过检测HURP1基因的表达来分析凡纳滨对虾是否处于低氧胁迫状态的方法。

背景技术

海洋无脊椎动物对虾属中的对虾(Litopenaeus vannamei)是我国水产养殖的重要种类。2015年，全球养殖对虾产量达330万吨，其中，我国养殖对虾产量为150万吨，为世界对虾养殖第一大国。我国主要养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)和日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)4种对虾，其中凡纳滨对虾是主要养殖种类，约占养殖对虾总产量90％。

在对虾养殖水体中，氧气由各种生物或非生物因素消耗,各种因素消耗的氧气占总耗氧量的比例变动很大。研究发现虾池中中国明对虾、水体和沉积物耗氧分别占总耗氧的3.74％、17.35％和78.91％，而在工厂化凡纳滨对虾养殖中，对虾和水体耗氧分别占72.67％和27.33％。也有学者也认为虾池中对虾耗氧只占总氧消耗的很小部分，而异养细菌、浮游生物和沉积物消耗的氧占总耗氧的绝大部分。Madenjian估算虾池中沉积物和水体的氧消耗分别占总耗氧的51％和45％，是池塘耗氧的主要因素。另也有学者估算，在养殖后期对虾、水体和沉积物消耗的氧气分别占池塘总耗氧的34％、35％和30％。因此，在对虾养殖池塘中溶解氧并非主要被养殖对象消耗，而是被养殖环境中的微生物、浮游生物和化学物质所消耗。只有在高密度的养殖系统中，养殖生物才能成为溶氧的主要消耗者。养殖水体的缺氧主要与浮游生物暴发和自身污染导致的水体和底质耗氧增加有关。由于生物和理化因素的综合作用，虾池也经常出现溶解氧不足的现象。溶氧不足容易给凡纳滨对虾造成低氧胁迫，从而对凡纳滨对虾的生长速度、免疫功能具有不良影响，常给对虾养殖业造成损失。由于对虾吸收、利用水中溶氧受到其他多种理化因子，比如温度或氨氮浓度的影响，因此水中溶氧量与凡纳滨对虾体内的溶氧量没有直接的相关性，故难以直接从养殖水体的溶氧量确定凡纳滨对虾体是否发生低氧胁迫。而目前仍缺乏简单、快捷而准确的判断凡纳滨对虾是否处于低氧胁迫状态的方法。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种简单、快捷、准确的分析凡纳滨对虾是否受低氧胁迫的方法。

为实现以上目的，本发明提供了如下技术方案：

一种通过检测HURP1(低氧上调表达蛋白1)基因表达分析凡纳滨对虾是否受缺氧胁迫的方法，其步骤如下：

步骤一.获得凡纳滨对虾HURP1基因的开放阅读框序列，并设计、合成序列特异性的荧光定量PCR引物；

步骤二.获得拟进行检测的凡纳滨对虾血淋巴细胞，提取其总RNA并逆转录为cDNA，制备荧光定量PCR模板；

步骤三.进行荧光定量PCR分析，以分析凡纳滨对虾血淋巴细胞中HURP1的表达情况。

由于凡纳滨对虾HURP1基因表达水平与低氧胁迫相关，通过检测HURP1的表达水平，能够敏感地反映对虾的低氧胁迫状况。HURP1的表达水平越高，则表明存在低氧胁迫状况。

作为一种优选的实施方式，所述步骤一中的所述荧光定量PCR引物的核苷酸序列如下：

QPCR-LvHURP1-F：GCCTCTTCAACCATAGCGACC；

QPCR-LvHURP1-R：ATTTCCAGCCCGCCTAATGTA。

作为一种优选的实施方式，所述步骤二的具体操作为：增加水体溶氧至5mg/L以上，抽取拟检测的凡纳滨对虾的血淋巴，通过800rpm离心10分钟获得其血淋巴细胞；提取血淋巴细胞总RNA，并将其逆转录为实时荧光定量的cDNA，制备荧光定量PCR模板。

更优选地，逆转录反应的反应体系如下：Buffer 2 4.0μl，RTPrimer Mix1.0μl，PrimeRT Enzyme Mix I 1.0μl，去基因组DNA反应液10μl，RNaseFree dH₂O4.0μl，总体积为20μl。

优选地，所述去基因组DNA反应液由5×gDNA Eraser Buffer 2.0μl、gDNA Eraser1.0μl、总DNA 1.0μg、及RNase Free dH₂O补足组成。

作为一种优选的实施方式，所述步骤三的PCR反应液组成为：Premix ExTaqTM5.0μl，10μM的正向引物0.2μl，10μM的反向引物0.2μl，cDNA模板1.0μl，无菌dH₂O>

作为一种优选的实施方式，所述步骤三按照如下程序进行PCR扩增：程序1：95℃、10秒、温度变化速率为4.8℃/s、循环数为1；程序2：95℃、5秒、温度变化速率为4.8℃/s，57℃、20秒、温度变化速率为2.5℃/s，78℃、1秒、温度变化速率为4.8℃/s，循环数为40；程序3：95℃、1秒、温度变化速率为4.8℃/s，65℃、15秒、温度变化速率为2.5℃/s，95℃、0秒、温度变化速率为0.11℃/s，循环数为1。

实验结果表明，相比于现有技术，特别是传统的基于乳酸含量测量的方法，本发明的方法可通过检测HURP1基因的表达情况，更简便、更快捷、更准确地判断凡纳滨对虾是否处于低氧胁迫状态。

附图说明

图1为通过荧光定量PCR检测实验组和对照组对虾血淋巴细胞中HURP1基因表达水平的结果。

图2为实验组和对照组对虾血浆中乳酸水平检测结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。如未特别指出，本发明所使用的试剂和样品均可通过商业渠道获得。

实施例

一、实验样品的获取

挑选规格整齐的凡纳滨对虾(约7g/头)400头，随机平分为实验组和对照组，每组对虾200头。对照组充分打氧，每两小时利用溶氧仪检测一次，确保水体溶氧在5mg/L以上；实验组采用水体充氮气结合打氧的方法，控制水体溶氧在1.2mg/L(一般认为水体溶氧1.2mg/L是凡纳滨对虾所能接受的溶氧的下限)，每两小时利用溶氧仪检测一次。当实验组水体溶氧降低至1.2mg/L开始计时，在实验开始的3、6、9、12、18、24、36、48及72小时取凡纳滨对虾血淋巴样品(每5头虾的血淋巴混合为一个样品以尽量消除对虾间的个体差异；每个时间点采集3个样品)。对照组在实验组对应的时间点取样。含有固定量抗凝剂(NaCl350mM、KCl 10mM、EDTA-2Na 10mM、HEPES 10mM,pH7.3)的血淋巴800rpm离心10min，沉淀物加入RNAlater，轻柔重悬，-80℃备用；上清液放入液氮中冷冻，之后置于-35℃待血淋巴乳酸含量分析。

二、凡纳滨对虾血淋巴细胞总RNA提取

1)提前将要提取的凡纳滨对虾组织从-80℃冰箱中取出，置于室温融化期间准备好足量研钵、无RNase的1.5ml、2ml EP管，并在管盖上做好相应标记；

2)用液氮将研钵预冷至液氮不再迅速挥发时，从RNAlater中取出血淋巴细胞约30mg加入至研钵中，在液氮充足的条件下研磨成粉末；

3)待液氮刚挥发完全时向组织已充分研磨的研钵中加入600μl Buffer RLT(其中按1％的比例加入了β-巯基乙醇并混匀使用)，均匀覆盖，迅速加入液氮，继续研磨成粉末状，血细胞或其他细胞提取时可直接加入RLT，进行步骤④操作；

4)待研钵温度上升至粉末溶解后，迅速用1ml注射器将样品液转移到已预冷的对应标记的2ml无RNase EP管中，并小心抽打样品液10次左右，尽量避免气泡产生；

5)将抽打充分的样品液置入离心机，20～25℃，13000rpm离心3min；

6)将离心后的上清液小心的转移到对应标记的2ml无RNase EP管中，注意不要吸到沉淀，加入等体积的70％乙醇(预先用已灭菌DEPC水与无水乙醇配置，室温保存)，混匀。

7)取700μl上述混合液加入到RNeasy spin column中，20～25℃，8000g离心15s，弃滤液，重复操作此步骤，直至所有的混合液都过柱；

8)向RNeasy spin column中加入350μl Buffer RW1，20～25℃，8000g离心15s，弃滤液；

9)按1：7的比例(体积比)将DNase溶液加入至Buffer RDD中，小心的将80μl混合酶液加到RNeasy spin column上的膜正中央，室温静置15～20min；

10)向RNeasy spin column中再次加入350μl Buffer RW1，20～25℃，8000g离心15s，弃滤液；

11)向RNeasy spin column中加入500μl Buffer RPE，20～25℃，8000g离心15s，弃滤液；重复本步骤一次；

12)将RNeasy spin column放入至一个新的2ml收集管中，20～25℃，12000rpm离心1min；

13)将RNeasy spin column转移到试剂盒提供的对应标记的新的1.5ml无RNaseEP管中，小心向膜中央加入30μl试剂盒提供的RNase-free H₂0，静置2min，20～25℃，12000rpm离心1min，收集RNA提取液，置于-80℃备用；

14)RNA质量鉴定：测OD值，获得所提RNA的浓度；琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带情况。

三、荧光定量PCR模板制备

使用逆转录试剂盒(TaKaRa定量分析模板合成试剂盒)：RT reagentKit With gDNA Eraser(Perfect Real Time)将所提凡纳滨对虾的总RNA逆转录为实时荧光定量的cDNA模板，其具体操作步骤如下：

(1)去基因组DNA

在0.2ml的无RNase的EP管中配置如下反应体系(冰上操作)：

轻柔混匀并短暂离心，42℃静置2min或者室温静置5～30min，继续如下反应或者暂时置于4℃；

(2)逆转录反应：

配置如下反应体系(冰上操作)：

轻柔混匀并短暂离心，置于PCR仪中进行如下反应：37℃孵育15min，85℃加热5s。

逆转录所得的cDNA模板可于-20℃保存三个月或者-80℃长期保存备用。

四、实验组和对照组的各时间点样品中LvHUPR1的相对表达量定量分析

试剂盒：Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)；

分析软件：Roche LightCycler 480软件。

将cDNA模板作为母液进行梯度稀释5、25、125、625、3125倍，稀释所得5个梯度的cDNA稀释液作为预实验模板。

选择凡纳滨对虾持家基因EF-1α(LvEF1α，GenBank accession No.GU136229)作为内参，通过RACE-PCR获得凡纳滨对虾HURP1基因的开放阅读框序列，利用Primer Premier5.0软件设计LvEF-1α及LvHURP1基因定量引物，具体引物信息如下：

Primers of LvHURP1for Real-Time PCR

按照如下反应体系配置PCR反应液(冰上操作)：

反应体系配备完全后，混匀离心后加入对应384孔中，封膜，4℃，水平转子4000g离心3min，按如下程序进行PCR扩增：

分析实验数据，制作标准曲线并确定目的基因的扩增效率，选择最适宜稀释倍数模板，按照预实验反应体系和程序进行正式实验。每个样品3个平行。

图1示出了荧光定量PCR检测实验组和对照组对虾血淋巴细胞中LvHURP1基因表达水平。其中，EF1-α为内参。对虾血淋巴细胞与血蓝蛋白(对虾的携氧蛋白)密切接触，能够敏感地反映对虾的低氧胁迫状况。故本发明采用的是检测凡纳滨对虾血淋巴细胞中HURP1基因表达水平。如图1所示，实验组(即低氧胁迫组)血淋巴细胞中LvHURP1基因自实验开始6小时起其表达水平显著高于对照组。显著性分析采用Student’s t-检验(**表示与对照组比较p<0.01)，柱子上的短棒表示平均值±S.D(n＝3)。

利用乳酸脱氢酶活性检测试剂盒测量两组(对照组和实验组)对虾血浆中乳酸含量，验证本发明所用方法的有效性。

图2示出了实验组和对照组对虾血浆中的乳酸水平，用于验证凡纳滨对虾HURP1基因表达水平与低氧胁迫的相关性。乳酸是无氧糖酵解的产物，通常用于判断个体的无氧呼吸水平，是一种传统的分析机体是否发生缺氧的方法，但操作过程较为繁琐且需要专门的乳酸脱氢酶活性检测试剂盒。如图2所示，实验组(即低氧胁迫组)血浆中乳酸含量自实验12小时起其含量显著高于对照组。显著性分析采用Student’s t-检验(**表示与对照组比较p<0.01)，柱子上的短棒表示平均值±S.D(n＝3)。

由此可见，与现有的分析方法相比，本发明的方法更加简单、快捷、准确、灵敏。

序 列 表

<110> 中山大学

<120> 通过检测HURP1基因表达分析对虾是否受缺氧胁迫的方法

<160> 2

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400> 1

gcctcttcaa ccatagcgac c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400> 2

atttccagcc cgcctaatgt a 21