烟草受激素诱导和逆境胁迫相关基因的克隆与表达分析

摘要

烟草(Nicotiana tabacum)是转基因的模式植物，也是我国重要的经济作物，每年为国家经济发展做出重要贡献，但烟草生产上因受逆境胁迫和病虫危害每年损失很大。分离鉴定烟草受非生物胁迫如激素和环境胁迫诱导的功能基因，对揭示其抗逆分子机制和烟草抗逆遗传改良有重要意义。本实验室通过激素、低温和干旱胁迫已分离获得三个相关转录因子和一些抗逆胁迫功能基因，本文在此基础上研究这些基因的全长序列和表达特征，结果如下：
　　 1．AP2/ERF类转录因子是植物中特有的一类转录因子，结构上具有相似的特征，在调控乙烯应答以及抗病相关基因的表达中起重要作用。本研究通过454测序分离得到了一个烟草AP2/ERF转录因子类基因，通过RACE方法克隆获得了该基因的全长cDNA序列，从烟草基因组扩增获得了其DNA序列，分析了该基因的结构，发现其含有2个内含子，3个外显子。对该基因进行了初步生物信息学分析。同源性分析表明NtAP2/ER目的DNA结合域是相当保守的，进化上属于AP2/ERF家族转录因子。半定量RT—PCR发现NtAP2/ERF在烟草各器官中的表达量差异不大，但在不同处理诱导后的表达模式不一样，受乙烯和干旱诱导表达量较大，说明烟草AP2/ERF可能还参与乙烯应答以外的胁迫信号反应。
　　 2．通过基因芯片杂交结果分离得到了一个烟草CDI(Cyclin—dependent kinaseinhibitor)类基因，利用RACE方法克隆获得了该基因的全长，命名为NtCDI1，该基因核苷酸长度为：905 bp，编码蛋白长度为：211 aa，同时从烟草基因组扩增该基因，获得了它的DNA序列，长度为：1405 bp，分析该基因结构，发现其含有3个内含子。另外对该基因的相关生物信息学进行了初步分析，如分子量、等电点、疏水性、同源性、细胞定位，同源性分析表明该基因的CDI结构域是相当保守的。半定量RT—PCR对该基因的组织器官特异性和不同处理诱导后的表达模式进行了鉴定，发现该基因在烟草不同器官中和不同处理诱导后的表达量不一样。
　　 3．通过烟草454测序分离获得了一个含basic helix—loop—helix(bHLH)结构的基因，根据已知的EST序列设计引物，利用RACE技术克隆了其5’端和3’端未知序列。该基因编码243个氨基酸，具有bHLH结构域和LCD1结构域，同源性分析表明，该基因bHLH结构域在进化过程中是相当保守的。从全长cDNA两头设计引物，PCR扩增烟草cDNA和烟草基因组，获得了该基因不同拷贝的cDNA序列和DNA序列，分析该基因结构，发现其有5个外显子。半定量RT—PCR分析表明，该基因在烟草根中的表达量最大，茎、叶、花、果中表达量小；水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、乙烯利处理和干旱胁迫下该基因表达量增大，低温胁迫下该基因表达量降低。
　　 4．通过RACE方法克隆了一个烟草Germin—like基因的全长cDNA序列，核苷酸长度为925 bp，开放阅读框长687 bp，共编码228个氨基酸，具有一个cupin结构域。基因组扩增和结构分析表明，该基因含有2个外显子和一个内含子。通过生物信息学初步揭示了该基因的分子量、等电点、疏水性、细胞定位、空间结构和同源性。半定量RT—PCR分析表明该基因主要在烟草根中表达，水杨酸、乙烯利、低温和干旱处理都能使该基因的表达量增大，脱落酸对该基因的表达量影响不大。构建了该基因的病毒诱导沉默载体，为研究该基因的功能提供了条件。
　　 5．通过烟草454测序分离得到了一个LEA基因片段，利用半定量RT—PCR和基因芯片分析了该基因的时空表达特征和受多种激素和环境胁迫时的表达模式。该基因在烟草果实中表达量最大，而在其它器官中的表达量较小；该基因除了受水杨酸诱导下调表达外，其它胁迫表现上调表达，但上调表达的模式各不一样，ABA和低温处理使基因上调表达比较明显。研究结果表明，该基因主要参与烟草果实和种子的发育；在干旱、低温等逆境胁迫下可能起保护。这为进一步克隆和研究该基因功能奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

第一章 植物抗逆基因研究进展

1.抗逆功能基因

1.1 渗透调节相关的功能基因

1.2 具有解毒作用的功能基因

1.3 保护生物大分子和细胞膜结构的功能基因

2.抗逆调控基因

2.1 感应和转导胁迫信号的蛋白激酶

2.2 传递信号和调控基因表达的转录因子

3.植物抗逆基因分离策略

3.1 基于胁迫前后mRNA表达差异的分离发法

3.2 基于基因图谱和基因序列的分离方法

3.3 基于基因加标签的分离方法

3.4 基于基因产物的分离方法

3.5 基因组学/蛋白组学/生物信息学分离方法

4.展望

参考文献

第二章 烟草AP2/ERF转录因子基因的克隆与表达分析

1.材料和方法

1.1 实验材料准备

1.2 实验方法

2.结果与分析

2.1 利用RACE获得了AP2/ERF基因的全长

2.2 烟草AP2/ERF基因的组成和结构分析

2.3 烟草AP2/ERF基因理化特征和功能域预测

2.4 烟草AP2/ERF基因功能域三级结构预测及分析

2.5 NtAP2/ERF1基因的演化分析

2.6 NtAP2/ERF基因的表达特征

3.结论与讨论

参考文献

第三章 烟草CDI基因的克隆与表达分析

1.材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2.结果与分析

2.1 烟草CDI基因的全长克隆与测序分析

2.2 NtCDI蛋白的理化和生物学特征预测

2.3 NtCDI1基因的同源性分析

2.4 NtCDI基因表达特征及其与环境胁迫的关系

3.结论与讨论

参考文献

第四章 烟草受水杨酸和脱落酸诱导的bHLH基因的克隆与表达分析

1.材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2.结果与分析

2.1 烟草bHLH基因全长cDNA和gDNA克隆及序列分析

2.2 NtbHLH蛋白的理化和生物学特征预测

2.3 NtbHLH1基因的演化分析

2.4 烟草NtbHLH基因的表达特征鉴定

3.结论与讨论

参考文献

第五章 烟草GLP基因的克隆、表达分析及沉默载体的构建

1.材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2.结果与分析

2.1 烟草GLP基因全长cDNA和gDNA克隆及序列分析

2.2 NtGLP1蛋白的理化和生物学特征预测

2.3 NtGLP1基因的同源性分析

2.4 烟草GLP基因的半定量RT-PCR分析

3.NtGLP基因VIGS载体的构建

4.结论与讨论

参考文献

第六章 烟草LEA基因的表达分析

1.材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2.结果与分析

2.1 烟草LEA基因的生物信息学分析

2.2 RNA的提取

2.3 cDNA合成和RT-PCR分析

2.4 基因RT-PCR结果与芯片杂交结果比较

3.结论与讨论

参考文献

致谢