通用探针基因检测方法及该探针和该探针的用途

摘要

本发明公开一种通用探针基因检测方法及该探针和该探针的用途，上游引物中具有一段与通用探针配对的序列，并且，还具有一段内含与拟检测的基因特性的序列相互补的序列，于是本发明的对拟检测的具有基因特性的序列由上游引物承担；面对不同的拟检测的基因模板，需要检测不同的拟检测的基因特性序列时，只需调整上游引物中与该拟检测的基因特性序列相互补的部分即可，上游引物中与探针配对的部分不必调整，所以，可以达成使用同一探针检测不同拟检测的基因特性序列，即达成了通用探针检测基因的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种通用探针基因检测方法及该探针和该探针的用途。

背景技术

目前，采用基于基因扩增的基因特性检测缺乏体系通用性，对于不同的拟检测的基因模板必须设计与之相对应的探针。理论上，每更换一次拟检测的基因模板就需要重新设计和制备一条新探针。这一方面造成成本增加，另一方面，由于不同实验室对于同一拟检测的基因模板用的检测探针序列也可能各异，导致越来越难以比较不同时间、不同品牌检测探针所获得的结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通用探针基因检测方法，以便实现对不同的拟检测的基因模板采用相同的检测探针，消除现有技术中的不足。

为了达成本发明的上述目的，本发明的技术方案如下。

通用探针检测基因的方法，该方法适用于基于基因扩增的基因特性检测，所述通用探针是不与拟检测的基因模板配对的一段序列；上游引物中具有一段与所述通用探针配对的序列，上游引物中还具有一段内含与拟检测的基因特性的序列相互补的序列；所述通用探针带有修饰基团；在所述基因扩增的过程中，检测所述修饰基团的信号即能检测到拟检测的基因特性。

图1示意了本发明方法的实现原理，示意了一个通用探针10以及上游引物20在本发明检测方法中的演变，a至g共7处示意中实心箭头连接着相邻的过程。

图1中，通用探针10具有一段探针序列11以及第一修饰基团12和第二修饰基团13；在本示意图中，第一修饰基团12为荧光基团，第二修饰基团13为淬灭基团；探针序列11是不与拟测基因模板30配对也不与互补拟测基因模板40配对的一段序列；上游引物20中具有一段与探针序列11配对的探针互补序列21以及一段与拟测基因模板30的拟测基因特性序列配对的拟测基因互补序列22；拟测基因模板30的5’端是拟测基因特性序列32，该拟测基因特性序列32即是检测的目标基因。

如图1，在一个PCR的退火过程中，PCR载液中的游离的上游引物20与游离的通用探针10配对，展平通用探针10，使其荧光基团12与淬灭基团13分离，荧光基团12发出荧光信号，这一过程展示在a和b中。随后，上游引物20携带通用探针10与拟测基因模板配对，c和d示意的拟测基因模板从退火到延伸的变化；在后续步骤中示意PCR变性阶段，变性后获得a中的通用探针(回归游离状态)、c中的拟测基因模板、d中的反向互补基因模板；变性后又再次进行退火和延伸，如f、g所示，下游引物50与反向互补基因模板配对，通用探针10被延伸出新的拟测基因模板30竞争性阻断，重新游离在PCR载液中。由于上游引物20嵌入到反向互补基因模板40中无法回归到游离状态，所以经过图1所示的一轮PCR反应过程，PCR载液中游离的上游引物20减少了，因为能够和通用探针10配对的上游引物20不断减少，游离状态的通用探针10缺少了配对基础，随着PCR循环次数的增加，这减少越趋明显，更多的通用探针10智能处于游离的卷曲状态，能够检测到的荧光信号越来越少。

如上所述，该技术方案是技术方案一，主要对上游引物和通用探针赋予本发明的精神，若将该精神转而赋予在下游引物和通用探针上能够得到如下技术方案二。

通用探针检测基因的方法，该方法适用于基于基因扩增的基因特性检测，所述通用探针是不与拟检测的基因模板配对的一段序列；下游引物中具有一段与所述通用探针配对的序列，下游引物中还具有一段内含与拟检测的基因特性的序列相互补的序列；所述通用探针带有修饰基团；在所述基因扩增的过程中，检测所述修饰基团的信号即能检测到拟检测的基因特性。

在尊重以上发明精神的基础上，具体的实施方式还可以包括以下情况。

在某些实施中，优选地，所述基因扩增是聚合酶链式反应。

在某些实施中，优选地，所述修饰基团是荧光基团。

在某些实施中，优选地，所述通用探针是一段寡核苷酸。

在某些实施中，优选地，所述通用探针的Tm值为50-72度。

在某些实施中，优选地，所述基因特性检测尤指SNP检测。

采用本发明提供的如上各技术方案后，由于本发明的上游引物(或下游引物)中具有一段与通用探针配对的序列，并且，还具有一段内含与拟检测的基因特性的序列相互补的序列，于是本发明的对拟检测的具有基因特性的序列由上游引物(或下游引物)承担；面对不同的拟检测的基因模板，需要检测不同的拟检测的基因特性序列时，只需调整上游引物(或下游引物)中与该拟检测的基因特性序列相互补的部分即可，上游引物(或下游引物)中与探针配对的部分不必调整，所以，可以达成使用同一探针检测不同拟检测的基因特性序列，即达成了通用探针检测基因的效果。

基于本发明的上述发明精神，本发明还提供一种通用探针，该通用探针的技术方案如下。

通用探针，适用于基于基因扩增的基因特性检测，所述通用探针是与上游引物或下游引物配对但不与拟检测的基因模板配对的一段序列；所述通用探针带有修饰基团。

在某些实施中，优选地，所述修饰基团是荧光基团。

基于本发明的上述发明精神，本发明还提供一种通用探针的用途，用于作为前述技术方案中的通用探针。

本发明人已经在此发明内容章节总地描述了本发明的精神；以下实施例的举例是为了方便本领域普通技术人员进一步了解本发明的实施过程所进行的描述，不能理解为对本发明精神具体化的限制。

附图说明

图1是本发明通用探针检测基因的方法的原理图；

图2a是实施例一梯度稀释DNA样本的扩增曲线；

图2b是实施例一梯度样本扩增曲线的Ct值与其DNA起始拷贝数的对数函数图；

图3a为实施例二SNP(rs9904341)位点CC基因型扩增曲线图；

图3b为实施例二SNP(rs9904341)位点GG基因型扩增曲线图；

图3c为实施例二SNP(rs9904341)位点CG基因型扩增曲线图；

图3d为实施例二SNP(rs9904341)位点空白对照扩增曲线图；

图4为实施例三SNP(rs4784227、rs1219648、rs3803662、rs12313763)位点T-G-T-C单倍型的扩增曲线图。

附图标记说明：

10探针序列 11第一修饰基团 12第一修饰基团 13第二修饰基团 20上游引物

21探针互补序列 22拟测基因互补序列 30拟测基因模板 31下游引物序列

32拟测基因特性序列 40互补拟测基因模板

具体实施方式

实施例一

本实施例选择丙型肝炎病毒(HCV)coreprotein基因(GenBank登录号为：DQ155481)作为检测目标，依据本发明的精神，设计相应的引物及通用探针，序列如下：

上游引物：GGACAAACGGGCAACATACCTTCATAAATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT

下游引物：AAAGGACCCAGTCTTCCCG

通用探针：FAM-AAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC-BHQ

选择用量为2×106copies/ul、2×105copies/ul、2×104copies/ul、2×103copies/ul、2×102copies/ul、2×101copies/ul(10倍梯度稀释)的人工构建的HCVcoreprotein基因质粒标准品作为反应模板。10μLPCR反应体系内含2μL人基因组模板，10mmol/LTris-HClpH8.3，50mmol/LKCl，0.5UTaq酶，3.5mmol/LMg2+，0.45μmol/L通用探针，0.3μmol/L上游引物，0.3μmol/下游引物。PCR反应程序为：95℃3分钟；95℃15秒，58℃20秒，72℃20秒，50个循环；58℃退火阶段采集荧光信号。

本实施例的原始扩增曲线不同于传统的实时扩增曲线，呈现“倒置”的曲线图，即随着PCR循环数的增加，本底期(在PCR反应早期，此时扩增产生的荧光信号不能与背景信号明显地区别，故称为本底期)之后的荧光值逐渐减弱，通过数据处理获取正常的扩增曲线图，从而实现检测，结果见图2a和图2b。

如图2a所示，10倍梯度稀释样本的扩增曲线1A体现较好的梯度，2A(阴性对照，没有模板的存在，即为ddH2O)无特异产物的扩增，故检测不到特异信号。4×106copies模板用量的反应管的Ct值为18.57(Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。)、4×105copies模板用量的反应管的Ct值为21.32、4×104copies模板用量的反应管的Ct值为24.66、4×103copies模板用量的反应管的Ct值为28.43、4×102copies模板用量的反应管的Ct值为31.59、4×101copies模板用量的反应管的Ct值为34.2。可见，相邻梯度模板用量的Ct值差约为3.3(理论上，扩增效率为100％时，模板用量差异10倍时Ct值差为3.3)，结果表明该体系具有较高的反应效率。梯度样本扩增曲线的Ct值与其DNA起始拷贝数的对数有很好的线性关系(R2＝0.99675)，体现该技术较强的定量检测能力(图2b)。

实施例二

本实施例选择SNP(rs9904341)为研究对象，设计相应引物及通用探针，序列如下：

上游引物F-1:CGGGAAGACTGGGTCCTTTCGCCAGATTTGAATCGCG

下游引物R-1:TGAATGTAGAGATGCGGTGGTCC

通用探针P-1:FAM-AAAGGACCCAGTCTTCCCG-BHQ

上游引物F-2:TAGGTGTGGGCAGGGACGAGC

下游引物R-2:ACGACACTCATACTAACGCCATCCTCTGCCAACGGGTCCG

通用探针P-2:HEX-ATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT-BHQ

其中上游引物F-1中：双下划线为附加序列4，下划线为特异检测序列5。

下游引物R-1中：波浪线为特异检测序列2。

上游引物F-2中：波浪线为特异检测序列5。

下游引物R-2中：双下划线为附加序列4，下划线为特异检测序列2。

体系中通用探针P-1的5’端标记FAM基团，3’端标记BHQ基团，用于检测G基因型；通用探针P-2的5’端标记HEX基团，3’端标记BHQ基团，用于检测C基因型。

选取53个未知基因型的样本利用上述引物和通用探针对这53个样本进行SNP分型并进行统计。

Sanger测序是一种较公认基因检测标准，为了检测本发明方法的准确性，利用上述引物对这53个样本进行扩增并进行Sanger测序。Sanger测序法与专利法结果统计见表1。

表1

两个荧光通道FAM和HEX，分别检测基因型G(1A、1B、1C、1D)和基因型C(2A、2B、2C、2D)：图3a中1A无特异信号、2A出现倒置曲线，故该样本是CC型；图3b中1B有倒置曲线、2B无特异信号，故该样本是GG型；图3c中1C、2C均有倒置曲线，故该样本是CG型；图3d是空白对照，可见1D、2D均无特异信号。该方法可以在一管体系内完成一个SNP位点三种基因分型的检测，通过对比测序结果，该方法分型准确率达98％，体现出该技术较强的分型能力。

实施例三

本实施例选择4个SNP(rs4784227，rs1219648，rs3803662,rs12313763)作为研究对象，特异检测T-G-T-C单倍型，依据说明书中所述原则及实验需求，设计相应引物及通用探针，序列如下：

rs4784227：

上游引物F-1:CGGGAAGACTGGGTCCTTTAAAAGTCCCAATTTGTAGTGTTTGCT

下游引物R-1:GGGCTTCAACACAGTCAGTTC

通用探针P-1:ROX-AAAGGACCCAGTCTTCCCG-BHQ

rs1219648：

上游引物F-2:ACGACACTCATACTAACGCCATCACGCCTATTTTACTTGACACACG

下游引物R-2:CTGGACAGGTCATTGTGGTG

通用探针P-2:CY5-ATGGCGTTAGTATGAGTGTCGT-BHQ

rs3803662：

上游引物F-3:TCGTACCCAGAGTAACGCGCTCTCCTTAATGCCTCTATAGCTGTCT

下游引物R-3:TCCCCAAGGAGACAAAGGTA

通用探针P-3:FAM-CGCGTTACTCTGGGTACGA-BHQ

rs12313763：

上游引物F-4:ATCACGGACCCTTGAAACGAACTAATGTATAGAAGGCATCATC

下游引物R-4:GCCTGAAGAGAAACATAAAGAATCC

通用探针P-4:HEX-TTTCAAGGGTCCGTGAT-BHQ

其中上游引物F-1:双下划线为附加序列4，下划线为特异检测序列5。

下游引物R-1：波浪线为特异检测序列2。

通用探针P-1:5’端标记ROX基团，3’端标记BHQ基团。

上游引物F-2:双下划线为附加序列4，下划线为特异检测序列5。

下游引物R-2：波浪线为特异检测序列2。

通用探针P-2:5’端标记CY5基团，3’端标记BHQ基团。

上游引物F-3:双下划线为附加序列4，下划线为特异检测序列5。

下游引物R-3：波浪线为特异检测序列2。

通用探针P-3:5’端标记FAM基团，3’端标记BHQ基团。

上游引物F-4:双下划线为附加序列4，下划线为特异检测序列5。

下游引物R-4：波浪线为特异检测序列2。

通用探针P-4:5’端标记HEX基团，3’端标记BHQ基团。

10μLPCR反应体系内含1μL人基因组模板，10mmol/LTris-HClpH8.3，50mmol/LKCl，0.5UTaq酶，3.5mmol/LMg2+，0.45μmol/L通用探针，0.04μmol/L上游引物F-1，0.4μmol/L下游引物R-1,0.4μmol/L上游引物F-2,0.04μmol/L下游引物R-2,0.04μmol/L上游引物F-3，0.4μmol/L下游引物R-3,0.4μmol/L上游引物F-4,0.04μmol/L下游引物R-4。PCR反应程序为：95℃3分钟；95℃5秒，60℃15秒，72℃10秒，40个循环；60℃退火阶段采集荧光信号。

图4显示，5A曲线为空白对照，无特异产物扩增，故检测不到特异信号。6A为ROX信号曲线，检测rs4784227基因型T，出现倒置曲线,故此该样本含基因型T；7A为CY5信号曲线，检测rs1219648基因型G,出现倒置曲线,故此该样本含基因型G；8A为FAM信号曲线，检测rs3803662基因型T,出现倒置曲线,故此该样本含基因型T；9A为HEX信号曲线，检测rs12313763基因型C，出现倒置曲线,故此该样本含基因型C。通过此方法，可以低成本、快速检测特定单倍型。

通过以上实施举例，本发明之精神对于本领域普通技术人员而言已经能够清楚地掌握，所以，在本发明中未明确给出的另外的特征、优点和实施方案对于查看了本发明的本领域普通技术人员来说都是清楚的，因此，应该理解，吸取了本发明之后对本发明所作出的修饰和改进都在本专利的保护范围之内，对于在本发明的基础上作出的变劣性技术方案也属于本专利的保护范围内。