一种筛选抗猪圆环病毒病猪的miR‑122启动子区分子标记育种方法及其应用

摘要

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种猪miR‑122基因的启动子区突变位点的分子标记方法及其在猪抗猪圆环病毒病育种中的应用，发明人发现在不同品种猪中miR‑122的启动子区存在多处差异，其中－4845位点处存在7bp碱基的插入/缺失，通过荧光素酶报告基因系统发现，有7bp碱基插入的启动子荧光素酶活性显著高于7bp碱基缺失的启动子荧光素酶活性。可见通过检测猪基因组中miR‑122基因启动子区－4845位点的基因型作为与猪抗猪圆环病毒病性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种筛选抗猪圆环病毒病猪的育种方法，通过判断猪ssc-miR-122的启动子区突变位点的多态性来进行选种，并人为的应用该突变位点实现优良育种。

背景技术

自1982年Tischer等在PK15细胞中发现猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)以来，对其的研究已有约34年的历史。PCV分为无致病性的PCV1和强致病性的PCV2两种亚型。PCV2主要感染5～15周龄的猪，致死率约为15％。它是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PWMS)、呼吸道疾病综合征(PRDS)、猪皮炎肾炎综合征(PDNS)的主要病原(Stevenson etal.,2001)。PCV2感染机体后能引起免疫抑制，在与其它病原体一同共感染或继发感染时，将会加重病情，严重的则会造成机体死亡。猪的抗病性状属于中等遗传力水平的阈性状，对病毒引起的疾病所产生的抗性是可以遗传的。Opriessnig等的研究发现，在感染PCV2后，皮特兰猪所表现出的临床症状最为严重，长白猪次之，杜洛克猪和大白猪的症状表现相对较轻。同时，本研究团队前期的研究发现在感染PCV2后，大长杂交猪表现出日增重减慢、体温升高、腹泻、皮肤出现紫斑以及肺脏和脾脏出现充血、出血等症状，而莱芜猪却表现温和，无明显病变。以上结果表明不同品种猪对PCV2的抗性存在遗传差异，地方品种猪抗PCV2的能力较强。猪不同品种间对PCV2的抗性存在遗传差异，这为抗猪圆环病毒病猪的育种提供了基础和前提。

莱芜猪具有抗病耐粗、多胎高产、哺育力强、肉质好等优良特性。调查显示，自2000年以来，在西方猪种PCV2感染率及死亡率呈逐渐升高的趋势，而我国地方品种莱芜猪未出现PCV2感染的报道，表现出对PCV2强的抗感染能力。本研究团队利用数字表达谱测序对比了抗病性强的莱芜猪和易感的大长杂交猪感染PCV2后肺脏组织表达谱的差异，筛选出大量差异表达的microRNA，实时定量RT-PCR试验验证了攻毒后的莱芜猪的肺脏中miR-122表达量显著高于未攻毒莱芜猪；而在大长杂交猪中的表达相对稳定(图1)。这提示了ssc-miR-122基因 可能与猪圆环病毒病的抗性有关。

miR-122是一种专一表达于成年人肝脏的miRNA，位于人的18号染色体上，在一个肝脏特异性表达的转录单元内，而猪miR-122位于1号染色体。miR-122是一个较长前体非编码基因转录本通过剪切后而产生，启动子具有较高的保守性，miR-122前体基因启动子区位于miR-122保守茎环序列上游约5kb处，包含多个核受体因子结合序列，如RNA聚合酶II所识别的启动子顺式元件TATA-box等，利用报告基因系统结合生物信息学分析以及序列删除和突变技术，确定了这些元件对于miR-122基因表达具有十分重要的调节作用。MiR-122有促进肿瘤细胞凋亡的作用，并可参与肝细胞发育、肝细胞表型、分化代谢和肝细胞应急应答等多种生理活动。

通过对比莱芜猪和大长杂交猪miR-122基因的启动子区系列，找到多处核苷酸序列的不同。对－4845位点存在的7bp碱基插入/缺失的多态进行了进一步研究。我们的研究表明miR-122基因－4845位点的7bp碱基缺失后，荧光素酶报告基因活性显著降低，提示该位点的7bp碱基插入可能有增强miR-122基因转录的功能。由于miR-122的稳定表达和猪抗圆环病毒病相一致，因此通过检测该分子标记，选择miR-122高表达的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的抗圆环病毒病特性具有重要的意义。

发明内容

基于上述的原因，本发明通过筛选出猪抗猪圆环病毒病相关的基因标记，建立猪分子标记辅助育种方法，为猪抗病品种培育提供基因标记和技术方法。根据现有技术，发明人通过进一步的实验发现猪miR-122启动子区－4845位点的7bp碱基插入/缺失突变在体外试验中改变了miR-122启动子的活性，两者差异显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

本发明提供的一种筛选抗猪圆环病毒病猪的miR-122分子标记育种方法，该方法通过测定从该动物获得的DNA样品中miR-122启动子多态性来实现的；通过多态性的测定结果，选出具有与所需特征相关的猪进行育种；

所述的多态性是与抗猪圆环病毒病相关的多态性。

其具体方法如下：

(1)猪基因组DNA的获得；

(2)分别以上述猪基因组DNA为模板，扩增miR-122的启动子区序列；

(3)限制性内切酶酶切方法构建不同载体，通过细胞培养和转染技术，利用双荧光素酶报告系统检测不同载体的表达情况，找出调控基因表达的关键元件；

(4)鉴定miR-122启动子区多态性；

(5)荧光素酶报告系统检测定点突变位点对基因表达的影响；

(6)群体检测－4845位点的多态性及标记辅助育种。

具体的标记方法为：

采用标记引物，包括

miR122F：5′-CGGGGTACCTCCTGCTGAGTGTGCTTGA-3′其序列如Seq ID No：1所示；

miR122R：5′-CTAGCTAGCAACCTTGTGAGTGTTCCG-3′其序列如Seq ID No：2所示；

我们的研究表明miR-122基因－4845位点的7bp碱基缺失后，荧光素酶报告基因活性显著降低，提示－4845位点的7bp碱基插入可能有增强miR-122基因转录的功能。结合基因表达谱及荧光定量PCR结果可以看出miR-122基因的高表达与对猪圆环病毒的抗性有关。通过分子标记筛选含有7bp碱基插入等位基因的猪群进行育种，可以获得miR-122高表达的个体，对于提高猪群的抗猪圆环病毒病特性具有重要意义。

综上所述，本发明人通过实验发现猪miR-122启动子区－4845位点的7bp碱基插入/缺失突变在体外试验中改变了miR-122启动子的活性，两者差异显著，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

附图说明

图1为猪miR-122基因在肺脏的荧光定量PCR结果；

图2为miR122F和miR122R引物PCR扩增猪miR-122启动子-5143至-3594片段电泳图；

图3为构建删除载体，转染PK15细胞荧光素酶检测结果；

图4为miR122F和miR122R引物PCR扩增猪miR-122启动子-5143至-3594 片段多态位点检测结果；

图5为荧光素酶系统分别检测含有7bp碱基插入和缺失的启动子载体的荧光素酶活性结果；

具体实施方式

在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1猪miR-122启动子区序列的克隆

基因组提取：取莱芜猪和大长杂交猪耳组织，按照TIANGEN公司TIANamp GenomicDNA Kit的说明书进行基因组DNA提取。

根据miR-122启动子的基因序列(NCBI Reference Sequence:NC_010443.4)设计如下引物miR122PF基因序列如Seq ID No:1所示，miR122PR基因序列如Seq ID No:2所示，它包含了从miR-122前体上游3594bp到上游5143bp的范围(序列如Seq ID No:5所示)。

引物中分别加入KpnⅠ和NheⅠ内切酶位点(红色字体)和保护碱基(斜体部分)。利用miR122F和miR122R引物扩增miR-122调控区-5143bp至-3594bp片段，扩增体系为2×PrimeSTAR GC Buffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTPs>TM>

实施例2猪miR-122启动子载体及删除载体的构建，荧光素酶活性检测

1)以pGL3-Basic为骨架构建miR-122启动子荧光活性载体。将pGL3-Basic载体和实施例1中得到的miR-122启动子分别用KpnⅠ和NheⅠ限制性内切酶进行双酶切。酶切体系为：Green Buffer 2μL，KpnⅠ内切酶1μL，NheⅠ内切酶1μL，pGL3-Basic载体2μL(miR-122启动子目的片段10μL)，加ddH₂O至总体积30μL。以37℃酶切1h。

2)DNA的连接和转化。连接体系为：总体系为10μL，其中包括5×Rapid ligationbuffer 1μL，T4DNA ligase(5U/μL)0.5μL，载体1μL，插入片段6μL，ddH₂O>

3)质粒DNA的制备及测序。用无菌小枪头在转化后平板上挑取单菌落，接种于含100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB培养液中，37℃200rpm培养12～14h。质粒的提取过程严格按照天根质粒小提试剂盒进行，质粒抽提完成后对收集到的质粒进行双酶切验证。酶切验证体系为：Green Buffer1μL，KpnⅠ内切酶0.2μL，NheⅠ内切酶0.2μL，质粒DNA2μL，加ddH₂O至总体积10μL。以37℃酶切1h。将双酶切检测到的阳性克隆送于上海铂尚测序部进行测序。保存剩余菌液，得到pGL3-miR-122(-5143bp/-3594bp)载体。

4)以pGL3-Basic为骨架构建miR-122启动子删除荧光活性载体，方法同步骤(1)

5)将回收得到的删除载体进行连接和转化方法同步骤(2)。得到miR-122启动子删除载体pGL3-miR-122(-4587bp/-3594bp),pGL3-miR-122(-4086bp/-3594bp)

6)将3)和5)预存的菌液取200μL转接到200mLLB液体培养基(含抗生素)中37℃200rpm培养12h～16h。4℃8000×g收集菌体至50mL离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作将严格按照EndoFree Maxi Plasmid Kit(TIANGEN)说明书进行，纯化得到的质粒A260/280在1.8～2.0之间。

7)PK15细胞培养于25cm²/50mL的细胞培养瓶中。所用培养基为DMEM(Gibco)>

将待转染的细胞用1×PBS(Gibco)漂洗贴壁细胞两次，加入37℃预热的0.25％胰酶(Gibco)，消化3min，加入无抗生素的完全培养基重悬细胞，细胞计数后每孔按7×10⁴接种至24孔板，24h后用37℃无血清无抗生素DMEM培养基(Gibco)洗涤细胞一次，每孔加入500μL新鲜的无抗生素的完全培养基，12h后进行转染，此时细胞汇合度为60％～70％。分别将无启动子的阴性对照载体pGL3-Basic、pGL3-miR-122(-5143bp/-3594bp)、pGL3-miR-122(-4587bp/-3594bp)、pGL3-miR-122(-4086bp/-3594bp)质粒用lipo2000转染试剂同时转染PK15细胞系。转染液A：取50μL>2，37℃培养箱中。6h后更换完全培养基。转染24h后按照双荧光素酶检测试剂盒(Promega，USA)说明进行荧光素酶活性测定，测定结果如图3所示。从图3中可以推测在pGL3-miR-122(-5143bp/-3594bp)和pGL3-miR-122(-4587bp/-3594bp)之间存在着增强基因表达的调控元件，在pGL3-miR-122(-4587bp/-3594bp)和pGL3-miR-122(-4086bp/-3594bp)之间存在抑制或降低基因表达的调控元件。

实施例3寻找不同猪种miR-122启动子区多态

利用miR122F和miR122R引物分别扩增莱芜猪(15头莱芜猪DNA混池样)和大长杂交猪(15头大长杂交猪DNA混池样)miR-122调控区－5143bp至-3594bp片段。引物序列、扩增体系、反应条件同实施例1。将扩增后的产物与6×Loading Buffer混合上样至1％TAE琼脂糖凝胶，5V/cm电泳10min后切胶回收1548bp片段，按康为世纪琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物，将纯化产物连入pGL3-Basic载体中，克隆转化DH5α感受态细胞，莱芜猪和大长杂交猪分别挑取单菌落20管摇菌，送往上海铂尚测序部进行测序。用DNAMAN6.0.3.99软件进行序列比对，找出了多个多态位点，其中－4845位点的7bp碱基的插入/缺失多态位于存在增强基因表达元件的关键区段pGL3-miR-122 (-5143bp/-3594bp)和pGL3-miR-122(-4587bp/-3594bp)(图4)，且在两猪种间的等位基因频率存在一定差异。

实施例4荧光素酶报告系统检测－4845位点不同等位基因启动子活性的差异

根据上述多态性的的分析结果，利用PCR分别扩增含有7bp碱基插入和7bp碱基缺失的启动子片段，连接于pGL3-Basic载体，检测不同等位基因对启动子活性的影响。

根据miR-122启动子的基因序列(NCBI Reference Sequence:NC_010443.4)设计如下突变引物T122F基因序列如Seq ID No:3和T122R基因序列Seq ID No:4如，所示。

以插入全长为模板，用T122F和T122R扩增，构建缺失7bp载体。扩增体系为：5×PrimeSTAR GXL Buffer(Mg²⁺Plus)10μL，dNTPs4μL，引物(10μM)各1μL，PrimeSTAR^TMGXL>2O至总体积50μL。PCR反应条件为94℃5min；98℃10s，54℃30s，72℃5min，18个循环；72℃8min。得到PCR产物1541bp，将扩增后的产物加入1μLDpnI,放入金属浴37℃1h。连接转化同实施例2中1)和2)，去内毒素处理同实施例2中6)，荧光素酶检测同实施例2中7)。

构建的pGL3-7bp-insertion和pGL3-7bp-deletion载体经过KpnⅠ和NheⅠ限制性内切酶进行双酶切鉴定后，送上海铂尚生物技术公司测序。启动子活性结果如图5所示，表明7bp碱基缺失后，其启动子活性显著降低。说明该位点是一个增强基因表达的重要的顺式调控元件。

实施例5群体检测－4845位点的多态性及标记辅助育种

通过PCR手段利用引物miR122F和miR122R检测猪miR-122启动子区－4845位点基因型。引物序列、扩增体系及反应条件同实施例4。不同猪种的检测结果表1所示。将－4845位点的7bp碱基插入等位基因的有无作为抗病相关基因标记，将携带该抗病基因标记的猪(含有7bp插入等位基因的纯合子和杂合子)进行繁殖，在仔猪出生后，鉴定该标记，通过综合选种，从中筛选出抗猪圆环病毒病强的猪，培养抗猪圆环病毒病的优良猪种。

表1－4584位点等位基因在不同品种猪的分布

<110>山东农业大学

<120>一种筛选抗猪圆环病毒病猪的miR-122启动子区分子标记育种方法及其应用

<160>5

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cggggtacct cctgctgagt gtgcttga 28

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctagctagca accttgtgag tgttccg 27

<210>3

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

Tgcaaggtaa gtgccacccc cacccccacc ccccacattc cagcgccttc caactcccct gt 62

<210>4

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cacaggggag ttggaaggcg ctggaatgtg gggggtgggg gtgggggtgg cacttacctt gca 63

<210>5

<211>2025

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tcctgctgag tgtgcttgac caaaggtgac gatgactaag ggctaaggcc gtgccctccc 60

tccctccaaa tcgatccttt aatgtgactt atcagaaaga gaaagaactg tttactttca 120

aaccctggat cccataaagg gagaggggca aggcctaaaa ccctcacaag ctcgaggctt 180

ggcccacaca gcctgcagaa ctagggagcg cggaagacac catctcacgg acacagaagg 240

ggccctgggc ccagagaaga ccttcgcata ctgcaaggta agtgccaccc ccacccccaa 300

ccccccaccc cccacattcc agcgccttcc aactcccctg tgtgaattag gctgttcctc 360

tggggcacca ctgacttcca gatgtggggt gagctgcgac ccaggtgttt ataaaaagac 420

attccccgct ccacccccac ccccggagct atgtgctgtg ttctctgcac atttgaattt 480

gtctgccatg gttattctat ttcttcagaa agcctgagaa aactggagtc tttgctaaag 540

cttcttctct ccccagagga aggaaaggat gaggctaggg aggagtctac acctggaggt 600

ggcgtggatt tttagttccg gccttggagg agctgtgtag gaagccattt ccggtttaac 660

gatggcctga cttcacaata aacaccaaga ttccaccatt aggatactta gaatttgaag 720

gttcatttga ccaggaatcc tcccctcccc atgcttggga gcaggcacag ccccaaggct 780

cactctattt tgttcctcta ctcctgaaac accagcatcg gacttgtttc tctgtccccc 840

tggtattggt ccctcgacag cactggaaat agctggacaa ccgcacagaa atgaaaccag 900

ttcctaggaa tcccccagcc tcagcaactc tctttaaaaa gggtccgttg agaccccagc 960

ttggctgaga atttgcccca ggatcccctc ttggctggag gtaatggtgt aacagatgtg 1020

gcataagctt tccagatttc cccttctagc tgaatttcaa tcagaaaaga aagacttccc 1080

tgctccctat tgaggagaac attctatttt aaaattttca tgtgctttca aaatgacaag 1140

actcaggcat atgctactga cttgctttgt cttctagact ataatagcct ctaagaatca 1200

aacggatgca tttaacacat ctaactgcaa tgacagaaaa tgtggatttg gaattaagaa 1260

aaagcacatc catttatcat ttgcttttta agaatctttt ttaggtgctg aagggttagg 1320

ttggcagcaa agtgacactt cacttcccca aagcattctt ttctcagccc tctggaggtg 1380

gccctagaat gttctcagac cctgggaaac aaaatctgaa agcgaagatg agctgcttgt 1439

gccccgatct gacctgagat agcataggga gttttatgat gttcttggta cttgcgaatc 1500

tgaaatatct tccgaggagc tgtgatgcac acggaacact cacaaggtt 1560