一种用于烟曲霉唑类耐药突变检测的核酸诊断试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及真菌分子生物学领域，本发明提供一种用于烟曲霉唑类耐药突变检测的核酸诊断试剂盒；针对烟曲霉的耐药突变TR34/L98H，开发了一套价格低廉、操作简单、不需要高价仪器的曲霉耐药检测方法，能够同血清学检测形成良好的互补，非常适用于我国目前的临床诊断现状，能够大大提高曲霉菌的诊治水平。

说明书

技术领域

本发明涉及真菌的分子生物学研究领域，具体地说，是一种用于烟曲霉唑类耐药突变检测的核酸诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

曲霉菌(Aspergillus)是国际上导致侵袭性真菌病最重要的病原真菌之一，以烟曲霉(Aspergillus.fumigatus)为主要致病菌种，常引起过敏反应、慢性和侵入性支气管肺病等严重疾病。烟曲霉既可侵犯免疫功能低下人群，也能在正常人群中致病，其发病率和死亡率均较高，历来为临床医生所重视。近几十年来，医疗技术快速发展，曲霉菌的诊治水平有了很大的提高。但是，近年来临床上难治性曲霉感染病例有增加趋势，很大一部分原因是由于烟曲霉耐药菌株的增多。

国际指南推荐的烟曲霉一线用药为广谱三唑类抗真菌药物，如伊曲康唑、泊沙康唑和伏立康唑等。该类药物不良反应小，临床效果好，已经广泛用于曲霉感染高危人群经验性预防、急慢性感染控制。但由于全球范围内含唑类农药大规模应用，以及临床上唑类抗真菌药物的长疗程使用，烟曲霉菌对伏立康唑等抗真菌剂的耐药性呈现逐年上升趋势(ClinInfect Dis.2011,52(9):1123-1129.DOI:10.1093/cid/cir179.)。据文献显示，临床菌种耐药率在美国约为3.6％，中国为4％，日本为11％(Patterns of susceptibility ofAspergillus isolates recovered from patients enrolled in the Transplant-Associated Infection Surveillance Network.Baddley JW1,Marr KA,Andes DR,WalshTJ,Kauffman CA,Kontoyiannis DP,Ito JI,Balajee SA,Pappas PG,Moser SA.Journalof Clinical Microbiology,2009,47(10):3271-3275；In vitro susceptibilitytesting of Aspergillus spp.against voriconazole,itraconazole,posaconazole,amphotericin B and caspofungin.Shi JY,Xu YC,Shi Y,LüHX,Liu Y,Zhao WS,Chen DM,Xi LY,Zhou X,Wang H,Guo LN.Chinese Medical Journal,2010,123(19):2706-2709；Antifungal susceptibilities of Aspergillus fumigatus clinical isolatesobtained in Nagasaki,Japan.Tashiro M,Izumikawa K,Minematsu A,Hirano K,IwanagaN,Ide S,Mihara T,Hosogaya N,Takazono T,Morinaga Y,Nakamura S,Kurihara S,Imamura Y,Miyazaki T,Nishino T,Tsukamoto M,Kakeya H,Yamamoto Y,Yanagihara K,Yasuoka A,Tashiro T,Kohno S.Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2012,56(1):584-587.)。由于以往耐药检测是基于培养等传统技术，阳性率低，所以实际耐药情况可能被大大低估。

烟曲霉CYP51A基因编码产物是唑类药物作用的靶标，特定点突变能导致唑类药物与CYP51A蛋白的亲和力下降，是发生唑类耐药的重要原因(Substitutions at methionine220in the 14alpha-sterol demethylase(Cyp51A)of Aspergillus fumigatus areresponsible for resistance in vitro to azole antifungal drugs.Mellado E1,Garcia-Effron G,Alcazar-Fuoli L,Cuenca-Estrella M,Rodriguez-TudelaJL.Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2004,48(7):2747-2750；Mutations inthe cyp51A gene and susceptibility to itraconazole in Aspergillus fumigatusserially isolated from a patient with lung aspergilloma.Chen J,Li H,Li R,BuD,Wan Z.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2005,55(1):31-37)。TR34/L98H是烟曲霉菌重要的耐药突变类型，其他还包括T289A突变，Y121F突变(Analytical andClinical Evaluation of the PathoNostics AsperGenius Assay for Detection ofInvasive Aspergillosis and Resistance to Azole Antifungal Drugs duringTesting of Serum Samples.White PL,Posso RB,Barnes RA.Journal of ClinicalMicrobiology,2015,53(7):2115-21)。

检测烟曲霉唑类耐药的传统方法，是以培养为基础的微量肉汤稀释法药敏检测法等，该方法较可靠，无需特殊仪器，但最大弱点是费时，传统培养时间为2-3周，药敏试验需要至少3天后观察结果。血清学检核检测可以在数小时得到菌种信息，但是药敏结果仍然需要3周时间才能获知。所以目前技术不能在患者治疗的初期及时提供精确的用药指导信息，使目前的抗真菌方案不能科学地遵从个性化的原则，既耽误病人的治疗，也造成了财力的浪费。

基于核酸扩增的分子诊断方法或能解决上述问题，有望作为一种补充的药敏试验方法，指导临床开展早期、有效的抗真菌治疗。目前该类技术已经成功应用于临床检测MASA、结核、HIV等致病微生物耐药突变，对指导临床治疗，改善患者预后起到了重要的作用(耐利福平脊柱结核的分子药敏检测及药物缓释系统的研究进展燕荣帅，李力韬，张泽华中国矫形外科杂志,2011,19(21):1807-1809)。但是曲霉菌耐药检测研究少，可能的原因是：1)选定何种突变基因用于烟曲霉唑类耐药的检测靶点；2)大部分分子诊断技术试剂成本较高，患者难以接受，而传统真菌药敏试验仅需大约100元/次；3)大部分分子诊断技术需要平台较高，各大医院分子诊断实验室配备的设备参差不齐；4)某些分子诊断技术需要一定的的操作水平，目前很多检验员仍未经过相关培训；5)现有市场为血清学检测占据，对于分子检测可能有一定的排斥性。

但是分子诊断是未来微生物检验的发展大趋势，本领域一直致力于研究一种适用于临床检测烟曲霉唑类耐药突变的分子诊断试剂盒，而且该分子诊断试剂盒价格低廉、操作简单、不需要高价仪器。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于烟曲霉唑类耐药突变检测的核酸诊断试剂盒；本发明的另一目的在于提供利用上述试剂盒检测烟曲霉唑类耐药菌株的方法。

我们发现，在未使用过唑类药物进行治疗的患者体内分离得到的耐唑类烟曲霉菌菌株中，有90％的菌株为TR34/L98H突变型烟曲霉菌。

为了让烟曲霉耐药检验能够以最小成本、最小阻力开展，本发明针对烟曲霉最重要的耐药突变TR34/L98H，开发了一套价格低廉、操作简单、不需要高价仪器的曲霉耐药检测方法，能够同血清学检测形成良好的互补，非常适用于我国目前的临床诊断现状。

L98H，GenBank:AF338659.1；突变为T>A。

TR34，GenBank:AF338659.1；突变为67位点之后有重复插入片段：tcacgcggtccggatgtgtgctgagccgaatgaa(一共34个碱基，SEQ ID NO:7)。

L98H耐药突变如图1所示，TR34突变如图2所示。

本发明的第一方面，提供一种用于烟曲霉唑类耐药突变检测的核酸诊断试剂盒，所述的试剂盒包括两对特异性引物，引物序列如下：

第一对特异性引物，用于检测L98H点突变：

L98H-F:CGCATGAGCAGCATCTCGCTTC(SEQ ID NO:1)

L98H-R:GGAACGAGTTTATTCTCAACGGCAAAGA(SEQ ID NO:2)

第二对特异性引物，用于检测TR34重复插入片段突变：

TR34-F:TGTGCTGAGCCGAATGAATCACGC(SEQ ID NO:3)

TR34-R:GATAAGAGGGATTATTTCATATACTGGATTCC(SEQ ID NO:4)

本发明的试剂盒，PCR反应体系如下：

PCR扩增条件如下：

95℃30秒-{95℃30秒-57℃30秒-72℃30秒}共30个循环-65℃5秒-95℃

本发明的第二方面，还提供了上述试剂盒在检测烟曲霉唑类耐药菌株中的应用，即，本发明提供了一种烟曲霉唑类耐药菌株的二重PCR检测方法。

本发明的检测体系为二重PCR，即在一个反应体系中有两对引物共存，引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；两套引物分别针对TR34突变，以及L98H突变；PCR扩增产物大小分别为446bp和257bp，可以很容易通过普通PCR仪+琼脂糖凝胶电泳进行检测；同时，由于产物大小以及GC％的差异，导致两者Tm值差异较大的扩增产物(分别为86.19℃和81.50℃)，故可通过RT-PCR的扩增曲线判断扩增是否成功以及溶解曲线呈现双峰判断两种突变是否共存。

本发明的烟曲霉唑类耐药菌株的二重PCR检测方法，包括如下步骤：

A)从待测烟曲霉中提取DNA，进一步以DNA为模版，将如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的分别针对TR34突变以及L98H突变的两对引物同时加入PCR反应体系，进行PCR扩增；

B)对PCR扩增产物进行分析，若TR34突变和L98H突变共存，则待测烟曲霉为唑类耐药菌株；

对PCR扩增产物进行分析，可选择以下任一步骤：

B1)普通PCR结合琼脂糖凝胶电泳分析；或者

B2)RT-PCR的扩增曲线判断。

上述检测方法，步骤A)中，从待测烟曲霉中提取DNA，可以使用ZR Fungal/Bacterial DNA Kits(Zymo)试剂盒、DN20-基因组DNA快速提(艾德莱)试剂盒，DNeasyPlant Mini Kit(凯捷)等。

上述检测方法，步骤A)中，PCR反应体系如下：DNA模板1μl，两对上、下游引物各0.5μl， Premix Ex Taq^TM>

上述检测方法，步骤A)中，PCR扩增反应条件如下：95℃预变性30秒，进入95℃30秒、57℃30秒和72℃30秒的循环，共循环30次，65℃延伸5秒，95℃退火。

上述检测方法，由于产物大小以及GC％的差异，导致两者Tm值差异较大的扩增产物SEQ ID NO.5，Tm值为86.19℃和SEQ ID NO.6，Tm值为81.50℃；所以SEQIDNO.5/6两个产物的溶解曲线分别在86.19℃和81.50℃形成两个峰，显示两种突变共存，即为唑类耐药菌株，如图3所示。

本发明检测突变产生序列碱基数目以及Tm值差距较大，所以既可以用RT-PCR仪溶解曲线法来检测，也可以用普通PCR仪+电泳法进行检测。前者可用于装配了RT-PCR仪(30万/台以上)的单位，由于扩增+结果读取一步到位，操作较为方便；后者适用于处于分子诊断起步阶段以及有意开展分子诊断项目的单位，仅需少量投入(微型PCR仪仅需5000元/太)，便能实现分子诊断。

本发明提供了一种适用于临床检测烟曲霉唑类耐药突变的分子诊断试剂盒，以及检测方法；本发明的试剂盒价格低廉，检测方法操作简单、不需要高价仪器。

附图说明

图1检测位点L98H点突变(T>A突变)，无颜色填充部分为突变处。

图2检测位点TR34突变，检测到重复插入片段为突变。

图3为单株唑类耐药菌株RT-PCR溶解曲线呈现双峰，显示两种突变共存。

图4为特异性图；显示该方法可以扩增L98H/TR34突变的耐药烟曲霉，而无法扩增非耐药烟曲霉。

图5为图4扩增曲线对应的溶解曲线，显示突变的耐药菌株形成明显的双峰，而非耐药菌株不明显。

图6为敏感性图，显示该方法对于烟曲霉的敏感性为10的4次方。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例：

(1)菌株：

耐药烟曲霉，经过测序确定存在L98H/TR34突变，菌株编号如下：

STJ0048

STJ0049

STJ00105

STJ00107

STJ00119

非唑类耐药烟曲霉，菌株编号如下：

STJ0001-0010

引物序列：

L98H-F:CGCATGAGCAGCATCTCGCTTC(SEQ ID NO.1)

L98H-R:GGAACGAGTTTATTCTCAACGGCAAAGA(SEQ ID NO.2)

TR34-F:TGTGCTGAGCCGAATGAATCACGC(SEQ ID NO.3)

TR34-R:GATAAGAGGGATTATTTCATATACTGGATTCC(SEQ ID NO.4)

(2)DNA的提取以及倍比稀释

使用ZR Fungal/Bacterial DNA Kits(Zymo)试剂盒提取真菌DNA。

经查阅文献，曲霉基因组大小为29.4Mb。建立拷贝数计算公式：

Copy number＝(amount ng*6.022*1023)/(2.94*107*1*109*650)

得到10⁶个曲霉菌的DNA重量为31.7ng。故将上述试剂盒抽取的DNA浓度稀释为31.7ng/ul，在以十为倍数，建立浓度梯度，用于敏感性试验(10⁶/ml，10⁵/ml，10⁴/ml，10³/ml，10²/ml，10¹/ml)。

(3)反应体系：

扩增条件：

95℃30秒-{95℃30秒-57℃30秒-72℃30秒}共30个循环-65℃5秒-95℃

(4)结果判读

实验仪器:Bio-Rad伯乐MiniOpticon双色实时荧光定量PCR仪，扩增曲线Cq值结合溶解曲线形态(标准为双峰)判断该浓度下扩增是否成功。

(5)实验结果：

1)通用方法的表述：

引物序列，对应检测位点，对应扩增检测产物，以及相应Tm值

第一对引物：

L98H-F:CGCATGAGCAGCATCTCGCTTC

L98H-R:GGAACGAGTTTATTCTCAACGGCAAAGA

该点突变检测方法为“等位基因特异性PCR”，其中L98H-R末尾AGA三个碱基为错配碱基，用于探测点突变，如果存在耐药菌株，则该引物序列可以引发聚合酶链反应，反之则不可。

检测位点L98H点突变(T>A突变)，无颜色填充部分为突变处，如图1所示。

扩增产物：

CGCATGAGCAGCATCTCGCTTCTTGTTATGCGGCAATGGGGCCCACGGTAGCATAAAATTGATGGGAGTAAAGCCCTTGTCCAGGTCATGATAGAGGTCAGCGAACTCAGCCGTGAGTTTGGAACGAACTTCCTGGCCTTGGAGGGCTCGAGCAGCGGTAAAAATGGTAATCTCAGCCATTGCCGCAGAGATGTCCATCCGGCCGGACGAGCCTTGAAAGTTCGGTGAATCGCGCAGATAGTCCAAAACCTCCTTCTCAATAAGTGGCACATGAGACTCTAACGCAGACTGAGTCAAGCCGTACTTGATGAACTTTTTCTGCTCCATCAGCTTGGAATTGGGACAATCATACACCACGTCCGATCCGAAAACGGGGGTCGTCAATGGACTATAGACCTCTTCCGCATTGACATCCTTGTGCTTGCCGTTGAGAATAAACTCGTTCC(446bp，SEQIDNO.5，GC％＝50.9％)

(Tm＝86.19℃，Tm值由http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html计算得到)

第二对引物：

TR34-F:TGTGCTGAGCCGAATGAATCACGC

TR34-R:GATAAGAGGGATTATTTCATATACTGGATTCC

引物覆盖于两次重复片段中间位置，及前一个重复片段的偏后区域以及后一个重复片段的偏前区域，突变菌株存在该序列，可以进行聚合酶链式反应，野生菌株无插入突变，故不存在两次突变重复序列，无法进行聚合酶链式反应。检测重复插入片段突变如下：如图2所示。

扩增产物：

TGTGCTGAGCCGAATGAATCACGCGGTCCGGATGTGTGCTGAGCCGAATGAAAGTTGCCTAATTACTAAGGTGTAGTTCCAGCATACCATACACCCTAACTCATACTACGGTAGGTAGATCTACTTACCTATGAACCTATATTGGTAGGTAGGTGAATATAAAATACAGCATGGAACATGTTTTTCATTAGCTGGTCTCTCATTCGTCCTTGTCCTAGGCCTTAAGGAATCCAGTATATGAAATAATCCCTCTTATC(257bp,SEQIDNO.6，GC％＝42％)

(Tm＝81.50℃，Tm值由http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html计算得到)

用上述方法检测下来的实验结果，如图4、5所示，耐药烟曲霉STJ0048、STJ0049、STJ00105、STJ00107、STJ00119扩增L98H/TR34突变，且能形成明显的双峰；而非唑类耐药烟曲霉STJ0001-0020无法扩增L98H/TR34突变，且溶解曲线不明显。

将上述试剂盒抽取的DNA浓度稀释为31.7ng/ul，经计算得出，31.7ng/ul相当于10⁶个菌/ml基因组DNA量，以十为倍数将31.7ng/ul的DNA进行倍比稀释，建立浓度梯度，用于敏感性试验(分别代表10⁶/ml，10⁵/ml，10⁴/ml，10³/ml，10²/ml，10¹/ml)。将上述浓度的DNA作为PCR模板，进行反应。结果10⁴/ml可以扩增成功，而10³/ml无法扩增，如图6所示，本发明的方法对于烟曲霉的敏感性为10的4次方，具有一定的临床应用潜质。

结论：本发明的检测体系可以很好的区分TR34/L98H耐药突变菌株和野生菌株；敏感度为10⁴/ml。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第二军医大学第二附属医院

<120> 一种用于烟曲霉唑类耐药突变检测的核酸诊断试剂盒及其检测方法

<130> 说明书，权利要求书

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcatgagca gcatctcgct tc 22

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaacgagtt tattctcaac ggcaaaga 28

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtgctgagc cgaatgaatc acgc 24

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gataagaggg attatttcat atactggatt cc 32

<210> 5

<211> 446

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcatgagca gcatctcgct tcttgttatg cggcaatggg gcccacggta gcataaaatt 60

gatgggagta aagcccttgt ccaggtcatg atagaggtca gcgaactcag ccgtgagttt 120

ggaacgaact tcctggcctt ggagggctcg agcagcggta aaaatggtaa tctcagccat 180

tgccgcagag atgtccatcc ggccggacga gccttgaaag ttcggtgaat cgcgcagata 240

gtccaaaacc tccttctcaa taagtggcac atgagactct aacgcagact gagtcaagcc 300

gtacttgatg aactttttct gctccatcag cttggaattg ggacaatcat acaccacgtc 360

cgatccgaaa acgggggtcg tcaatggact atagacctct tccgcattga catccttgtg 420

cttgccgttg agaataaact cgttcc 446

<210> 6

<211> 257

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtgctgagc cgaatgaatc acgcggtccg gatgtgtgct gagccgaatg aaagttgcct 60

aattactaag gtgtagttcc agcataccat acaccctaac tcatactacg gtaggtagat 120

ctacttacct atgaacctat attggtaggt aggtgaatat aaaatacagc atggaacatg 180

tttttcatta gctggtctct cattcgtcct tgtcctaggc cttaaggaat ccagtatatg 240

aaataatccc tcttatc 257

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcacgcggtc cggatgtgtg ctgagccgaa tgaa 34