辅助鉴定牡丹品种‘凤丹’籽粒脂肪酸合成的专用引物

摘要

本发明提供一对辅助鉴定牡丹品种‘凤丹’籽粒脂肪酸合成的专用引物，属于分子生物学领域，本发明还提供牡丹品种‘凤丹’的油体蛋白基因PsOLE1的cDNA序列SEQ NO.1及其克隆方法，并提供了克隆所用的兼并引物和RACE扩增引物；同时提供了牡丹品种‘凤丹’的油体蛋白基因的实时定量引物，利用所述牡丹品种‘凤丹’的油体蛋白基因的实时定量引物进行实时定量PCR扩增，辅助快速检测牡丹品种‘凤丹’脂肪酸合成进程的方法，可以利用所述的油体蛋白基因指导牡丹品种‘凤丹’籽粒收获时间，与传统GC‑MS技术测定脂肪酸含量相比，该检测方便快捷，大大的节约了测定成本，从而为牡丹籽粒的收获时间提供科学的辅助工具。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一个牡丹品种‘凤丹’的油体蛋白基因PsOLE1的克隆和一对可以辅助鉴定牡丹品种‘凤丹’籽粒脂肪酸合成的专用引物。

背景技术

牡丹具有很高的观赏价值和药用价值。以牡丹籽仁为原料提炼出的籽油通过了毒理学安全性评价，于2011年3月22日被卫生部批准为新资源食品，使牡丹籽油跻身进入食用油行列，牡丹籽油产业迅猛发展，全国油用牡丹产业发展的热潮正在到来。而牡丹作为新兴的油料作物，其资源的开发和利用都处于起步阶段，相关基础研究十分薄弱。王亮生课题组将油用牡丹品种‘凤丹’从每年5月份授粉后开始计算每隔10天取材，人为分成了S1-S10，其中S1-S3是种子发育初期，S3-S9是快速生长期，S9-S10是籽粒成熟期。利用GC-MS技术测定了籽粒授粉后成熟进程中的脂肪酸含量，发现脂肪酸含量到S9达到最高值，之后(S9-S10)下降。

Vance和Huang最早从芥菜中发现油质蛋白，Oleosin蛋白不但广泛存在于油料作物种子中，在非油料作物中也存在，如胡萝卜、大麦、苔藓类等植物。OLE基因已经从很多物种中克隆出来，如拟南芥、油菜、玉米、芝麻、水稻、咖啡、大豆、大麦、橄榄、麻风树等。OLE基因存在形式为家族式，其表达具有经典的“时、空”特点。牡丹中的油体蛋白基因到目前为止尚未得知，其与牡丹脂肪酸合成进程是否存在相关关系，其是否能辅助牡丹籽粒的收获等是本次发明的主要内容。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一个牡丹油体蛋白基因PsOLE1的cDNA序列和一对可以辅助鉴定牡丹品种‘凤丹’籽粒脂肪酸合成的的专用引物。这对引物扩增的产物与籽粒脂肪酸含量具有极显著的正相关，因此可以为牡丹籽粒的收获时间提供指导。

本发明是按如下技术方案实现的：

牡丹品种‘凤丹’的油体蛋白基因PsOLE1的cDNA序列，所述的基因序列为：

ACATGGGATCCACAGTTGCTTGTTTATAATATTAACAAATCATCATCACCATCAATGGCTGAGTACCAACCCCAACCCCAAAACCAACCCCACGGTTCCCACCAGCAACACCCTCTTTCTTACCAAGCTGTGAAAGCAGCCACTGCCGTGACCGCCGGTGGCTCACTCTTAGTCCTCTCCGGCCTGACACTCGCTGGAACCGTCATAGCTCTGACAATAGCCACTCCTCTCCTGGTCATCTTCAGTCCTGTTCTTGTCCCCGCAGTGATAACGGCTGCGCTTTTGACCACTGGGTTTCTTGCTTCAGGTGGATTCGGTGTGGCTGCGGTGACCGTCTTGTCATGGATCTACAGGTACGTTACCGGAAAACACCCACCTGGCGCGGAGACGCTCGACTCGGCGAGGTTGAAGCTGACGAGCAAGGCTAGAGAGATGAAGGACAAGGCGGAGCAGTTTGGGCATCAGCATCTTACTGCTGGTCAACACACTTCTTGAAGGTTGTGCTGATCATGCAAGTTTGTGGACCTCCGCTTGATTTGATGGACGGCTCATGATATAGATGGGTGGAGATCAGATGGCGATATGAGCTCTCAGTTAGGGAGTCATTGGGTCTGTGTATGTTTGTTCTGCGTCTTTTTGTCATATTCAGTGGTTTTTCTTTTTTTCTTTTTTGTGCGTGCATGTTGATGTCTTTATTAGTAATGTAATGATAATAATTTGGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

牡丹品种‘凤丹’的油体蛋白基因PsOLE1的克隆方法，所述的方法为利用的是兼并引物和RACE扩增引物，所述的兼并引物F：5’-GTCACWGCYGGTGGRTCTCT-3’和R：5’-CCAAACTGCTCAGCYCTGTC-3’；所述的RACE扩增引物F:5’-TGCTTCAGGTGGATTCGGTGTGGC-3’和R:5’-CACCGAATCCACCTGAAGCAAGAAAC-3’。

牡丹品种‘凤丹’的油体蛋白基因PsOLE1的实时定量引物，所述的定量引物序列为F：CTTCAGTCCTGTTCTTGTCCCC，R：CCGCCTTGTCCTTCATCTCTC，该引物用于鉴定牡丹籽粒的脂肪酸合成进程，并指导牡丹籽粒的收获。

本发明还提供一种辅助快速检测牡丹品种‘凤丹’脂肪酸合成进程的方法，包括提取牡丹籽粒的总RNA，反转录第一链cDNA，利用所述的实时定量引物进行实时定量PCR扩增，退火温度55℃。

本发明还提供了一种牡丹品种‘凤丹’的油体蛋白基因在指导牡丹籽粒收获时间上的应用，利用上述实时定量引物对授粉后不同天数的牡丹品种‘凤丹’的籽粒的cDNA进行扩增，扩增片段为209bp，根据扩增产物的相对表达丰度变化趋势，把扩增产物经过平台期后迅速增高的天数确定为籽粒收获时间。

本发明与现有GC-MS技术相比的有益效果：

本发明中油体蛋白基因的表达水平与牡丹籽粒脂肪酸的积累进程呈现显著的正相关关系，可以用来指导生产中牡丹籽粒收获的时间，与传统GC-MS技术测定脂肪酸含量相比，该检测方便快捷，大大的节约了测定成本，从而为牡丹籽粒的收获时间提供科学的辅助工具。

附图说明

下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

图1：牡丹品种‘凤丹’的种子不同发育时期的百粒重和脂肪酸总含量；

图2：PsOLE1基因的同源扩增产物的电泳结果；

M：DL 2000Marker；1：PsOLE1基因的同源克隆PCR产物(311bp)

图3：PsOLE1基因的RACE扩增产物的电泳结果；

M：DL 2000Marker；5’：5’-RACE PCR产物；3’：3’-RACE PCR产物

图4：PsOLE1的全长cDNA序列与推测编码的氨基酸序列：

起始密码子ATG和终止密码子TGA斜体加粗表示；双下划线标示出poly(A)尾；阴影区域为PsOLE1保守区即功能结构域；波浪线标出跨膜结构域。

图5：PsOLE1在牡丹品种‘凤丹’种子脂肪酸合成过程中的表达模式。

具体实施方式

实施例1

标准溶液的配制

内标溶液的配制：将30mg十九烷酸甲酯(Methyl nonadecanoate)标准品溶于10mL甲醇中，配成质量浓度为3mg/mL的标准液，待用。

脂肪酸成分测定

(1)各称取授粉后不同天数(50-130天)的300mg牡丹品种‘凤丹’的种子，用液氮充分研磨成粉末，溶解于氯仿中，-20℃保存。

(2)将溶解在氯仿中的总脂取出1mL到10mL青霉素小瓶中。

(3)加入100μL内标溶液，之后加入2.5mL 2％H₂SO₄：甲醇溶液(v:v)。

(4)85℃水浴2.5h。

(5)待反应结束，冷却至室温，添入1mL正己烷(色谱级)和1mL饱和NaCl溶液，震荡，放置分层。

(6)将上清液用油膜过滤后直接用于GC-MS分析。脂肪酸甲酯的量通过和内标比对确定。

GC-MS仪器设定：

GC条件：色谱柱：Agilent 7890A-88HP-INNOWAX(100m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱；载气：高纯氦气(99.999％)；进样口温度：250℃；升温程序：120℃保持5min，以3.5℃/min的速率升至240℃，停留10min；进样量：1μL；进样方式：20:1分流进样；柱流量：1.0mL/min；溶剂延迟：3.50min：GC-MS接口温度：250℃。

MS条件：电子电离源：离子源温度230℃，最大值为250℃；四极杆：150℃，最大值200℃；传输线温度230℃；EM电压：70eV；采集方式为全扫描，质量扫描范围m/z：30～400，阈值为100。

数据处理：相同检测条件下，每个样品重复3次，实验结果取其均值，利用生物软件SPSS 18.0对其做相关性分析。

研究报道，种子发育初期脂肪酸含量很低，因此我们选择从授粉后50天开始进行脂肪酸含量的测定。脂肪酸总含量的分析呈现，种子生长过程中，脂肪酸总含量总体是呈增加趋式的，在授粉后50-90天，脂肪酸含量呈现迅速增加阶段，授粉后90-120天阶段呈现平台期且达到最大值，为136.576μg/mg，然后在授粉后120-130天有一个迅速下降趋式；百粒重结果表明从授粉后50-70天，百粒重呈快速增长趋式；授粉后70天后百粒重增长缓慢(见图1)。脂肪酸总含量的变化趋式总体呈增加趋式，这与种子的形态发育基本一致。对种子的重量变化和脂肪酸总含量进行相关性分析发现，相关系数为0.810，在0.01水平上显著相关(见表1)。

表1牡丹品种‘凤丹’的种子重量、脂肪酸含量及PsOLE1基因的相对表达水平

*表示1％水平差异显著

实施例2PsOLE1基因的同源扩增

取自7-8年生的牡丹品种‘凤丹’健康植株(种植于山东省青岛农业大学实验田)的种子，液氮速冻，-80℃冰箱保存，以备用于PsOLE1基因的同源扩增和RACE PCR反应。

(1)同源扩增：

反应体系为50μL，各成分组成如下：2μL反转录的cDNA、5μL10×LA TaqBuffer II(Mg²⁺Plus)、4μL>2O。

同源克隆梯度PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s,50-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果大约在300bp左右有一条较明亮的条带(见图2)。将PCR产物回收，连接至pMD18-T Simple载体上，然后转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落，将阳性克隆送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。利用DNAMAN分析软件和NCBI在线软件对测序片段进行生物信息学分析。

实施例3：PsOLE1基因的RACE PCR：

按照RACE 5’/3’Kit说明书中对RACE引物的要求(23-28nt，50-70％GC，Tm≥65℃)，依据克隆出的PsOLE1同源基因的部分cDNA，设计基因特异性引物(gene-specific primers，GSPs,GSP5’:CACCGAATCCACCTGAAGCAAGAAAC,GSP3’:TGCTTCAGGTGGATTCGGTGTGGC)。50μL体系，5’-RACE组成如下：2.5μL 5’-RACE-Ready-cDNA、5μL 10×UPM、1μL GSP5’(10μM)、41.5μLMaster Mix；3’-RACE组成如下：2.5μL 3’-RACE-Ready-cDNA、5μL 10×UPM、1μL GSP3’(10μM)、41.5μL Master Mix。RACE扩增反应条件如下：94℃，30s，68℃，30s，72℃，3min，共25个循环。将不同时期种子的总RNA混合后为模板进行第一链cDNA(5’-RACE-Ready-cDNA与3’-RACE-Ready-cDNA)的合成。分别以5’-RACE-Ready-cDNA与3’-RACE-Ready-cDNA为模板，以基因特异引物(GSP5’和GSP3’)与UPM配对，经RACE PCR扩增，分别得到5’-RACE PCR产物和3’-RACE PCR产物(见图3)。PCR产物回收纯化，连接载体转化，挑取单菌落，将阳性克隆送测序。

将RACE PCR产物测序结果和已知的部分cDNA序列进行序列拼接，去掉重复序列，得到拼接后的PsOLE1基因cDNA全长。PsOLE1基因全长cDNA为753bp，5'UTR为54bp，3'UTR为258bp，其中含有30个碱基的poly(A)尾，ORF长度为441bp，编码146个氨基酸的多肽，该序列被命名为PsOLE1。起始密码子ATG和终止密码子TGA斜体加粗表示；双下划线标示出poly(A)尾；阴影区域为PsOLE1保守区即功能结构域；波浪线标出跨膜结构域(见图4)。

实施例4PsOLE1基因的实时定量扩增结果

待牡丹授粉后10天取果荚，之后每隔10d取样，直至牡丹授粉后130天终止，去掉果荚皮，速冻，-80℃保存，共13个不同处理，以备用于RNA的提取和第一链cDNA的合成。

RNA的提取参照TaKaRa生物公司试剂盒TaKaRaMiniBEST Plant RNA ExtractionKit说明书进行。cDNA第一链的合成参照TaKaRa的PrimeScript^TM>-ΔΔCt方法。20μL的反应体系组成如下：10μLSYBRPremix>2O。反应程序如下：

-Incubate at 95.0℃for 00:10:00

-Incubate at 95.0℃for 00:00:30

-Incubate at 55.0℃for 00:00:30

-Incubate at 72.0℃for 00:00:30

-Plate Read

-Incubate at 82.0℃for 00:00:01

-Plate Read

-Go to line 2for 44more times

-Incubate at 95.0℃for 00:00:30

-Incubate at 55.0℃for 00:00:30

-Incubate at 95.0℃for 00:00:30

-Melting Curve from 72.0℃to 95.0℃,read every 0.5℃,hold 00:00:01

-END

‘凤丹’授粉后每隔10d取一次样，利用实时定量引物对检测PsOLE1在牡丹种子发育过程中的表达谱(见图5)。结果表明，在牡丹种子发育过程中，PsOLE1同源基因的表达量总体呈明显上升趋式。在种子快速增长期(授粉后50-90天)，PsOLE1基因的相对表达量成指数增长，表明此阶段种子转录水平迅速增加；在种子缓慢增长阶段(授粉后90-110d)，PsOLEs同源基因的相对表达量的增长率相对较为缓慢，呈现平台期；在种子变色阶段(授粉后110-130天)，在授粉后120天时PsOLE1的表达水平以指数倍数增长，达到顶峰；从授粉后120-130天，峰值减半。PsOLE1基因的相对表达量变化和种子重量以及脂肪酸含量变化趋式基本吻合，相关性分析表明种子重量以及脂肪酸含量与PsOLE1基因的相对表达量呈极显著正相关(表1)。由此我们建议在PsOLE1基因的表达水平达到平台期后迅速增长的时间确定为籽粒收获时间，此时脂肪酸含量也达到最高。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛农业大学

<120> 辅助鉴定牡丹品种'凤丹'籽粒脂肪酸合成的专用引物

<130> 无

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> Paeonia suffruticosa

<400> 1

acatgggatc cacagttgct tgtttataat attaacaaat catcatcacc atcaatggct 60

gagtaccaac cccaacccca aaaccaaccc cacggttccc accagcaaca ccctctttct 120

taccaagctg tgaaagcagc cactgccgtg accgccggtg gctcactctt agtcctctcc 180

ggcctgacac tcgctggaac cgtcatagct ctgacaatag ccactcctct cctggtcatc 240

ttcagtcctg ttcttgtccc cgcagtgata acggctgcgc ttttgaccac tgggtttctt 300

gcttcaggtg gattcggtgt ggctgcggtg accgtcttgt catggatcta caggtacgtt 360

accggaaaac acccacctgg cgcggagacg ctcgactcgg cgaggttgaa gctgacgagc 420

aaggctagag agatgaagga caaggcggag cagtttgggc atcagcatct tactgctggt 480

caacacactt cttgaaggtt gtgctgatca tgcaagtttg tggacctccg cttgatttga 540

tggacggctc atgatataga tgggtggaga tcagatggcg atatgagctc tcagttaggg 600

agtcattggg tctgtgtatg tttgttctgc gtctttttgt catattcagt ggtttttctt 660

tttttctttt ttgtgcgtgc atgttgatgt ctttattagt aatgtaatga taataatttg 720

ggcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa753

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 兼并引物F

<400> 2

gtcacwgcyg gtggrtctct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 兼并引物R

<400> 3

ccaaactgct cagcyctgtc 20

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> RACE扩增引物F

<400> 4

tgcttcaggt ggattcggtg tggc 24

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> RACE扩增引物R

<400> 5

caccgaatcc acctgaagca agaaac 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 定量引物F

<400> 6

cttcagtcct gttcttgtcc cc 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 定量引物R

<400> 7

ccgccttgtc cttcatctct c 21