一株脱硫别许旺氏菌及其应用

摘要

本发明公开了一株新筛选的脱硫别许旺氏菌(Alishewanella aestuarii)DS‑21CGMCC No.12882及其在脱除硫化物中的硫的应用，属于生物与环保技术领域。本发明的脱硫别许旺氏菌菌株具有如SEQ ID No.1所示的16SrDNA序列。本发明的脱硫别许旺氏菌菌株可以在高含硫化物的废水中良好生长，能够耐受较高的硫化物浓度，耐受的硫(S2‑)浓度高达981.76mg/L，在脱硫过程中对硫化物的去除效率高，5h硫化物去除率可达到99.17％，单质硫转化率可达到62.19％，具有较高的环保价值和经济效益。

说明书

技术领域

本发明涉及一株别许旺氏菌，具体涉及一株新筛选的脱硫别许旺氏菌及其在生物脱硫中的应用，属于生物与环保技术领域。

背景技术

目前，生物脱硫已经成为了常用的去除硫化物的方法之一。在生物脱硫现有的技术中，常应用自养硫氧化细菌进行硫化物的去除，但也存在一些问题，如菌株的生长速度太慢，不易获得高密度菌体，脱硫效率不高且增加了成本。

如一株耐碱性排硫硫杆菌及其在生物脱硫中的应用(申请号：201110149623.1)，该菌在一定条件下，具有很强的脱除硫化氢的能力，但其不足之处在于该菌的营养类型为自养型，在过程实际应用的时候不易快速获得高密度菌体，且该菌的生长速度也较慢，需培养48h。如一株那不勒斯硫杆菌及其在生物脱硫中的应用(申请号：201410179292.X)，该菌在一定条件下，对还原态的硫化物、单质硫及硫代硫酸盐有较强的氧化能力，但该菌处理硫代硫酸盐废水的时候需要24h才能可实现99％的去除，相比本发明涉及的一株脱硫红细菌要略显不足。

综上所述，可知目前生物脱硫行业中迫切需要一些生长快速，能快速脱除无机硫的高效脱硫菌株。

发明内容

本发明的目的是针对现有脱硫微生物存在的生长慢、不易获得高密度菌体、脱硫速率慢的问题及不足，提供一株高效脱硫菌株及其在含硫化物的废水生物脱硫中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供了一株硫氧化细菌，别许旺氏菌(Alishewanella aestuarii)DS-21，于2016年08月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏编号为：CGMCC No.12882。

本发明提供的别许旺氏菌DS-21从成都市第二污水处理厂好氧曝气池污泥中筛选得到，筛选方法为：采用硫代硫酸钠培养基富集驯化7天，重复3～4次，采用硫化钠培养基进行平板分离，3～4天后菌落生成，挑取单菌落接入硫化钠培养基培养，重复4次以上获得纯菌，其理化特点为：该菌为短杆状、长0.6～1.2μm、宽0.2～0.6μm、革兰氏阴性，有鞭毛；其生长pH为5.0～9.0，最适pH为7.0；生长温度为20～35℃，最适温度为30℃；其菌落呈圆形，表面凸起，颜色为淡黄色；该菌营养类型为兼性营养型，能利用牛肉膏、蛋白胨和酵母粉等有机碳源进行异养快速生长，也能利用二氧化碳为唯一碳源进行自养生长；在以二氧化碳为唯一碳源进行自养生长时，该菌能够利用氧气将硫化物氧化为单质硫或硫酸盐。

2HS^-+O₂→2S+2OH^-

HS^-+2O₂→SO₄^2-+H⁺

其次，本发明还提供了菌株CGMCC No.12882的应用，脱硫效果验证显示，该菌株5h内实现了99.17％的硫化物去除，62.19％的单质硫转化率。该菌株用于生物脱硫。

本发明还提供了在菌株筛选和培养过程中使用到的培养基，其培养基配方为在驯化富集过程中优化得到，配方为：(1)硫化钠培养基，用于菌株筛选和脱硫效果实验，其配方为：Na₂S.9H₂O>2PO₄>2HPO₄>4Cl>2>3>2S₂O₃.5H₂O>2PO₄>2HPO₄>4Cl0.2g，MgCl₂>3>

本发明提供了上述菌株的16SrDNA鉴定结果。经过16SrDNA鉴定及BLAST比对，DS-21与别许旺氏菌(Alishewanella aestuarii)的同源性达到了99％，因此鉴定该菌株为别许旺氏菌(Alishewanella aestuarii)DS-21。本发明提供的别许旺氏菌(Alishewanellaaestuarii)DS-21的16SrDNA基因序列如SEQ ID No.1所示：

AGGGGGATACCAGTTGGAAACGACTGTTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGTGTGGGACCTTCGGGCCACATGCTATCGGATGCGCCTACGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTGGGGAGGAAGGGTGTTGTGTTAATAGCACAGCATTTTGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAACATTCTGATTTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATATGCTTTAAGAGATCCGCTCACTGTCGCCAGCTTGCCTCCCTCTGTACATACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCCTAGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACTAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTTACAGTTCCCGAAGGCACAAACACATCTCTGCGTTCTTCTGTAGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAACC

本发明涉及的相关保藏信息为：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年08月19日；保藏编号：CGMCCNo.12882；命名为：别许旺氏菌(Alishewanella aestuarii)DS-21。

本发明的优点在于：

(1)本发明涉及的别许旺氏菌的营养类型为兼性营养型，在异养条件下实现菌体的快速繁殖，在自养条件下实现高效脱硫。利用有机碳源异养培养基对菌株进行扩大培养获得高密度菌体，用于实现生物脱硫工程的快速启动；

(2)本发明涉及的别许旺氏菌的脱硫速率较快，自养条件下5h硫化物去除率可达到99.17％，单质硫转化率可达到62.19％；

(3)本发明涉及的别许旺氏菌能够耐受较高浓度的硫化物，自养条件下耐受的硫(S^2-)浓度高达981.76mg/L；

(4)符合生物安全法规，该微生物菌株从被高硫化物长期胁迫的选择环境中筛选得到，不会对周围环境和生态平衡造成危害。

附图说明

图1本发明的别许旺氏菌DS-21在扫描电子显微镜(SEM)下的细胞形态。

图2本发明的别许旺氏菌DS-21在自养和异养条件下的生长曲线，其中：(a)自养条件下的生长曲线，(b)异养条件下的生长曲线。

图3本发明的别许旺氏菌DS-21在脱硫效果实验过程中各因素的变化情况，其中：(a)硫化物去除效果变化，(b)单质硫浓度变化。

图4本发明的别许旺氏菌DS-21脱硫形成的生物硫颗粒在扫描电镜(SEM)下的形态。

具体实施方式

以下结合实施例详细说明本发明。实施方案方便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例中涉及到的培养基配方为：

(1)硫化钠培养基，配方为：Na₂S.9H₂O>2PO₄>2HPO₄>4Cl0.2g，MgCl₂>3>

(2)硫代硫酸钠培养基，配方为：Na₂S₂O₃.5H₂O>2PO₄>2HPO₄>4Cl>2>3>

(3)有机碳源异养培养基，配方为：牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化钠5.0g/L，pH 7.0～7.2。

实施例1：菌株筛选

取成都市第二污水处理厂好氧曝气池污泥适量，按20％的接种量加入含5L硫代硫酸钠培养基的反应器中，在pH＝7.0，曝气0.5L/min，30℃的条件下富集培养7天，重复3～4次，采用硫化钠培养基进行平板分离，3～4天后菌落生成，挑取单菌落接入Na₂S.9H₂O培养基培养，重复4次以上获得纯菌。

实施例2：菌株鉴定

将菌株按照相同的接种量接种于硫代硫酸钠液体培养基中，置于不同温度的摇床中(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)培养30h，确定该细菌在20～35℃内可以生长，其最适生长温度为30℃；采取初始pH别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0在最适生长温度下培养30h，确定该菌在5.0～9.0内可以生长，最适生长pH为7.0；

将分离纯化的菌株在扫描电子显微镜(SEM)下观察，结果如图1所示，该菌为短杆状、长0.6～1.2μm、宽0.2～0.6μm、革兰氏阴性，有鞭毛；其菌落呈圆形，表面凸起，颜色为淡黄色；

采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯菌株的全基因组，通过16SrDNA通用引物27F和1492R进行PCR，然后测序分析，测序结果经BLAST比对，鉴定该菌株为别许旺氏菌，命名为DS-21，即为本发明的保藏菌株别许旺氏菌CGMCC No.12882(Alishewanellaaestuarii)DS-21；

对别许旺氏菌DS-21进行生长曲线研究，分别选用硫代硫酸钠培养基进行自养培养和有机碳源异养培养基进行异样培养，结果如附图2(a)、(b)所示：(a)别许旺氏菌DS-21可以在硫代硫酸钠培养基中生长，培养30h后菌液OD值达到0.23；(b)别许旺氏菌DS-21在能够在有机碳源异养培养基中快速生长，培养30h后菌液OD值达到1.20，远高于在无机环境中培养的结果。这说明该菌的营养类型为兼性营养型；在工程应用中可以使用有机碳源异养培养基快速获得高密度菌体。

实施例3：脱硫瓶试

将200ml硫化钠培养基溶液(600mg/L>2-)在紫外下灭菌30分钟，无菌条件下装入已灭菌的500ml三角瓶中，然后加入50ml培养30h的别许旺氏菌菌液，用好氧塞塞住瓶口，置于摇床中振荡(30℃、200r/min)，测定初始硫化物浓度为536.57mg/L>2-；对照组加入等量的无菌水，每个实验组设置三个重复，每隔30分钟取样测定硫化物浓度、单质硫浓度，结果取平均值。在5小时后，其测定计算结果如附图3所示。实验组硫化钠溶液中添加该脱硫菌后，其硫化物浓度比对照明显降低，单质硫转化率明显要高，其中硫化物去除率(a)达到99.17％，单质硫累积浓度(b)最高达333.69mg/L，相应的单质硫转化率为62.19％。

实施例4：脱硫罐试

将5L硫化钠培养基溶液(设计初始浓度为1200mg/L>2-，实测浓度为981.76mg/L)装入已灭菌的8L的反应器中(反应器中添加有软性填料，用以微生物挂膜)，然后加入500ml培养30h的别许旺氏菌菌液，用空气泵曝气，曝气速率为0.4L/min，保持环境温度为28℃～30℃，在此条件下挂膜驯化7天，使微生物能够在填料上附着，然后进行去除硫化物的验证试验；在实现菌体在反应器中挂膜成功后，往反应器中添加1000ml通过紫外灭菌硫化钠培养基溶液；对照组加入等量的无菌水，每个实验组设置三个重复，每隔30分钟取样测定硫化物浓度、单质硫浓度，取其平均值。在4h后，其测定计算结果如下表1所示。

表1别许旺氏菌罐试脱硫效果

由上表可知，在实验组实现挂膜后的反应器中，加入硫化钠溶液4小时后，硫化物浓度比对照组去除率明显要高，单质硫转化率明显要高，其中硫化物去除率可达到99.21％，单质硫转化率可达到51.79％。与实例3相比，成功挂膜的反应器中，该菌株对硫化物的去除速率更快，效率更高，可实施用于脱硫应用。对照组中硫化物的去除是由于空气吹脱导致硫化物的逸出，但从单质硫转化率可以看出，硫化物的去除只是单纯的物理性移除，并不是生物转化去除。

实施例5：生物硫颗粒观察

对别许旺氏菌DS-21处理后废水中的单质硫聚合形成的生物硫颗粒进行了扫描电子显微镜观察，结果如附图4所示：废水中的生物硫颗粒形态大小不一，多为球状。在实际工程应用中，若要把生物硫颗粒从处理后的废水中分离出来，应添加絮凝剂将生物硫颗粒凝集沉淀为更大的颗粒。

序列表

<110>中国科学院成都生物研究所

<120>一株脱硫别许旺氏菌及其应用

<160>1

<210>1

<211>882

<212>DNA

<213>脱硫别许旺氏菌（Alishewanella aestuarii）

<400>1

agggggatac cagttggaaa cgactgttaa taccgcataa tgtctacgga ccaaagtgtg 60

ggaccttcgg gccacatgct atcggatgcg cctacgtggg attagctagt tggtgaggta 120

atggctcacc aaggcgacga tccctagctg gtttgagagg atgatcagcc acactgggac 180

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tggggaggaa gggtgttgtg ttaatagcac agcattttga cgttacccac agaagaagca 360

ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tgcaagcgtt aatcggaatt 420

actgggcgta aagcgcacgc aacaaggccc gggaacgtat tcaccgcaac attctgattt 480

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tatgctttaa gagatccgct cactgtcgcc agcttgcctc cctctgtaca taccattgta 600

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