乳腺癌的尿液蛋白标志物及其在诊断和预后中的用途

摘要

本发明涉及乳腺癌的尿液蛋白标志物及其在诊断和预后中的用途。具体而言，本发明涉及乳腺癌尿蛋白标志物在人乳腺癌疾病早期诊断及病程监测中的用途，所述尿蛋白标志物包括β‑2微球蛋白、α‑1‑酸性糖蛋白1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4‑A、载脂蛋白A‑IV、钙结合蛋白、HLA‑I类组织相容性抗原，A‑3α链、胰石蛋白1α、凝血因子XII、胶原凝集素12、半乳凝素‑3结合蛋白、维生素D结合蛋白等。

说明书

技术领域

本发明涉及临床医学；具体而言涉及人乳腺癌相关的尿液蛋白标志物。具体而言，本发明涉及利用乳腺癌大鼠疾病模型和质谱分析蛋白组学技术获得的人乳腺癌诊断和/或监测相关的尿液蛋白标志物，及其用途。

背景技术

疾病生物标志物是与特殊病理过程相关的可测量的变化，用于诊断疾病、监测病程、预测疾病预后和评估治疗效果等。

尿液是理想的疾病标志物来源，可以用无创的方式大量获得；更重要的是尿液中没有内稳态机制的调控，所以尿液可以富集机体内排泄出的各种变化，而这些变化就是潜在的疾病标志物。同时，内稳态机制的缺乏也决定了尿液在疾病的早期诊断上具有重大的临床应用前景(参见Gao Y.Urine--an untapped goldmine for biomarker discovery.Sci China.Life Sci,2013,56(12):1145；Wu J,Gao Y.Physiological conditions can be reflected in human urine proteome and metabolome.Expert review of proteomics,2015,12(6):623-636.)。

尿液蛋白质组技术(urinary proteomics)作为一种快速发展的分析工具，旨在建立一种无创的“液体活检”(liquid biopsy)诊断方法。在尿液里挖掘疾病特异的生物标志物，部分替代器官穿刺病理检查已成为科学家及临床医生关注的重要研究方向，具有重要的科学意义和巨大的临床应用前景。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升的趋势，乳腺癌的防治已成为全球重大的公共卫生问题。乳房X光片检查是乳腺癌常用的筛查技术，但只有乳房组织内存在可觉察到的结构紊乱或钙化时才能被发现，而此时已经有成百上千的肿瘤细胞了。尽管近年来乳腺癌的诊断技术在不断发展，但仍然有很多病人未能以现有的诊断技术在乳腺癌的早期阶段进行诊断。为了减少乳腺癌的发病率和死亡率，需要考虑针对乳腺癌的新的筛查和早期诊断的方法(参见Beretov J,Wasinger V C,Millar E K A等人，Proteomic Analysis of Urine to Identify Breast Cancer Biomarker Candidates Using a Label-Free LC-MS/MS Approach.PloS one,2015,10(11):e0141876)。

同时，大多数(50％-80％)肿瘤患者会发生恶病质。恶病质是常见的肿瘤合并症，占肿瘤终末期死亡原因的20％以上，是全球最普遍关注的公共卫生问题之一(参见Argilés J M,Busquets S,Stemmler B等人Cancer cachexia:understanding the molecular basis.Nature reviews Cancer,2014,14(11):754-762.)。肿瘤恶病质是一种毁灭性的疾病综合征，早期发现并及时干预对提高肿瘤患者的生存质量尤为重要。

发明内容

鉴于本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方式，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于受试者的乳腺癌早期诊断的试剂中的用途：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原A-3α链、胰石蛋白1α、凝血因子XII、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、维生素D结合蛋白及其组合。

在另一个实施方式中，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于诊断和/或预后乳腺癌疾病的试剂中的用途：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原A-3α链、胰石蛋白1α、凝血因子XII、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、维生素D结合蛋白、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、吸引素、激肽原-1、C-反应蛋白、传递蛋白-2、生长停滞特异蛋白6、血管细胞粘附蛋白1、组织非特异性碱性磷酸酶同功酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、胶原α-1(I)链、免疫球蛋白的λ样多肽1、炭疽毒素受体1、半乳糖凝集素-9C、半乳糖凝集素-9B、聚集蛋白聚糖核心蛋白、前列腺素F2受体的负调节器、二肽基肽酶1、免疫球蛋白κ链V区、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、溶菌酶C、β甘露糖苷酶、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者存在乳腺癌的早期损伤：程序性细胞死亡6相互作用蛋白、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、凝血因子XII、维生素D结合蛋白及其组合。

在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者存在乳腺癌的早期损伤：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、结合珠蛋白相关蛋白、补体C4-A、HLA-I类组织相容性抗原A-3α链、胰石蛋白1α、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白及其组合。

在具体的实施方式中，健康对照是指未患有乳腺癌的个体。

在另一个实施方式中，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于监测受试者的乳腺癌严重程度的试剂中的用途：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原，A-3α链、胰石蛋白1α、凝血因子XII、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、维生素D结合蛋白、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、吸引素、激肽原-1、C-反应蛋白、传递蛋白-2、生长停滞特异蛋白6、血管细胞粘附蛋白1、组织非特异性碱性磷酸酶同功酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、胶原α-1(I)链、免疫球蛋白的λ样多肽1、炭疽毒素受体1、半乳糖凝集素-9C、半乳糖凝集素-9B、聚集蛋白聚糖核心蛋白、前列腺素F2受体的负调节器、二肽基肽酶1、免疫球蛋白κ链V区、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、溶菌酶C、β甘露糖苷酶、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

在具体的实施方式中，对受试者进行取样，和健康对照中的蛋白水平相比较，根据患者尿液中蛋白标志物的变化情况来判断患者乳腺癌的严重程度。

在具体的实施方式中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者乳腺癌进展：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、HLA-I类组织相容性抗原A-3α链、胰石蛋白1α、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、激肽原-1、血管细胞粘附蛋白1、免疫球蛋白的λ样多肽1、半乳糖凝集素-9C、半乳糖凝集素-9B、免疫球蛋白κ链V区、溶菌酶C、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

在具体的实施方式中，相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者乳腺癌进展：程序性细胞死亡6相互作用蛋白、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、凝血因子XII、维生素D结合蛋白、吸引素、C-反应蛋白、传递蛋白-2、生长停滞特异蛋白6、组织非特异性碱性磷酸酶同功酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、胶原α-1(I)链、炭疽毒素受体1、聚集蛋白聚糖核心蛋白、前列腺素F2受体的负调节器、二肽基肽酶1、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、β甘露糖苷酶及其组合。

在另一个实施方式中，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于受试者的乳腺癌肿瘤恶病质诊断的试剂中的用途：二肽基肽酶1、免疫球蛋白κ链V区、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、溶菌酶C、β甘露糖苷酶、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

在具体的实施方式中，对受试者进行取样，和健康对照中的蛋白水平相比较，根据患者尿液中蛋白标志物的变化情况来判断患者是否存在肿瘤恶病质。

在具体的实施方式中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于肿瘤恶病质状态：免疫球蛋白κ链V区、溶菌酶C、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于肿瘤恶病质状态：二肽基肽酶1、三肽基肽酶1溶酶体α-葡糖苷酶、β甘露糖苷酶及其组合。

适用于本公开的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方式中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。

在具体的实施方式中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本公开。

在本公开的技术方案中，所述乳腺癌选自：非浸润性癌、早期浸润性癌、浸润性特殊癌和浸润性非特殊癌。非浸润性癌包括但不限于包括导管内癌、小叶原位癌及乳头湿疹样乳腺癌；早期浸润性癌包括但不限于早期浸润性导管癌、早期浸润性小叶癌；浸润性特殊癌包括但不限于乳头状癌、髓样癌、小管癌、腺样囊性癌、粘液腺癌、大汗腺样癌、鳞状细胞癌；浸润性非特殊癌包括但不限于浸润性小叶癌、浸润性导管癌、硬癌、髓样癌、单纯癌、腺癌。

按照分子分型(参见2011年St.Gallen)，临床上可将乳腺癌划分为：Luminal A型(ER+/PR+，HER-2-)、Luminal B型(ER+/PR+，HER-2+)、HER-2+型(ER-/PR-/HER-2+)和Basal-like型(ER-/PR-/HER-2-)。

乳腺癌也可以按照WHO(2012年及其更新版本)推荐的乳腺肿瘤分类。

在本公开的技术方案中，所述的恶病质是指由肿瘤因素、机体因素以及肿瘤和机体相互作用而导致的机体代谢紊乱引起的代谢综合征(癌症恶病质诊断标准的研究现状，现代中西医结合杂志，2010，Vol19(24)：3129；癌性恶病质发生机制及防治对策，中国使用外科杂志，2015年Vol35(1)：36)。

在具体的实施方式中，根据本公开的蛋白标记物能够用于诊断和/或预后乳腺癌。

在具体的实施方式中，表达水平选自核酸水平和蛋白质水平，尤其是蛋白质水平。

在具体的实施方式中，表达水平是在尿液样本中测定的。

根据另一些实施方式，还提供了一种用于诊断和/或预后乳腺癌疾病的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原，A-3α链、胰石蛋白1α、凝血因子XII、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、维生素D结合蛋白、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、吸引素、激肽原-1、C-反应蛋白、传递蛋白-2、生长停滞特异蛋白6、血管细胞粘附蛋白1、组织非特异性碱性磷酸酶同功酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、胶原α-1(I)链、免疫球蛋白的λ样多肽1、炭疽毒素受体1、半乳糖凝集素-9C、半乳糖凝集素-9B、聚集蛋白聚糖核心蛋白、前列腺素F2受体的负调节器、二肽基肽酶1、免疫球蛋白κ链V区、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、溶菌酶C、β甘露糖苷酶、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

在一些实施方式中，试剂盒中包含上述蛋白的鉴定试剂。在另一些实施方式中，芯片上固定有上述蛋白的鉴定试剂。在一些实施方式中，所述鉴定试剂是抗体或其抗原结合片段。

在具体的实施方式中，提供了一种乳腺癌早期诊断的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原A-3α链、胰石蛋白1α、凝血因子XII、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、维生素D结合蛋白及其组合。

在另一些具体的实施方式中，提供了一种用于受试者乳腺癌病程监测的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原，A-3α链、胰石蛋白1α、凝血因子XII、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、维生素D结合蛋白、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、吸引素、激肽原-1、C-反应蛋白、传递蛋白-2、生长停滞特异蛋白6、血管细胞粘附蛋白1、组织非特异性碱性磷酸酶同功酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、胶原α-1(I)链、免疫球蛋白的λ样多肽1、炭疽毒素受体1、半乳糖凝集素-9C、半乳糖凝集素-9B、聚集蛋白聚糖核心蛋白、前列腺素F2受体的负调节器、二肽基肽酶1、免疫球蛋白κ链V区、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、溶菌酶C、β甘露糖苷酶、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

在另一些具体的实施方式中，提供了一种用于诊断受试者肿瘤恶病质的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：二肽基肽酶1、免疫球蛋白κ链V区、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、溶菌酶C、β甘露糖苷酶、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

根据一些实施方式，提供了一种用于诊断和/或预后受试者中乳腺癌疾病的方法，包括步骤：

1)获得受试者的尿液样本，

2)任选地，从尿液样本中分离蛋白，

3)确定所述受试者的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：

β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原，A-3α链、胰石蛋白1α、凝血因子XII、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、维生素D结合蛋白、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、吸引素、激肽原-1、C-反应蛋白、传递蛋白-2、生长停滞特异蛋白6、血管细胞粘附蛋白1、组织非特异性碱性磷酸酶同功酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、胶原α-1(I)链、免疫球蛋白的λ样多肽1、炭疽毒素受体1、半乳糖凝集素-9C、半乳糖凝集素-9B、聚集蛋白聚糖核心蛋白、前列腺素F2受体的负调节器、二肽基肽酶1、免疫球蛋白κ链V区、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、溶菌酶C、β甘露糖苷酶、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

在具体的实施方式中，使用质谱方法、ELISA方法、或Western方法确定表达水平。

当采用质谱方法确定蛋白及其表达水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括消化步骤。在具体的实施方式中，用蛋白酶消化尿液样本中的蛋白。

根据一些实施方式，提供了一种用于早期诊断受试者中乳腺癌的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原A-3α链、胰石蛋白1α、凝血因子XII、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、维生素D结合蛋白及其组合；

3)将受试者中所述蛋白的表达水平和健康对照中所述蛋白的表达水平进行比较，

4)确定所述受试者是否具有乳腺癌的早期损伤。

在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者存在乳腺癌的早期损伤：程序性细胞死亡6相互作用蛋白、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、凝血因子XII、维生素D结合蛋白及其组合。

在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者存在乳腺癌的早期损伤：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、结合珠蛋白相关蛋白、补体C4-A、HLA-I类组织相容性抗原A-3α链、胰石蛋白1α、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白及其组合。

根据一些实施方式，提供了一种用于监测受试者中乳腺癌严重程度的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原，A-3α链、胰石蛋白1α、凝血因子XII、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、维生素D结合蛋白、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、吸引素、激肽原-1、C-反应蛋白、传递蛋白-2、生长停滞特异蛋白6、血管细胞粘附蛋白1、组织非特异性碱性磷酸酶同功酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、胶原α-1(I)链、免疫球蛋白的λ样多肽1、炭疽毒素受体1、半乳糖凝集素-9C、半乳糖凝集素-9B、聚集蛋白聚糖核心蛋白、前列腺素F2受体的负调节器、二肽基肽酶1、免疫球蛋白κ链V区、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、溶菌酶C、β甘露糖苷酶、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区、及其组合，

3)将受试者所述蛋白的表达水平和健康对照所述蛋白的表达水平进行比较，

4)确定所述受试者的乳腺癌是否进展。

在具体的实施方式中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者乳腺癌进展：β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、结合珠蛋白相关蛋白质、补体C4-A、HLA-I类组织相容性抗原A-3α链、胰石蛋白1α、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、激肽原-1、血管细胞粘附蛋白1、免疫球蛋白的λ样多肽1、半乳糖凝集素-9C、半乳糖凝集素-9B、免疫球蛋白κ链V区、溶菌酶C、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

在具体的实施方式中，相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者乳腺癌进展：程序性细胞死亡6相互作用蛋白、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、凝血因子XII、维生素D结合蛋白、吸引素、C-反应蛋白、传递蛋白-2、生长停滞特异蛋白6、组织非特异性碱性磷酸酶同功酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、胶原α-1(I)链、炭疽毒素受体1、聚集蛋白聚糖核心蛋白、前列腺素F2受体的负调节器、二肽基肽酶1、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、β甘露糖苷酶及其组合。

根据一些实施方式，提供了一种用于诊断受试者肿瘤恶病质的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：二肽基肽酶1、免疫球蛋白κ链V区、三肽基肽酶1、溶酶体α-葡糖苷酶、溶菌酶C、β甘露糖苷酶、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区、及其组合，

3)将受试者所述蛋白的表达水平和健康对照所述蛋白的表达水平进行比较，

4)确定所述受试者的是否处于肿瘤恶病质状态。

在具体的实施方式中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于肿瘤恶病质状态：免疫球蛋白κ链V区、溶菌酶C、免疫球蛋白γ-2链C区、免疫球蛋白λ-6链C区及其组合。

和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于肿瘤恶病质状态：二肽基肽酶1、三肽基肽酶1溶酶体α-葡糖苷酶、β甘露糖苷酶及其组合。

附图说明

图1：肿瘤造模不同时间点大鼠生长曲线。●代表肿瘤模型组；■代表正常对照组。*表示p<0.05；**表示p<0.01。

图2：乳腺癌造模第14天大鼠肿瘤组织HE染色结果。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。

实施例

实施例1.肿瘤动物模型的建立

1.walker256大鼠肿瘤模型是经典的研究肿瘤进展或肿瘤恶病质的动物模型，适合用来研究肿瘤进展过程中病理生理及形态学的变化。

利用该动物模型模拟肿瘤的发病过程，观察肿瘤从正常、早期肿瘤、肿瘤进展及肿瘤晚期恶病质的整体变化，对临床上早期诊断乳腺癌、监测乳腺癌的病情进展、诊断晚期肿瘤恶病质有重要的指导意义。

2.材料与试剂

1)仪器：

大鼠代谢笼：购自北京佳源兴业科技有限公司。

Thermo-Orbitrap Lumos购自Thermo公司。

2)主要试剂：

去离子水来源于MillliQ RG超纯水系统；色谱级乙腈、甲酸和甲醇为Fisher公司生产；碘乙酰铵(IAA)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)从Sigma公司购买；测序级胰酶从Promega公司购买。

3)动物：

雄性SD大鼠(体重150g)购自中国医学科学院实验动物研究所，在标准饲养环境中饲养。

3.实验方法

-肿瘤细胞的传代：将冻存的walker256大鼠腹水快速37℃复苏后，接种大鼠腹腔内，一周后处死动物抽取腹水。腹水用生理盐水稀释后定量接种于另两只大鼠腹腔内。一周后处死大鼠抽取腹水。

-肿瘤的接种：用无菌生理盐水将腹水肿瘤细胞进行稀释10⁷个/ml，将200μl肿瘤细胞悬液注射到大鼠右侧皮下。

-样本收集流程：在造模之前，将大鼠置于代谢笼中收集正常尿液，在造模之后分别于第4、6、9、14天将大鼠置于代谢笼中收集尿液样本。同时每天测量造模后模型组大鼠和正常大鼠的体重。

测试例

测试例1.组织病理学检查

在大鼠肿瘤造模15天，将实施例1中的大鼠安乐死并取大鼠皮下肿瘤组织用福尔马林固定，蜡块包埋后进行HE染色。

测试例2.蛋白质分析

1.尿蛋白提取与保存：各时段尿液于4℃2000g离心20分钟，取上清，置于新EP管内，继续12000g 4℃离心20分钟；取上清，-80℃保存。

2.乙醇沉淀尿液蛋白，用Bradford法测蛋白浓度后进行膜上酶切，参见Wisniewski JR,Zougman A,Nagaraj N,Mann M.Universal sample preparation method for proteome analysis.Nature methods 2009；6:359-62。BCA法测量多肽浓度。

3.LC-MS/MS串联质谱分析：

将多肽样本用0.1％甲酸稀释成0.5μg/μl。多肽样本通过Thermo液相系统EASY-nLC 1200上样系统分离。洗脱时间120分钟，色谱柱流速为0.3μl/min。洗脱梯度为5％至40％流动相B(流动相A为：0.1％甲酸；流动相B为：89.9％乙腈)。洗脱下的肽段使用Thermo Orbitrap Lumos质谱仪进行分析。采用阳离子模式，母离子和子离子的分辨率为120000。

4.数据库检索：

所有质谱结果用mascot软件进行数据库检索。所用数据库为Swissprot_rat。检索条件为：胰酶酶切；允许有2个漏切位点；半胱氨酸+57Da的固定修饰；质谱数据检索容许误差为：母离子0.05Da，子离子0.05Da。

5.蛋白相对定量：

Mascot搜库结果通过Scaffold软件进行蛋白组数据定量分析。蛋白的FDR值设为1％，蛋白至少拥有2个unique多肽。

6.统计分析

将不同时间点的蛋白组数据进行统计分析，筛选出于造模前0天相比谱图数变化倍数在1.5倍以上，p值小于0.05的蛋白作为差异蛋白。

实验结果

1.体重变化：

对不同时间点大鼠体重的测量，发现与对照组相比，walker256大鼠体重明显下降(图1)。

2.HE染色结果：

造模后第15天处死大鼠，对肿块进行HE染色，发现肿块内肿瘤细胞密集，肿瘤模型造模成功(图2)。

3.蛋白鉴定结果：

来源于大鼠5个时期(0天、4天、6天、9天和14天)的尿液，在FDR小于1％的水平，基于两肽以上鉴定的蛋白为533个。

与0天蛋白定量的谱图数进行比对，筛选出其他时间点变化倍数在1.5倍以上及重复测量ANOVA p值小于0.05的差异蛋白，同时使用Uniprot数据库将大鼠蛋白转化为相应的人同源蛋白。

表1显示，在肿瘤早期(造模4天)筛选出差异蛋白13个。并且这13个差异蛋白在肿瘤的其他阶段也有明显差异(表2)，说明了这些蛋白作为肿瘤早期诊断的可靠性。转化为人同源蛋白后，在乳腺癌早期，程序性细胞死亡6相互作用蛋白、载脂蛋白A-IV、钙结合蛋白、凝血因子XII、维生素D结合蛋白表达量降低；β-2微球蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、结合珠蛋白相关蛋白、补体C4-A、HLA-I类组织相容性抗原A-3α链、胰石蛋白1α、胶原凝集素12、半乳凝素-3结合蛋白表达量增加。

表1.乳腺癌早期诊断的尿液蛋白标志物

对不同时间点差异蛋白进行汇总，根据这些变化可以用于监测肿瘤的病程(表2)。

表2.在肿瘤进展过程中蛋白表达水平的变化

将肿瘤晚期(造模14天)这一阶段特异出现的差异蛋白作为肿瘤恶病质的诊断标记物(表3)。

表3.肿瘤恶病质的蛋白标志物