一种同时检测面粉中7种荧光增白剂含量的HPLC‑MS/MS方法

摘要

本发明公开了一种同时检测面粉中7种荧光增白剂含量的HPLC‑MS/MS方法，所述7种荧光增白剂为FWA135、FWA 140、FWA 162、FWA 184、FWA 185、FWA 367和FWA393：包括以下步骤：(1)7种荧光增白剂标准曲线的建立：a、标准品溶液的制备：b、标准品溶液的测定：(2)待测样品中7种荧光增白剂的含量测定：c、供试品溶液的制备：d、供试品溶液的测定。本发明方法可以同时检测面粉中7种荧光增白剂含量，该方法前处理简单，快速、高效，精密度和准确度满足日常监测需求，适用于大批量面粉中7种荧光增白剂的定性定量分析，具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及食品中化学物质的检测方法，具体涉及面粉中7种荧光增白剂含量的HPLC-MS/MS方法。

背景技术

荧光增白剂(FWA)是一种荧光染料，是一种能吸收不可见的紫外光再激发出可见的蓝色或蓝紫色荧光的复杂有机化合物，通过光学效应达到增白的目的，因其优异的增白性能，FWA曾被广泛应用于纺织、洗涤剂、造纸、颜料、油漆及塑料领域^[1]。近年发现有不法商贩为了掩盖食品发黄或不新鲜的品相进行违法添加。人们如果长期食用含有FWA的食品，FWA被人体吸收积累下来，将具有潜在的致癌性。

欧盟和我国对FWA的使用均采取了限制措施，欧盟2002/72/EC列出了FWA393、FWA184、FWA236和FWA368等塑料用荧光增白剂，并明确规定食品包装纸最终产品检测不到该物质迁移到食品中；我国在GB 9685-2008《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》中规定了FWA393、FWA184和FWA236等3种FWAs在部分塑料中的最大使用量，同时限制了FWA393、FWA184的特定迁移量(SML)分别为0.05mg/kg和0.6mg/kg。国家质量监督检验检疫总局制定的《食品用纸包装、容器等制品生产许可实施细则》规定“生产过程中不得使用荧光增白剂”。卫生部为保障消费者健康，进一步打击在食品生产、流通、餐饮服务中违法添加非食用物质和滥用食品添加剂的行为，发布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》，明确了添加在面粉中的荧光增白物质为违法添加的非食用物质。

因此，为保障食品安全，有必要对面粉中的荧光增白剂进行检测。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种同时检测面粉中7种荧光增白剂含量的HPLC-MS/MS方法，所述7种荧光增白剂为FWA 135、FWA 140、FWA 162、FWA 184、FWA 185、FWA 367和FWA 393：

包括以下步骤：

(1)7种荧光增白剂标准曲线的建立：

a、标准品溶液的制备：

取FWA 135、FWA 140、FWA 162、FWA 184、FWA 185、FWA 367和FWA 393标准品，加入溶剂，制备得到标准曲线样品；

b、标准品溶液的测定：

将标准曲线样品注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪进行检测；

色谱条件如下：

色谱柱：Phenomenex>18，规格为2.1mm×100mm，2.6μm；

流动相：流动相A：乙腈-0.1％甲酸，流动相B为水；

梯度洗脱条件为：0.00～1.00min，10％A；1.00～15.50min,90％A；15.50～20.00min，10％A；

质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源；

检测方式：正离子多反应监测(MRM)：

FWA135的母离子-子离子对为m/z 291.1→m/z 107.0，去簇电压为100V，碰撞能量为36eV；

FWA 140的母离子-子离子对为m/z 232.0→m/z 188.0，去簇电压为140V，碰撞能量为40eV；

FWA 162的母离子-子离子对为m/z 242.1→m/z 185.0，去簇电压为190V，碰撞能量为31eV；

FWA 184的母离子-子离子对为m/z 431.1→m/z 415.0，去簇电压为70V，碰撞能量为60eV；

FWA 185的母离子-子离子对为m/z 319.0→m/z 226.0，去簇电压为70V，碰撞能量为45V；

FWA 367的母离子-子离子对为m/z 363.0→m/z 270.0，去簇电压为60V，碰撞能量为47eV；

FWA 393的母离子-子离子对为m/z 415.2→m/z 321.2，去簇电压为150V，碰撞能量为55eV；

根据检测结果得到7种荧光增白剂的标准曲线；

(2)待测样品中7种荧光增白剂的含量测定：

c、供试品溶液的制备：

取待测面粉样品，加乙酸乙酯超声提取，离心，取上清液，氮吹至干，加乙腈溶解，过滤得供试品溶液；

d、供试品溶液的测定：

取供试品溶液，注入高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，以步骤b相同的条件进行检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中7种荧光增白剂的含量。

进一步地，所述色谱条件中，流动相的流速为0.3mL/min。

进一步地，所述色谱条件中，柱温为40℃。

进一步地，所述色谱条件中，进样量为10μL。

进一步地，所述质谱条件中，电喷雾电压为5500V，离子源温度为450℃；

雾化气为N₂，压力45psi；

辅助雾化气为N₂，压力50psi；

碰撞气为N₂，压力7psi；

气帘气体为N₂，压力35psi；

碰撞室出口电压为14eV。

进一步地，所述步骤c的超声提取中，提取的温度为25℃～35℃，优选25℃。

进一步地，所述步骤c的超声提取中，超声的时间为10分钟～20分钟，优选10分钟。

进一步地，所述步骤c中，乙酸乙酯与待测样品的体积重量比为30mL：1g。

进一步地，所述步骤c的氮吹中，氮吹的温度为40℃。

进一步地，所述面粉为低筋面粉、高筋面粉、淀粉、糯米粉、粘米粉、高粱粉或荞麦粉。

本发明方法可以同时检测面粉中7种荧光增白剂含量，该方法前处理简单，快速、高效，精密度和准确度满足日常监测需求，适用于大批量面粉中7种荧光增白剂的定性定量分析，具有广泛的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为甲醇-0.1％FA的FWA393色谱图。

图2为乙腈-0.1％FA的FWA393色谱图。

图3为7种FWAs混合标准溶液的提取离子流色谱。

图4为100mm×2.1mm,1.7μm色谱柱生成的FWA135色谱图。

图5为100mm×2.1mm,2.6μm色谱柱生成的FWA393色谱图。

图6为不同提取溶剂的提取效果对比。

图7为不同超声提取温度的提取效果。

图8为不同超声时间的提取效果。

图9不同提取溶剂体积的提取效果。

图10为不同氮吹温度的提取效果。

具体实施方式

下述实施例中，所述试剂和仪器均来自市售的商品，具体如下：

仪器、试剂与材料

Triple Quad 5500高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(美国Sciex公司)；超声波清洗器(美国CREST公司)；振荡器(日本RIKAKIKAI公司)；CP2250天平(德国Sartorius公司)；0.22μm有机相滤膜(上海安谱公司)。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷(均为色谱纯，德国默克公司)；三氯甲烷、丙酮、正己烷(均为色谱纯，中国赛默飞世尔科技有限公司)；四氢呋喃、甲酸(均为色谱纯，上海安谱公司)；甲苯(分析纯，广州化学试剂厂)；实验用水为Mili-Q制备的超纯水。7种荧光增白剂标准品均购自上海安谱公司：FWA135的纯度99.0％；FWA140、FWA184、FWA185、FWA367、FWA393五种标准品的纯度均为98.0％；FWA162的纯度为95.0％。

面粉购于中山当地市场、超市和粮油店。

实施例1 本发明的方法

1、本发明的方法

(1)标准溶液的配制

先用三氯甲烷配制单个荧光增白剂的储备液，质量浓度均为1000mg/L；再用甲醇稀释配制7种荧光增白剂的混合标准溶液和所需浓度的标准工作液，置于4℃冰箱中避光保存。

(2)样品前处理

准确称取试样1g(精确至0.01g)，置于50mL聚丙烯离心管中，加入30mL乙酸乙酯，涡旋30s后振荡10min，25℃超声提取10min，冷却至室温，以4500r/min的转速离心5min，取6mL上清液于40℃水浴中氮吹至干，用乙腈定容至1mL，过0.22μm有机相滤膜，装瓶上机测定。

(3)色谱条件

色谱柱：Phenomenex>18柱(2.1mm×100mm，2.6μm)；流动相A：乙腈-0.1％甲酸，B：水；梯度洗脱程序：0.00～1.00min，10％A；1.00～15.50min,90％A；15.50～20.00min，10％A；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。

(4)高效液相色谱-三重四级杆质谱仪条件

以5μL/min的注射速度注射浓度为50ng/mL荧光增白剂的混合标准溶液到质谱中，优化质谱条件，优化后质谱条件为ESI正离子模式；电喷雾电压：5500V；离子源温度：450℃；多反应监测(MRM)模式，雾化气(GS1，N₂)压力：45psi；辅助雾化气(GS2，N₂)压力：50psi；碰撞气(CAD，N₂)压力：7psi；气帘气体(CUR，N₂)压力：35psi；碰撞室出口电压(CXP)：14eV。其他质谱参数见表1。

表1 7种荧光增白剂的质谱参数

^a为定量碎片离子

从市场、超市、粮油店随机购买21批低筋面粉、高筋面粉、淀粉、糯米粉、粘米粉、高粱粉和荞麦粉，按照上述方法进行检测。结果如下表2所示。

表2 样品中7种FWAs的检测结果

2、本发明方法的方法学验证

(1)线性范围、方法检出限和定量限

在本发明方法的条件下，以各目标化合物的质量浓度为横坐标(X，μg/L)、响应值的峰面积(Y)为纵坐标建立标准曲线，7种FWAs的线性方程、相关系数、方法检出限和定量限见表3。

表3 7种荧光增白剂的线性关系、相关系数、线性范围、方法检出限及定量限

(2)方法回收率和精密度

在阴性样品基质中进行10、50、100μg/kg 3个添加水平的加标回收实验，每个添加水平进行6次重复试验，回收率和精密度结果见表4。3个添加水平的平均回收率为64.75％～117.50％，相对标准偏差为0.92％～14.40％，表明方法具有良好的精密度和准确度。

表4 面粉中三个浓度加标平均回收率和相对标准偏差(n＝6)

实施例2 本发明方法的工艺筛选

(1)流动相的筛选

发明人在保持色谱柱等条件不变的情况下对方法的流动相进行了优化，分别对乙腈-0.1％甲酸和甲醇-0.1％甲酸作为有机流动相进行了考察。结果表明，甲醇-0.1％甲酸作为有机流动相时，FWA393出现拖尾峰(见图1)，而乙腈-0.1％甲酸作为有机流动相时，各目标化合物的峰形均较好(见图2)。

故选择乙腈-0.1％甲酸作为有机流动相。7种荧光增白剂标准溶液的提取离子流(XIC)色谱图如图3所示。

(2)色谱柱的筛选

比较了Phenomenex>18(100mm×2.1mm,1.7μm)和Phenomenex>18(100mm×2.1mm,2.6μm)两根色谱柱，结果分别如图4和图5所示。FWA135在前者分离出的色谱峰形不好，使用后者，全部目标化合物均可获得较好的峰形，故确定选用Phenomenex>18(100mm×2.1mm,2.6μm)色谱柱。

(3)提取溶剂的筛选

比较了甲醇、乙腈、四氢呋喃、三氯甲烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、正己烷、甲苯9种提取溶剂对自制阳性面粉中FWAs的提取效果，结果见图6。

结果显示，向面粉中加入三氯甲烷，提取液为浑浊状态，溶剂提取难度大；二氯甲烷对面粉中7种FWAs的提取效率均低于60％；使用丙酮作为提取溶剂，阳性面粉中FWA184和FWA367的提取效率低于60％；甲醇、四氢呋喃不能从面粉中提取出FWA393；正己烷、甲苯提取不出面粉中的FWA367；用乙腈和四氢呋喃，FWA140和FWA184两个组分的回收率高于120％；仅采用乙酸乙酯提取时，回收率在73.1％～118.6％之间，因此选用乙酸乙酯作为提取溶剂。

(4)提取温度的筛选

准确称取自制阳性面粉样品1.0g，加入乙酸乙酯10mL、超声提取20min，氮吹温度设定30℃，比较了不同的超声温度(25℃、35℃、45℃、55℃)对7种FWAs提取效率的影响，结果见图7。

结果显示，提取温度为25℃时效果最佳。

(5)提取时间的筛选

考察了不同提取时间(10、20、30、40min)对7种FWAs提取效率的影响，结果见图8。

结果显示，超声时间为10min和20min时，7种FWAs提取效果均较好。而超声时间为30min时，FWA367的回收率高于120％，FWA393的回收率低于60％；超声时间为40min时，FWA185和FWA393的回收率均低于60％。

因此，综合来看，优选超声提取的时间为10min。

(6)提取溶剂体积的筛选

在保持样品1.0g，超声提取温度25℃、时间10min，氮吹温度30℃的条件下，考察了不同体积提取溶剂(10、20、30、40mL)对7种FWAs提取效率的影响，结果见图9。

结果显示，不同的提取溶剂体积对FWA135、FWA140、FWA162影响不大，而FWA367和FWA393仅在提取溶剂体积为30mL时，提取的效果较好。综合来看，优选30mL为提取溶剂体积。

(7)氮吹温度的筛选

考察了不同氮吹温度对面粉中7种FWAs提取效率的影响，结果见图10，不同氮吹温度对FWA135、FWA140、FWA162的影响不大，而FWA184、FWA185、FWA367、FWA393仅在40℃时提取效率较好。综合来看，优选40℃为氮吹温度。

综上所述，本发明方法可以同时检测面粉中7种荧光增白剂含量，该方法前处理简单，快速、高效，精密度和准确度满足日常监测需求，适用于大批量面粉中7种荧光增白剂的定性定量分析，具有广泛的应用前景。