一种铁甲秋海棠叶片离体再生体系建立的方法

摘要

本发明公开了一种铁甲秋海棠叶片离体再生体系建立的方法，其特征在于：包括如下步骤：外植体的选取与消毒、不定芽诱导、不定芽继代获得试管苗、根的诱导、移栽。采用该繁殖方法对铁甲秋海棠进行组织培养，一个培养周期增殖率为1200倍以上，繁殖速度快，有效解决了铁甲秋海棠种苗繁殖的难题。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种铁甲秋海棠(Begonia>)组织培养的繁殖方法。

背景技术

铁甲秋海棠(Begonia>)，秋海棠科（Begoniaceae）秋海棠属（Begonia）多年生草本观叶植物，原产巴西东部一带，叶形优美，叶色绚丽，是室内极好的观叶植物。性喜温暖、湿润、半阴及空气湿度大的环境，忌强光直射。生长适温为22-25℃，不耐高温，气温超过32℃则生长缓慢。

铁甲秋海棠，根茎肥厚，粗短，叶轮廓斜宽卵形至斜近圆形，边缘有密、微凸起的长芒之齿。上面深绿色，有浅色斑纹，下面淡褐绿色。叶和叶柄上密生茸毛，花较小，为黄色。5-7月开花，聚伞花序，花朵饱满呈水红色，袅娜娇艳，亦颇具观赏价值。

然而，作为秋海棠属植物的一种，其种子不易获得，有性繁殖能力弱，且后代多变异，优良性状难以保持。且播种繁殖常用与国内外引种、品种改良和规模性商品生产，播种常规引种以春季4-5月或秋季9-10月为宜。因种子特别细小，播种时需谨慎操作，植物组织培养技术作为当代新兴的生物技术方法之一，具有繁殖系数高、遗传性状稳定、不受季节限制等诸多优点，因而十分适用于优秀观赏植物的推广繁殖，目前已广泛应用于马蹄莲、兰花、菊花、月季等观赏植物的再生产，秋海棠属植物中也有许多品种组培成功。但关于铁甲秋海棠组织培养的报道较少，偶有关于秋海棠属植物的组培报道，何勇等通过蟆叶秋海棠的幼嫩叶片外植体进行组织培养，得出了再生植株，但只是重点研究了愈伤组织的诱导试验，并没有对增殖方法进行摸索（《蟆叶秋海棠离体培养的研究》，湖北农业科学，2009年第8期，1814-1816页），与之前秋海棠相关的申请专利201010504126比较，扦插时间较长，且增殖率较低。徐菲等曾发表文章《蟆叶秋海棠“光灿”组织培养技术研究》，江西农业科学，2011年12期，然而，其整体增殖率较低，一个培养周期增殖率仅为100倍，且周期相对较长。虽然蟆叶秋海棠和铁甲秋海棠均为秋海棠属植物，但品种形态差异较大，套用组培繁殖技术比较困难，而现有报道中未见铁甲秋海棠的组培繁殖技术的研究，现亟需一种铁甲秋海棠高效离体快繁方法，用以推广该优良品种。

发明内容

本发明的目的是为了建立铁甲秋海棠组织培养繁殖体系。

为了达到上述目的，本发明提供了一种铁甲秋海棠叶片离体再生体系建立的方法，包括如下步骤：

（1）外植体的选取与消毒：选取完全展开的成熟健壮叶片作为外植体，冲洗干净后，进行消毒，消毒过程为：先以适量洗涤剂溶液振荡清洗15min，再用自来水流水冲洗40min，取出后于无菌操作台上，用75%酒精消毒10s，立即转入含有0.1%的升汞溶液中消毒25min，再以无菌水冲洗5-6次，每次1min，消毒滤纸吸干表面水分，将叶片边缘切除后切成3-4cm²的方形小块。

（2）不定芽的诱导：取步骤（1）中处理得到的外植体方形小块，将叶片平铺接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为25±2℃，进行暗光照培养20d；所述暗光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1000lx；所述诱导培养基为MS＋2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5mg/L DA-6，pH值为5.8-6.0；

（3）不定芽继代获得试管苗：将诱导得到的不定芽切分后，接入壮苗培养基中进行继代培养30d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1500lx；所述继代壮苗培养基为MS＋0.4 mg/L IBA，pH值为5.8-6.0；一般需要2~3个继代周期（40d左右）使不定芽长成大苗。

（4）根的诱导：将步骤（3）中得到的铁甲秋海棠试管苗接入生根培养基中进行生根培养10d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1500lx；所述生根培养基为1/2MS+0.5 mg/L IBA，pH值为5.8-6.0；待不定根长至3cm左右，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。

(5) 将培养瓶移出组培室，将瓶盖打开，组培苗炼苗2-3天，将组培苗的根浸泡在复合微生物制剂中，10min，移栽入基质中，所述基质优选为：按照2：1的体积比例将泥炭土和珍珠岩混匀。

所述复合微生物制剂为：按照淡紫灰链霉菌发酵液：黄绿木霉发酵液：假丝酵母菌发酵液：粪产碱杆菌发酵液：草炭：磷酸氢二钠重量比＝1：2：3：2：4：1

所述淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)为CGMCC NO.2130；

所述黄绿木霉为黄绿木霉（Trichoderma>）ACCC32248

所述假丝酵母菌具体为假丝酵母菌（Candida utilis）ATCC No.22023;

所述粪产碱杆菌为粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）ATCC 31555。

首先将淡紫灰链霉菌、黄绿木霉、假丝酵母菌、粪产碱杆菌分别按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到10⁷个/克获得发酵液，将上述发酵液按照质量比例1：2：3：2混合，按照重量配比添加草炭、磷酸氢二钠即得。

对于本发明的进一步改进在于，所述步骤（1）中外植体的选取及选取时间：以完全展开的成熟健壮叶片为外植体，在诱导15-20天后即可有效获得大量不定芽，数量多且生长迅速；在3-4月份进行外植体选取和消毒，污染率大大降低。

本发明铁甲秋海棠叶片离体再生体系建立的方法具有以下优点：

组织培养方法其步骤都具有相似性，其结果却具有显著的不同，本申请发明人经过反复实验得出，铁甲秋海棠在初代诱导不定芽的阶段，较弱光照1000lx的暗光培养能够使外植体迅速分裂，获得大量不定芽；后期再采用1500lx的光照强度进行壮苗效果最佳。采用1000lx的光照强度能够诱导出不定芽，强光照会大大抑制不定芽的形成。这可能是由于铁甲秋海棠野生生境为阴暗潮湿条件形成的。

本领域公知，对于植物组培领域研究如何利用植物组织分化再生植株，提高植物的繁殖数量，是科学家研究重要的技术重点也是技术难点，而激素种类及激素浓度使用范围，培养基类型更是重中之重，本申请发明人经过大量创造性劳动，筛选的到最佳的铁甲秋海棠诱导培养基、增殖培养基及生根培养基的成分及激素组合，不仅诱导、增殖效果明显，且出芽时间大大缩短，且壮苗、生根效果显著。

泥炭土具有良好的通透性和较大的盐分平衡能力，珍珠岩吸水、透气，本申请发明人经过多年创造性劳动，进行筛选对比实验，从大量扦插基质中筛选得出泥炭、珍珠岩按照2：1的体积比例结合使用，最适宜铁甲秋海棠生根存活，各基质间互作互应，达到透气、保湿、固根的效果。

利用组合基质培养铁甲秋海棠，能够快速有效的得到大量铁甲秋海棠，解决其短缺的问题；通过对取样时间、灭菌、光照、激素等条件的优化，一个周期内，能够使得铁甲秋海棠增殖率达到1200倍以上，成活后快速达到种苗规格，此外，组培操作不必考虑季节因素，出瓶前可一年四季的扩繁，繁殖系数可以指数化增长，能够高效的得到铁甲秋海棠种苗，大大满足了市场的需求。

具体实施方式

实施例1

外植体取样时间筛选

1、不同季节取样的比较

于12月1日、2月1日、3月1日、4月1日和5月1日五个时间点，选取展叶叶片进行消毒处理和初代诱导。消毒方法均为“先以适量洗涤剂溶液振荡清洗15min，再用自来水流水冲洗40min，取出后于无菌操作台上，用75%酒精消毒10s，立即转入含有0.1%的升汞溶液中消毒25min，再以无菌水冲洗5-6次，每次1min，消毒滤纸吸干表面水分，将叶片边缘切除后切成3-4cm²的方形小块。”污染控制见表1，可以看出最佳取样时间为3-4月份，当年生叶片刚刚展叶。

表1季节取样对污染率的影响

接种时间外植体数污染率12月1日5090%2月1日5080%3月1日508%4月1日505%5月1日5040%

实施例2

外植体筛选：

2、外植体的切割大小筛选

经过消毒处理的外植体叶片，其切割大小的不同也导致培养效果不同。每块切割成3~4cm²的外植体出芽早，数量多，增长极快，且后期壮苗效果好；而每块切割为0.5~1cm²的叶片则出芽晚，且后期壮苗效果差，逐渐趋于褐化或萎蔫。

表2外植体切割大小的影响

外植体切割大小外植体数20d产生芽体数芽体发育情况0.5~1cm²2080长势弱，出现褐化，继代后部分枯死，壮苗效果差3~4cm²20500长势壮，生长无停滞，诱导迅速，无萎蔫现象，继代后迅速成苗

实施例3

光照条件筛选：

3、初代诱导中光照条件的比较

在铁甲秋海棠叶片初代诱导过程中，比较不同光照对叶片外植体诱导不定芽情况的影响。光照条件设置弱光1000lx、强光1500lx、极强光2000lx以及先暗培养1d后正常光照四个梯度。接入培养基20d后观察统计叶片诱导不定芽的情况。

1000lx出芽很多，每块叶片可诱导出200倍的不定芽数。1500lx出芽较少，仅为10倍左右，而极强光2000lx基本没有不定芽出现，先暗培养1d后正常光培养出芽70倍左右，可见，光照条件对铁甲秋海棠叶片诱导不定芽的影响极其显著。

4、壮苗过程中光照条件的比较

在铁甲秋海棠叶片继代壮苗过程中，将光照条件设置弱光1000lx、强光1500lx和极强光2000lx三个梯度。比较不同光照对不定芽壮苗情况的影响。将初代诱导的不定芽接入壮苗培养基30d后观察统计芽体发育的情况。

1000lx光照条件下，不定芽长势一般，叶片较小，展叶周期需15d左右。1500lx不定芽长势较快，展叶周期较短，仅需10d，叶片光亮。极强光2000lx抑制不定芽发育，芽体出现僵硬状态，不发育。可见，在继代过程中增加一定的光照度，有利于铁甲秋海棠叶片不定芽的壮苗，而过度增加光强也会抑制芽体发育。

实施例4

培养基筛选：

5、不定芽诱导培养基的筛选

将消毒切割成3~4cm²的叶块，接入5种培养基中进行不定芽诱导培养20d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1000lx。发现不定芽诱导分化效果最好的培养基为MS＋2.0mg/L>-1+NAA0.1>-1培养基中，虽然外植体的也有较高的出芽率，但增殖相对缓慢。

表3诱导培养基筛选

培养基分化率（%）分化生长情况MS30出芽少，芽体细弱，黄白色MS+2.0mg.L^-16-BA48出芽较少，芽体细弱，淡黄至黄白色MS+1.0mg.L^-16-BA +0.2>-1>90出芽较多，芽体较细弱，增殖较慢，新鲜绿色MS+1.0mg.L^-16-BA +0.1>-1>80出芽较多，增殖较慢，芽体粗壮，新鲜绿色MS＋2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.5mg/L DA-6100出芽极多，生长迅速，芽体饱满，新鲜绿色

6、壮苗培养基的筛选

将诱导得到的不定芽切割后，接入5种壮苗培养基中进行继代培养30d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1500lx。试验发现在MS＋0.4 mg/L IBA培养基更适合于芽的增殖，其增殖系数最高且出芽极多，生长迅速，生成芽体粗壮稠密。

表4壮苗培养基筛选

激素配比（mg·L^-1）增殖系数增殖情况MS＋0.4 mg/L>4.2增殖缓慢，芽体细弱MS＋0.2 mg/L IBA6.7出芽较多，增殖慢，芽体粗MS＋0.4 mg/L IBA9.0出芽极多，增殖迅速，芽体粗壮MS＋0.8 mg/L IBA5.2出芽多，但增殖较慢，芽体细长MS＋1.0 mg/L IBA5.8出芽多，增殖较慢，芽体细长

7、移栽时，淡紫灰链霉菌、黄绿木霉、假丝酵母菌、粪产碱杆菌形成一个良好的微生态系统，各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，微生物分泌根系促生素和抑菌素能够呵护幼苗根系感染腐霉根腐病、疫霉根腐病、细菌性根腐病和茎基腐病及立枯病、猝倒病等苗期病害,从而有效控制苗期的死苗烂棵现象，磷酸氢二钠给根系源源不断供给营养，维持苗强苗壮势头，极大的提高植株的适应性，提高整个成活率，经单因子试验表明，组培苗根部经过该促进剂浸泡后，移栽成活率较之不经过任何处理，提高31.7%。

实施例5

1、外植体的选取与消毒：2015年4月1日，在温室培养的1株铁甲秋海棠上，选取完全展开的成熟健壮叶片10片作为外植体，冲洗干净后，进行消毒，消毒过程为：先以适量洗涤剂溶液振荡清洗15min，再用自来水流水冲洗40min，取出后于无菌操作台上，用75%酒精消毒10s，立即转入含有0.1%的升汞溶液中消毒25min，再以无菌水冲洗5-6次，每次1min，消毒滤纸吸干表面水分，将叶片边缘切除后切成3-4cm²的方形小块，共得到小块80块。

2、不定芽的诱导：取步骤（1）中处理得到的外植体方形小块，将叶片平铺接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为25±2℃，进行暗光照培养20d；所述暗光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1000lx；所述诱导培养基为MS＋2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L DA-6，pH值为5.8-6.0。培养20d后（污染率为0），80块外植体边缘平均长出 8.3个不定芽，共664个不定芽。

3不定芽的继代壮苗：将诱导得到的不定芽切分后（每个继代小块平均带有3.5个芽），接入壮苗培养基MS＋0.4 mg/L IBA中进行继代培养20d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1500lx，壮苗培养基为pH值为5.8，20d后继代一次，二次继代培养20d后不定芽长成大苗，壮苗过程中不定芽仍会增加90%，壮苗40d后不定芽数达1261个。

4根的诱导：将铁甲秋海棠试管苗接入生根培养基1/2MS+0.5 mg/L IBA中进行生根培养10d，培养温度为25±2℃，光照时间为14h/d，光照强度为1500lx；所述生根培养基pH值为5.9；待不定根长至3cm左右，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。

(5) 将培养瓶移出组培室，将瓶盖打开，组培苗炼苗2-3天，将组培苗的根浸泡在复合微生物制剂中，10min，移栽入基质中，所述基质优选为：按照2：1的体积比例将泥炭土和珍珠岩混匀。

所述复合微生物制剂为：按照淡紫灰链霉菌发酵液：黄绿木霉发酵液：假丝酵母菌发酵液：粪产碱杆菌发酵液：草炭：磷酸氢二钠＝1：2：3：2：4：1

所述淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)为CGMCC NO.2130；

所述黄绿木霉为黄绿木霉（Trichoderma>）ACCC32248

所述假丝酵母菌具体为假丝酵母菌（Candida utilis）ATCC No.22023;

所述粪产碱杆菌为粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）ATCC 31555。

1个培养周期内，1株铁甲秋海棠可增殖出1210株，繁殖倍数达1200倍之多。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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