细胞骨架通过YAP调控癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达中的应用

摘要

本发明公开了细胞骨架通过YAP调控癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达中的应用。本发明提供了能够促进微丝解聚的物质在如下(a)或(b)中的应用：(a)促进癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达；(b)制备用于促进癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的产品。实验证明，促进癌细胞中微丝解聚，可以促进癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9蛋白的表达。本发明首先揭示了S100A7、S100A8和S100A9在多种癌细胞中诱导表达的规律，并对设计治疗与S100A7、S100A8和S100A9相关的肿瘤的药物提供了重要的依据，同时对阐明肿瘤的发生和发展提供了重要的理论基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及细胞骨架通过YAP调控癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达中的应用。

背景技术

除了化学信号外，细胞的生长、分化和迁移还受细胞密度和形态的影响。例如体外培养的正常细胞在细胞密度达到融合时(细胞和细胞之间100％接触)，会发生生长的接触抑制(contact inhibition of proliferation)，从而抑制细胞的继续生长。而这种现象也可发生在体内，如肝再生，通过生长的接触抑制来调控器官生长的大小。然而，癌细胞在生长时通过调节自身某些基因的表达或丢失克服了生长的接触抑制，从而实现其无限的增殖能力。细胞形态和细胞密度的改变均可影响细胞骨架的变化。细胞骨架主要包括微丝、微管和中间纤维。微丝，又称肌动蛋白纤维(actin-filament)，在真核细胞中由Actin组成，包括两种存在形式，G-actin和F-actin。微丝结合蛋白包括cofilin，封端蛋白(capping protein)和凝溶胶蛋白(gelsolin)。上述微丝结合蛋白通过剪切F-actin和/或加帽阻止F-actin的聚合。此外特异性解聚F-actin的药物，如细胞松弛素D(cytochalasins)和Latruculin B，也可使F-actin解聚。另外Rho通过与F-actin的结合调控F-actin和应力纤维(stress fiber)。

YAP是Hippo通路中最关键的调节蛋白，近期发现，Hippo信号途径是一种新的抑制肿瘤发生的信号通路，而且YAP/TAZ是Hippo信号途径的核心蛋白。在哺乳动物中，Hippo通路由4个主要的激酶调控YAP的活性。当Hippo信号通路激活后引起Mst1/2活化，Mst1/2激酶与支架蛋白Sav1组成复合物使Lat1/2(Large tumor suppressor；LATS)激酶磷酸化并被激活，磷酸化的Lat1/2激酶又与另一支架蛋白Mob1组成复合物。Lat1/2直接使YAP蛋白上S127被磷酸化后产生一个14-3-3的结合基序，从而可与胞浆中的14-3-3蛋白结合滞留在胞浆中，导致YAP入核减少，或者进一步被磷酸化后通过蛋白酶体途径被降解。由于YAP不具有DNA结合活性。因此，进入核的非磷酸化状态的YAP与其他转录因子结合才能发挥其生物学作用。目前公认的是TEAD和p73。核内YAP与转录因子TEAD(TEA-domain；TEAD)结合，促进或抑制TEAD靶基因的表达，如CTGF和Cyr61，从而调节多种生物学功能，如细胞生长、细胞接触抑制、控制组织器官的大小和干细胞的自我更新等。TAZ是YAP的同源蛋白，与YAP有相同或类似的生物学作用，如也可被LATS1/2磷酸化，入核的TAZ也可与TEAD结合促进CTGF和CYR61的表达。此外YAP也可与p73结合调控与细胞凋亡相关基因的表达，如Bax和DR5等。此外也有报道，在多种肿瘤组织中发现核内YAP的表达增高，这就提示YAP的活性与肿瘤的发生和发展密切相关。YAP的活性除了受Hippo通路调节外，近几年也陆续报道了其他激酶也可调节YAP磷酸化活性。如胞浆中YAPS127磷酸化后可进一步被CK1δ/ε磷酸化，并通过蛋白酶体使其降解。尽管这一领域正迅速发展，但有关YAP调控与癌症相关的蛋白的研究，如S100A7、S100A8和S100A9蛋白的研究未见任何报道。

S100A7又名银屑素(psoriasin)，最初牛皮癣中增生的表皮角质细胞中分离得到。其基因位于人染色体1q21的EDC区域上，由三个外显子与两个内含子构成。研究认为，S100A7在皮肤细胞中表达并分泌，能起到杀灭细菌的抗菌肽(antimicrobial peptide)作用，帮助皮肤细胞抵御大肠杆菌等病菌入侵，并作为免疫趋化因子，吸引CD4⁺淋巴细胞和中性粒细胞等参与炎症反应。S100A7在牛皮癣中大量表达，故S100A7又名psoriasin。此外，S100A7在包括异位性皮炎、蕈样肉芽肿、硬化萎缩性苔藓等多种皮肤疾病中异常高表达，显示其在皮肤分化中可能发挥作用。目前研究发现，S100A7可以被多种因素诱导表达。在正常上皮组织中S100A7表达较低，但可被多种可被皮肤损伤及实验性屏障破坏实验(experimental>

S100A8/S100A9基因与S100A7同样定位于染色体1q21的EDC区域上，基因皆由三个外显子与两个内含子构成。S100A8/A9蛋白结构类似，也由靠近N端与C端的两个EF-手相结构域及中央铰链区构成，分子量分别为11KDa/13KDa。S100A8/S100A9常以钙离子依赖的方式形成异源二聚体蛋白复合物的形式存在。这两种蛋白在骨髓细胞、单核细胞、粒性白细胞、破骨细胞中呈组成型表达。此外、S100A8/A9在很多组织中呈共表达。S100A8/S100A9在正常细胞内可发挥多种功能。研究发现，敲除S100A8后，小鼠胚胎不能存活，这说明S100A8在体内发挥不可替代的重要作用。在巨噬细胞、树突状细胞及微血管上皮细胞中，S100A8可被炎性刺激诱导表达，且在中性粒细胞细胞质中，S100A8蛋白量占总蛋白量20％之多，显示其可能在炎症反应及机体免疫作用中发挥作用。此外研究还发现小鼠上皮细胞中，氧应激可刺激S100A8表达。S100A9同样在炎症反应与免疫系统中发挥作用。研究表明，S100A9在人体内可以作为趋化因子吸引中性粒细胞并刺激其合成整合素，从而促进中性粒细胞对组织中纤维连接蛋白的粘附。有研究还表明，S100A9可以通过激活NF-κB信号通路在巨噬细胞中诱导TNF-α和白细胞介素的表达，并可通过TLR-4受体激活中性粒细胞从而调节免疫系统。S100A9的另一项重要功能是它可以作为清道夫清除体内活性氧，保护细胞免受氧损伤。除单独发挥功能外，S100A8/A9在形成异源复合物后，可以发挥更广泛的功能。如S100A8/A9复合物可以抑制酪蛋白激酶1/2的活性，调节骨髓造血干细胞分化、帮助细胞内不饱和脂肪酸运输、与P67和RAC-2相互作用在巨噬细胞中激活NAPDH氧化酶等多种功能。S100A8及S100A9在癌症发生发展中也起重要作用。在胃癌中，发现S100A8及S100A9表达上调，在胃癌中肿瘤内间质细胞及炎细胞大量表达及分泌S100A8/A9、而S100A8/A9通过增加P38MAPK的磷酸化，激活NF-KB信号通路，进而增加MMP2/MMP12的表达，从而增加肿瘤的侵袭转移能力。亦有研究证明，在胃癌中，免疫抑制细胞(MDSCs)表达并分泌S100A8/A9，进而抑制免疫系统对癌细胞的攻击。在肺癌中，S100A8/A9在腺癌及晚期癌症中显著表达上调，且与临床预后有关。Hiratsuta等人发现，肺癌中原发肿瘤通过诱导转移灶正常细胞分泌S100A8和S100A9，吸引MaC-1阳性巨噬细胞，且S100A8/A9同样可以在肿瘤细胞内通过激活MAPK和P38信号通路，增加肿瘤侵袭转移能力^[24]。在乳腺癌中，研究则发现S100A8/A9可能在肿瘤细胞抗药性中发挥作用，SwarmaliAxharyya等人发现，虽然化疗药物能杀伤并抑制癌细胞生长，但同时化疗也使内皮细胞产生TNF-α。TNF-α通过NF-κB信号通路增强了肿瘤细胞中CXCL1/2的表达，从而招募了能表达CXCR2的CD11b(+)Gr1(+)髓细胞，髓细胞分泌S100A8/A9促使肿瘤细胞增殖活性和转移性增加，抵消了化疗药物效果。在肝癌中，S100A8和S100A9在人和小鼠肝癌组织中都有明显上调表达，并认为其可通过NF-KB信号通路改变癌细胞内活性氧浓度从而增加癌细胞生存能力。在结肠癌中，研究发现S1100A8和A9可以通过磷酸化smad2/3来激活Smad4信号通路，促进癌细胞迁移和增殖。此外，在卵巢癌、胆囊癌、前列腺癌、胰腺癌、血癌等多种癌症中，都有文献报道S100A8及S100A9表达失常并在癌症发生发展中起作用。综上所述，S100A8和S100A9在多种肿瘤细胞中高表达，并介导肿瘤细胞的生长和迁移。

发明内容

本发明的目的是提供细胞骨架通过YAP调控癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达中的应用。

本发明提供了能够促进微丝解聚的物质在如下(a)或(b)中的应用：

(a)促进癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达；

(b)制备用于促进癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的产品。

活性成分为能够促进微丝解聚的物质，且能够用于促进癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的产品也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了能够促进微丝聚合的物质在如下(c)或(d)中的应用：

(c)抑制癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达；

(d)制备用于抑制癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的产品。

活性成分为能够促进微丝解聚的物质，且能够用于抑制癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的产品也属于本发明的保护范围：

在本发明中，所述能够促进微丝解聚的物质可为微丝解聚药物或Rho激酶活性抑制剂；具体的，所述微丝解聚药物为红海海绵素B(Latrunculin B)或细胞松弛素D(cytochalasins D)；所述Rho激酶活性抑制剂为肉毒杆菌毒素C3(botulinum toxin C3)；

在本发明中，所述能够促进微丝聚合的物质可为能够抑制微丝结合蛋白活性的物质；具体的，所述能够抑制微丝结合蛋白活性的物质为能够抑制Gelsolin蛋白活性的物质或能够抑制CapZ蛋白活性的物质；更加具体的，所述能够抑制Gelsolin蛋白活性的物质为能够沉默所述Gelsolin蛋白的编码基因的核酸分子；所述能够抑制CapZ蛋白活性的物质为能够沉默所述CapZ蛋白的编码基因的核酸分子。

进一步，所述“能够沉默所述Gelsolin蛋白的编码基因的核酸分子”为将序列表中序列4和序列5所示的两条单链核酸退火形成的双链核酸；所述“能够沉默所述CapZ蛋白的编码基因的核酸分子”为将序列表中序列6和序列7所示的两条单链核酸退火形成的双链核酸。

下述方法I或方法II也属于本发明的保护范围：

方法I：促进癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的方法，包括如下步骤：促进所述癌细胞中微丝解聚，从而实现促进所述癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白的表达；

其中，促进所述癌细胞中微丝解聚是通过向所述癌细胞中导入前文所述的能够促进微丝解聚的物质来实现的。

方法II：抑制癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的方法，包括如下步骤：促进所述癌细胞中微丝聚合，从而实现抑制所述癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白的表达；

其中，促进所述癌细胞中微丝解聚是通过向所述癌细胞中导入前文所述的能够促进微丝聚合的物质来实现的。

在本发明中，所述S100A7蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述S100A8蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述S100A9蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

在本发明中，所述癌细胞可为如下中任一种：肺癌细胞、宫颈鳞癌细胞、表皮癌细胞和口腔鳞癌细胞。更进一步，所述肺癌细胞具体可为NCI-H292细胞或H226Br细胞；所述宫颈鳞癌细胞具体可为HCC94细胞；所述表皮癌细胞具体可为A431细胞；所述口腔鳞癌细胞具体可为FaDu细胞。

所述方法I在制备S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明中，以上所有的所述产品均可为药物。

实验证明，促进癌细胞中微丝解聚，可以促进YAP磷酸化，使YAP活性降低，进而促进癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9蛋白的表达。本发明首先揭示了S100A7、S100A8和S100A9在多种癌细胞中诱导表达的规律，并对设计治疗与S100A7、S100A8和S100A9相关的肿瘤的药物提供了重要的依据，同时对阐明肿瘤的发生和发展提供了重要的理论基础。

附图说明

图1为免疫组化检测S100A7、S100A8和S100A9在多种癌细胞中的表达情况。其中，Br即表示H226Br细胞。图中被染成棕褐色的为阳性细胞。

图2为抑制Rho激酶的活性对癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9表达的影响。其中，NC表示未经botulinum toxin C3处理的对照细胞。C3即表示经botulinum toxin C3处理的细胞。H292细胞即表示NCI-H292细胞。

图3为解聚微丝可促进S100A7、S100A8和S100A9的表达。其中，NC表示未经Latrunculin B和cytochalasins D处理的对照细胞。Cyto D表示经cytochalasins D(0.05μmol/L)处理后的细胞；Lat B表示经Latrunculin B处理后的细胞。H292细胞即表示NCI-H292细胞。

图4为抑制微丝结合蛋白活性对YAP活性及其S100A7、S100A8和S100A9表达的影响。其中，siNC表示未导入siRNA的贴壁培养的对照细胞。Suspension表示悬浮培养，high cell desity表示高密度贴壁培养。

图5为各种癌细胞至裸鼠成瘤后肿瘤组织的免疫组化结果。图中被染成棕褐色的为阳性细胞。其中，Br即表示H226Br细胞。H292细胞即表示NCI-H292细胞。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所有的定量实验结果均为平行实验的结果平均值。所有的实验均被重复两次及两次以上。实验组和它们相应的对照组均使用GraphPad软件进行双尾T检验。其中，P值小于0.05被认为是显著差异。

NCI-H292细胞：记载于“唐伟.多聚左旋精氨酸对NCI-H292细胞炎症介质调节作用的研究.安徽医科大学,2014年硕士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实验使用。

HCC94细胞：记载于“杨丞,饶翔,张弦.Twist基因转染对人宫颈癌细胞生物学行为影响的观察.中华肿瘤防治杂志,2013年03期”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实验使用。

A431细胞：记载于“张斌.核激素受体在皮肤主要构成细胞和表皮鳞癌A431细胞中的表达及其部分配体的调节效应.第三军医大学,2013年博士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实验使用。

FaDu细胞：记载于“路武豪.HPV-16感染对喉咽鳞癌和FaDu细胞的生物学行为影响及miRNAs表达的调控.郑州大学,2013年博士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实验使用。

H226Br细胞：记载于“Chiu-Chin Hwang,Kang Fang,Limin Li,et al.Insulin-likegrowth factor-I is an autocrine regulator for the brain metastatic variant of a humannon-small cell lung cell line.Cancer Letter,94(1995)157-163”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实验使用。

A431、NCI-H292、HCC94细胞株使用含10％(体积分数)FBS的1640培养基培养，FaDu细胞株用含10％(体积分数)FBS的MEM培养基培养，H226Br细胞使用含10％(体积分数)FBS的DMEM培养基，培养条件5％CO₂，恒温37℃。

本发明涉及到如下各蛋白：(1)YAP蛋白，氨基酸序列如序列表中序列1所示，编码基因如序列表中序列5所示；(2)S100A7蛋白，氨基酸序列如序列表中序列2所示；(3)S100A8蛋白，氨基酸序列如序列表中序列3所示；(4)S100A9蛋白，氨基酸序列如序列表中序列4所示。

实施例1、S100A7、S100A8和S100A9蛋白在癌细胞中的表达

首先，本发明的发明人采用免疫组化的方法检测了多种癌细胞(H226Br细胞、NCI-H292细胞、HCC94细胞、A431细胞和FaDu细胞)在正常培养条件下(是指每种贴壁培养的细胞株在进行日常传代时所需的细胞密度)细胞中S100A7、S100A8和S100A9蛋白的表达。

具体按照如下进行操作：

取待实验的细胞爬片，PBS洗一次，3.4％(3.4g/100ml)甲醛(PBS配)室温固定20min，PBS-0.5％(体积分数)Triton室温通透10min，PBS洗一次后用3％(体积分数)过氧化氢-PBS室温孵育15min灭火内源过氧化物酶，PBS洗一次后用3％(体积分数)牛血清-PBS室温封闭20min，随后孵育一抗过夜或37℃1h，PBS洗3次(每次10min)，孵育HRP标记的二抗，15min室温，PBS洗3次(每次5min)，DAB显色3min后苏木素复染，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片，显微镜下观察染色情况。

其中，用于检测S100A7蛋白的一抗为兔抗人S100A7(Psoriasin)抗体(Santa CruzBiotechnology公司产品，产品目录号为SC67047)；二抗为快捷型酶标羊抗兔/鼠IgG聚合物(迈新试剂公司产品，产品目录号为KIT-5010)。用于检测S100A8蛋白的一抗为anti-hS100A8(R&B公司产品，产品目录号为MAB4570)；二抗为快捷型酶标羊抗兔/鼠IgG聚合物(迈新试剂公司产品，产品目录号为KIT-5010)。用于检测S100A9蛋白的一抗为羊抗人S100A9(Calgranulin B)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC-8114)；二抗为快捷型酶标兔抗羊IgG聚合物(迈新试剂公司，产品目录号为KIT-5107)。

结果显示，S100A7、S100A8和S100A9蛋阳性细胞在上述检测的癌细胞系(H226Br细胞、NCI-H292细胞、HCC94细胞、A431细胞和FaDu细胞)中均有表达，但比例非常低。除了HCC94细胞中S100A7的阳性细胞比例在10％左右外，其他癌细胞中的S100A7、S100A8和S100A9以及HCC94细胞中的S100A8和S100A9的阳性细胞比例<1％(图1)。

实施例2、Rho激酶通过调节癌细胞中YAP的活性来调控S100A7、S100A8和S100A9的表达

本发明的发明人采用Rho激酶的特异性抑制剂肉毒杆菌毒素C3(botulinum toxinC3)处理癌细胞(NCI-H292细胞、HCC94细胞和A431细胞)，然后一方面采用RT-PCR检测处理后细胞中S100A7、S100A8和S100A9在转录水平的表达情况。另一方面采用Western blot检测处理后细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9蛋白表达情况。具体如下：

一、采用botulinum toxin C3处理癌细胞

在60mm培养皿中铺90万个细胞，培养24h。将botulinum toxin C3用无菌水溶解，按量加入到4mL的1640无血清培养基中，使终浓度为1μg/mL。混匀后加入到培养皿中，培养4h后更换成1640有血清培养基。培养48h后提蛋白检测(botulinum toxinC3为Cytoskeleton公司产品，产品目录号为CT04)。

二、RT-PCR检测botulinum toxin C3处理后癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达情况

1、细胞总RNA提取与cDNA的制备

取步骤一botulinum toxin C3处理后获得的细胞，预冷PBS缓冲液清洗三次，加入1mL Trizol，用移液枪吹吸使细胞完全裂解，将Trizol裂解液置于EP管中，室温孵育5min；加入200μL氯仿，涡旋震荡混匀，室温孵育3min，冰上静置15min；12000rpm4℃离心20min，吸上清至另一EP管中；加入500μL异丙醇，缓慢混匀至溶液变清澈为止，室温静置10min；12000rpm 4℃，离心10min，吸去上清；加1ml无水乙醇，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心10min，吸取上清；加DEPC水配75％乙醇，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心10min，吸去上清；超净台中吹干至EP管底部沉淀透明成为RNA粉末，可于-20℃冻存。

向RNA干粉中加入适量DEPC水溶解，使用紫外分光光度计测定其浓度；用DEPC水将RNA稀释成1μg/μL，配制以下反应体系：RNA溶液2μL；Oligo(dT)₁₅0.5μL；DEPC水2.5μL。

以上混合液72℃，5min，时间结束立即取出冰上放置5min，再加入以下试剂：5×M-MLV RT buffer 4μL；dNTPs 8μL；DEPC水2μL；M-MLV反转录酶1μL。

以上混合液42℃，60min；72℃，15min；cDNA即合成完成，储存于4℃或冻存于-20℃冰箱待用。

2、RT-PCR检测基因表达

以GAPDH为内参，每个样品4个平行，阴性对照中cDNA模板以三蒸水代替。

其中，用于扩增YAP基因(Genbank：NM_001130145.2)的引物序列如下：

YAP-F：5’-CCTCTATTTTGCTCTTCCTTGTCC-3’；

YAP-R：5’-CCATCATCCAAACAGGCTCAC-3’。

用于扩增S100A7基因的引物如下：

S100A7-F：5’-CTTCCCCAACTTCCTTAGTG-3’；

S100A7-R：5’-GTAGTCTGTGGCTATGTCTC-3’。

用于扩增S100A8基因的引物如下：

S100A8-F：5’-AAGGGGAATTTCCATGCCGTCTA-3’；

S100A8-R：5’-GGCTGCCACGCCCATCTTTA-3’。

用于扩增S100A9基因的引物如下：

S100A9-F：5’-GGCACCCAGACACCCTGAACC-3’；

S100A9-R：5’-CCTCGCCATCAGCATGATGAACT-3’。

用于扩增内参GAPDH的引物序列如下：

GAPDH-F：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；

GAPDH-R：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。

反应体系：10μL SYBR、2μL引物、7μL无菌水、1μL cDNA。

反应程序：第一步：95℃10min。第二步：94℃15s，60℃1min,40个循环。

实验同时设置未经botulinum toxin C3处理的相应癌细胞作为对照。

结果显示，与未经botulinum toxin C3处理的对照细胞相比，处理后的癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达量均有所增加。

三、Western blot检测botulinum toxin C3处理后癌细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9的表达情况

1、细胞总蛋白的提取

取步骤一botulinum toxin C3处理后后获得的各细胞，胰酶消化(若为悬浮细胞则直接离心)，1000rpm离心5min沉淀细胞；预冷的PBS洗三次，将细胞沉淀收集至EP管内；加入沉淀体积3-5倍量的RIPA裂解液，吹打混匀至无细胞团块，混悬仪上4℃混悬1h；4℃，12000rpm离心40min，吸取离心产物中部的澄清液体即蛋白提取液，随后用Bradford法检测样品蛋白浓度；向蛋白提取液中加入1/5体积的6×proteinloading buffer混匀，沸水浴5min使蛋白二硫键打开并变性，分装后-20℃保存备用。

2、免疫印迹(Western blot)实验

首先，配置12％的Tricine-SDS-Page胶，配方如下(以一块胶为例)：AB-32.67ml；3×Gel buffer 3.33ml；甘油1g；纯水4ml。搅拌混匀后加入10％AP 50μl，TEMED 5μl稍混匀后灌筑分离胶，水压胶，待分离胶凝后，再按照如下配方配置浓缩胶(一块胶为例)：AB-30.25ml；3×Gel buffer 0.75ml；纯水2ml。搅拌混匀后加入10％AP 20μl，TEMED 2μl稍混匀后灌筑样品胶。

胶配置完成后在胶槽上下分别加入阴极，阳极缓冲液，取等量蛋白样品及蛋白Marker上样，先30V恒压电泳待样品全部进入胶内，再80V恒压进行样品胶电泳，样品进入分离胶后电压加大至100伏电泳90min；取出并切下分离胶，使用Bio-Rad湿转仪将蛋白转至PVDF膜(甲醇预先激活)上，350mA恒流转膜2h；用TBS配置的5％脱脂奶粉溶液将膜室温封闭1h；加入目的蛋白的一抗，湿盒内37℃孵育1h或4℃孵育过夜；TBS洗膜3-5次，每次5min；加入HRP标记的对应一抗种属的二抗，37℃孵育1h；TBS洗TBS洗膜3-5次，每次5min。随后使用化学发光法或酶法显色。

其中，用于检测YAP蛋白的一抗为YAP(63.7)(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-101199)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S127-YAP蛋白的一抗为p-YAP(S127)Rabbit mAb(CST公司，产品目录号为D9W2I)；二抗为Anti-Rabbit IgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A7蛋白的一抗为兔抗人S100A7(Psoriasin)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC67047)；二抗为Anti-RabbitIgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A8蛋白的一抗为anti-hS100A8(R&B公司产品，产品目录号为MAB4570)；二抗为Anti-IgG(H+Lchain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S100A9蛋白的一抗为羊抗人S100A9(Calgranulin B)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC-8114)；二抗为donkey anti-goat IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-2020)。以GAPDH作为内参，用于检测GAPDH蛋白的一抗为小鼠抗人GAPDH单抗(中杉金桥公司，产品目录号为TA-08)；二抗为Anti-IgG(H+Lchain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。

实验同时设置未经botulinum toxin C3处理的相应癌细胞作为对照。

结果如图2所示，与未经botulinum toxin C3处理的对照细胞相比，处理后的癌细胞中S127-YAP表达水平提高了，同时也提高了S100A7、S100A8和S100A9在癌细胞中的表达量。可见，抑制了Rho激酶的活性可明显促进YAP蛋白的磷酸化，提高S127-YAP表达水平，进而降低YAP蛋白活性，从而明显提高S100A7、S100A8和S100A9在癌细胞中的表达。

由于RhoA/Rho激酶的活化信号使其底物肌球蛋白磷酸酶发生磷酸化进而失活，失活的肌球蛋白磷酸酶不能将肌球蛋白轻链(MLC)脱磷酸化，使得细胞浆内磷酸化MLC水平提升，肌动-肌球蛋白交联增加，从而可以促进肌动蛋白微丝骨架的聚合(参见“赵雪峰等.RhoA/Rho激酶信号通路与肺动脉高压.国际病理科学与临床杂志,2011年06月，第31卷第3期”一文)，因此，本实施例的实验结果表明通过抑制Rho激酶的活性，促进微丝解聚可以促进癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达。

实施例3、微丝解聚药物可促进癌细胞中YAP的活性和S100A7、S100A8和S100A9的表达

为了进一步验证促进癌细胞中微丝解聚可以提供细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达水平，本发明的发明人采用微丝解聚药物(Latrunculin B和cytochalasinsD)处理癌细胞(NCI-H292细胞和HCC94细胞)。然后采用Western blot检测处理后细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9蛋白表达情况。具体如下：

一、采用Latrunculin B和cytochalasins D处理癌细胞

在60mm培养皿中铺90万个细胞，培养24h。将Latrunculin B用二甲基亚砜溶解，按量加入到4mL的1640无血清培养基中使终浓度为20μg/mL。混匀后加入到培养皿中，分别在培养6h和24h后提蛋白检测(Latrunculin B为SIGMA公司产品，产品目录号为L5288)。

在60mm培养皿中铺90万个细胞，培养24h。将cytochalasins D用三氯甲烷溶解，按量加入到4mL的1640无血清培养基中使终浓度为0.05μmol/L或0.1μmol/L。混匀后加入到培养皿中，培养48h后提蛋白检测(Cytochalasins D为SIGMA公司产品，产品目录号为C8273)。

二、Western blot检测Latrunculin B和cytochalasins D处理后癌细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9的表达情况

具体操作参见实施例2步骤三进行。

实验同时设置未经Latrunculin B和cytochalasins D处理的相应癌细胞作为对照。

结果如图3所示，可见Latrunculin B和cytochalasins D均可明显促进YAP蛋白的磷酸化，提高S127-YAP蛋白的表达水平，同时促进S100A7、S100A8和S100A9蛋白在癌细胞中的表达。

实施例4、抑制微丝结合蛋白Gelsolin和CapZ可抑制癌细胞中YAP的活性和S100A7、S100A8和S100A9的表达

采用Polyplus公司转染试剂jetPRIME(产品目录号为PT-114-15)将特异性的siCofilin、siGelsolin和siCapZ导入癌细胞HCC94和A431中。沉默或过表达24小时后将细胞悬浮培养或高细胞密度(细胞密度为75000-150000个细胞/cm²培养面积)贴壁培养，采用western>

一、将si-Cofilin、si-Gelsolin和si-CapZ导入癌细胞

在60mm培养皿中铺70万个细胞，培养24h。将转染试剂(jetPRIME)、Buffer与siRNA混匀，静置10min，均匀滴加到培养基中。48h后收细胞提蛋白，进行检测。

其中，用于干扰Cofilin基因表达的siRNA为由如下A和B所示的两条单链退火而成的双链。

A：5’-GGUGUCAUCAAGGUGUUCATT-3’；

B：5’-UGAACACCUUGAUGACACCTT-3’。

用于干扰Gelsolin基因表达的siRNA为由如下C和D所示的两条单链退火而成的双链。

C：5’-CUGGGUUGGAAAGGAUUCUTT-3’(序列4)；

D：5’-AGAAUCCUUUCCAACCCAGTT-3’(序列5)。

用于干扰CapZ基因表达的siRNA为由如下E和F所示的两条单链退火而成的双链。

E：5’-GUACGCUGAACGAGAUCUATT-3’(序列6)；

F：5’-UAGAUCUCGUUCAGCGUACTT-3’(序列7)。

实验同时设置未经si-Cofilin、si-Gelsolin和si-CapZ转染的相应细胞作为对照。

二、Cofilin、Gelsolin和CapZ沉默效果的鉴定

参照实施例2步骤二进行RT-PCR检测。

其中，用于扩增Cofilin基因的引物序列如下：

Cofilin-F：5’-GACTGCCGCTATGCCCTCTA-3’；

Cofilin-R：5’-TGCAATTCATGCTTGATCCCT-3’。

用于扩增Gelsolin基因的引物序列如下：

Gelsolin-F：5’-TCCAACGATGCCTTTGTTCTGA-3’；

Gelsolin-R：5’-CATCTGGCTCGCTGCCTTCT-3’。

用于扩增CapZ基因的引物序列如下：

CapZ-F：5’-TGGACTGTGCCTTGGACCTAA-3’；

CapZ-R：5’-TAATCCTTTCCCACCACCTTGT-3’。

结果显示，向各癌细胞中转入si-Cofilin、si-Gelsolin或si-CapZ后，细胞中Cofilin、Gelsolin或CapZ在RNA水平表达量明显高于未转入siRNA的对照。

三、western blot检测沉默Cofilin、Gelsolin和CapZ的癌细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9的表达情况

对沉默了Cofilin、Gelsolin或CapZ的癌细胞进行如下几种培养方式：高密度(75000-150000/cm²培养面积)贴壁培养、悬浮培养。培养时间为48h。

对不同处理的细胞进行western blot检测沉默Cofilin、Gelsolin和CapZ的癌细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9的表达情况。western blot具体操作参见实施例2步骤三进行。

结果如图4所示，可见沉默Gelsolin和CapZ均可抑制YAP蛋白的磷酸化，降低S127-YAP蛋白的表达水平，进而促进了YAP蛋白的活性，同时抑制S100A7、S100A8和S100A9蛋白在癌细胞中的表达。

实施例5、体内微环境可诱导S100A7、S100A8和S100A9在荷瘤组织中的表达

本发明的发明人将各癌细胞(NCI-H292细胞、HCC94细胞、A431细胞、FaDu细胞和H226Br细胞)分别接种到裸鼠皮下进行荷瘤。然后免疫组化检测荷瘤组织中S100A7、S100A8和S100A9的表达情况。具体如下：

一、将癌细胞接种裸鼠进行荷瘤

胰酶消化处于对数生长期、状态良好的各癌细胞，培养基重悬后离心收集细胞，用生理盐水(0.9％NaCl溶液)清洗三次后进行细胞计数；最终将细胞配制成为5×10⁷/mL的细胞悬液；向5周龄雌性裸鼠(来自于北京维通利华实验动物技术有限公司)前肢腋下双侧注射各100μL，饲养于SPF级环境中(北京大学医学部第三附属医院动物房)，观察其成瘤情况。

二、免疫组化方法同前步骤。

待小鼠荷瘤直径到达0.5-1cm时处死裸鼠，取下肿瘤在福尔马林中固定待用。按照如下进行免疫组化：

1、石蜡切片的制备

取福尔马林固定好组织块，梯度乙醇脱水后二甲苯透明，浸入溶解的石蜡中，浸蜡三次。随后将组织与熔蜡倒入包埋盒中，待冷却凝固后取下蜡块，放至石蜡切片机上切片，切片厚度5μm，切片放入42℃热水中摊片后用粘附载玻片捞，70℃烘箱内烤干备用。

2、组织免疫组化

取石蜡切片放入70℃烘箱内烤干1-2小时，二甲苯脱蜡后梯度醇水化。随后将片子及柠檬酸抗原修复液放入高压锅中高压加热1min 40s进行抗原修复。然后PBS洗一次后用3％(体积分数)过氧化氢-PBS室温孵育15min灭活内源过氧化物酶，PBS洗一次后用3％(体积分数)牛血清-PBS室温封闭20min，随后孵育一抗过夜或37℃1h，PBS洗3次(每次10min)，孵育HRP标记的二抗，15min室温，PBS洗3次(每次5min)，DAB显色3min后苏木素复染，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片，显微镜下观察染色情况”。

其中，用于检测S100A7蛋白的一抗为兔抗人S100A7(Psoriasin)抗体(Santa CruzBiotechnology公司产品，产品目录号为SC67047)；二抗为快捷型酶标羊抗兔/鼠IgG聚合物(迈新试剂公司产品，产品目录号为KIT-5010)。用于检测S100A8蛋白的一抗为anti-hS100A8(R&B公司产品，产品目录号为MAB4570)；二抗为快捷型酶标羊抗兔/鼠IgG聚合物(迈新试剂公司产品，产品目录号为KIT-5010)。用于检测S100A9蛋白的一抗为羊抗人S100A9(Calgranulin B)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC-8114)；二抗为快捷型酶标兔抗羊IgG聚合物(迈新试剂公司，产品目录号为KIT-5107)。

结果如图5所示，可见与体外培养的细胞(见实施例1)相比，除了NCI-H292的荷瘤组织外，其他癌细胞的荷瘤组织内S100A7、S100A8和S100A9的阳性细胞数明显增多，尤其是H226Br和HCC94细胞的荷瘤组织中尤为显著。由此可见体内的微环境也可诱导S100A7、S100A8和S100A9在体内的表达。