水产品中微囊藻毒素的检测方法

摘要

本发明涉及一种水产品中微囊藻毒素的检测方法，所述检测方法为直接分析离子源-质谱法，包括以下步骤：(1)水产品前处理制备待测样品；(2)将待测样品用直接分析离子源电离；(3)质谱检测已离子化的待测样品。该方法简化了样品前处理，将检测时间从现有技术的数十个小时缩短到几十分钟，提高了检测效率，能够满足实时、快速、原位的检测要求，解决了现有检测技术样品前处理复杂，难以直接检测水产品中微囊藻毒素的问题；且该方法可以对水产品中的多种微囊藻毒素同时进行定性和相对定量分析，满足实际检测需求，可应用于海关、农产品检疫部门、水产养殖基地等。

说明书

技术领域

本发明涉及分析技术领域，特别是涉及一种水产品中微囊藻毒素的检测方法。

背景技术

富营养化导致的蓝藻水华频发，引发各种衍生物污染，严重时造成重大生态灾害事件。其中微囊藻毒素以其毒性大、分布广和结构稳定的特点，成为水环境中常见的潜在危害物质，它主要由微囊藻产生，是一类具有多种异构体的环状七肽物质。微囊藻毒素通过水产品(鱼、虾、蟹、螺、蚌)的直接摄食在生物体内累积，并通过食物链对人类健康产生危害。

为了减少食用有毒水产品对人类健康造成的损害，水产品中微囊藻毒素的检测方法受到关注。近年来，发展了多种基于生物化学的微囊藻毒素的检测方法(如酶联免疫吸附法、蛋白磷酸酶抑制法)或者基于复杂分析仪器的微囊藻毒素检测方法(薄层色谱、毛细电泳、高效液相色谱、高效液相色谱-质谱联用等)。这些方法都需要通过复杂的样品处理过程，把水产品中的微囊藻毒素提取到液相中，再对液体样品进行检测。样品处理步骤一般包括匀质化(切碎、超声等)、冷冻干燥、萃取、离心等，需要花费较长的时间(一般在1天以上)，消耗大量的有毒有机试剂，这致使样品测试的成本较高，对环境及实验操作者的身体健康造成严重威胁，且不利于大量样品的快速检测。

国内外已有一些关于利用酶联免疫吸附法和液相色谱-质谱法检测鲜鱼中微囊藻毒素的方法，这些报道与本发明的样品预处理方式、进样方式、电离方法、检测原理不同，且样品需要经过复杂的预处理。([1]Ellen P.Preece,Barry C.Moore,MarkE.Swanson,F.Joan Hardy.Identifying best methods for routine ELISAdetection of microcystin in seafood.Environ Monit Assess 187(2015):12.[2]GeorgeWilliam Atwoki Nyakairu etc.Assessment of cyanobacteria toxins in freshwater fish:A case study of Murchison Bay(Lake Victoria)and Lake Mburo,Uganda.Toxicon55(2010)939–946.)。另外，国内外也有利用电喷雾解吸电离源质谱分析检测丙酮、药品、爆炸物的文献报道，这些报道与本发明的样品预处理方式、进样方式、离子源设置、检测目的、检测对象不同。(Guangming Xu,Bo Chen,GuozhuLiu,Shouzhuo Yao.Rapid analysis of acetone in human plasma by derivatizatingon desorption electrospray ionization.Analyst 135(2010):2415-2419.)

现有技术中未发现用实时快速的质谱检测技术来检测水产品中的微囊藻毒素，因此发展一种实时、快速的水产品中微囊藻毒素的质谱检测技术极其重要。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种水产中微囊藻毒素的检测方法，能够实现水体中微囊藻毒素的实时、快速检测。

为实现上述发明目的，具体技术方案如下：

一种水产品中微囊藻毒素的检测方法，所述检测方法为直接分析离子源-质谱法，包括以下步骤：(1)水产品前处理制备待测样品；(2)将待测样品用直接分析离子源电离；(3)质谱检测已离子化的待测样品。

在其中一些实施例中，所述直接分析离子源选自电喷雾解吸电离源和介质阻挡放电离子源中的一种。

在其中一些实施例中，所述直接分析离子源为电喷雾解吸电离源；步骤(1)所述水产品前处理的方法为：用活检枪取得水产品的组织样品，速冻，切薄片，制得待测样品；步骤(2)的参数设置如下：电喷溶液管路与样品台的角度为10～90度，电喷溶液管路与样品的距离为1～8mm，质谱仪大气压接口与样品台的角度为20～80度，质谱仪大气压接口与样品的距离为2～10mm。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述速冻的温度为-50～-20℃，速冻的时间为10～50min，薄片的厚度为10～25μm。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述速冻的温度为-40～-30℃，速冻的时间为15～25min，薄片的厚度为15～20μm。

在其中一些实施例中，步骤(2)的参数设置如下：电喷溶液管路与样品台的角度为45～55度，电喷溶液管路与样品的距离为2～4mm，质谱仪大气压接口与样品台的角度为35～45度，质谱仪大气压接口与样品的距离为4～5mm。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述电离的电喷溶液选自二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇、乙酸、水中的两种或多种，电喷溶液的流量为1～50μL/min，电喷溶液被施加的电压为2～10kV。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述电离的电喷溶液为体积比为1：1的二甲基甲酰胺和乙腈的混合溶剂或者体积比为80：19：1的甲醇、水和乙酸的混合溶剂，电喷溶液的流量为5～10μL/min，电喷溶液被施加的电压为4kV或5kV。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述电离的雾化气为氮气、氦气或氙气，雾化气的线速度为100～400m/s。

在其中一些实施例中，步骤(2)所述电离的雾化气为氮气，雾化气的线速度为200～240m/s。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的快速检测水产品中微囊藻毒素的新方法，利用活检枪取得生物组织样品，经过速冻和切片后，平铺于样品台上，在解冻状态下进行检测，通过直接分析电离源和电喷溶液将微囊藻毒素萃取电离后，直接进入质谱仪进行定性和相对定量分析。该方法简化了样品前处理，将检测时间从现有技术的数十个小时缩短到几十分钟，提高了检测效率，能够满足实时、快速、原位的检测要求，解决了现有检测技术样品前处理复杂，难以直接检测水产品中微囊藻毒素的问题；且该方法可以对水产品中的多种微囊藻毒素同时进行检测分析，满足实际检测需求，可应用于海关、农产品检疫部门、水产养殖基地等。

附图说明

图1为直接分析离子源-质谱法检测水产品中微囊藻毒素的流程示意图；

图2为电喷雾解析电离源示意图；

图3为实施例中的电喷雾解析电离源示意图；

图4为含微囊藻毒素MC-RR和MC-LR的鲫鱼样品的质谱图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一、实验仪器与材料

按常规方法制备电喷雾解吸电离源，如图2和图3所示，主要部件包括：三维移动平台、电喷液管路、雾化器、样品台等，电离源的结构和原理参考美国普渡大学的研究成果：R.Graham Cooks,Zheng Ouyang,Zoltan Takats,Justin M.Wiseman.Ambient Mass Spectrometry.Science 311(2006):1566-1570。

鲫鱼样品：样品来源的鱼塘水中微囊藻毒素MC-RR、MC-LR的浓度分别为12μg/L、6μg/L(按照GB/T 20466-2006中高效液相色谱法检测)。

二、实验方法

(1)样品前处理：利用活检枪取得鲫鱼组织样品(10mm x 1mm x 1mm)，在-40℃条件下速冻25min，然后切薄片(厚度15μm)，制得待测样品平铺于样品台上待测。

(2)仪器调试：调整电喷溶液管路与样品台的角度α为45度，电喷溶液管路与样品的距离a为2mm，质谱仪大气压接口与样品台的角度β为35度，质谱仪大气压接口与样品的距离b为4mm，电喷溶液的流量为10μL/min，雾化气线速度为220m/s。

(3)进样和检测：电喷溶液(体积比为1：1的二甲基甲酰胺-乙腈混合溶剂)先被加以5kV的电压，并从雾化器的内套管中喷出，雾化器外套管喷出的高速氮气迅速将溶剂雾化并使其加速，令带电的液滴撞击到样品表面。样品中的目标检测物在被高速液滴撞击后发生萃取电离，并溅射进入气相；同时由于氮气的吹扫和干燥作用，含有样品的带电液滴发生去溶剂化，进入毛细管大气压接口，然后被质谱仪的检测器检测。

三、实验结果

本实验以新鲜鲫鱼作为样品，得到m/z＝519.79(MC-RR,[M+2H]²⁺)和m/z＝498.282(MC-LR,[M+2H]²⁺)的质谱特征峰，MC-RR的特征峰面积约为MC-LR的2倍，如图4所示。

试验结果表明：1、对样品进行简单预处理后，可以直接检测水产品中的微囊藻毒素，与传统的质谱检测方法相比，检测速度由数十个小时缩短到几十分钟；2、根据质荷比，可以判定微囊藻毒素的种类，与传统的生化方法相比有一定优势；3、根据微囊藻毒素的特征峰面积，可以对其进行定量分析；4、检测结果中微囊藻毒素的质荷比数值可以精确到小数点后两位，从而可以根据质荷比将微囊藻毒素特征峰和杂质峰分开。

实施例2

一、实验仪器与材料

同实施例1。

二、实验方法

(1)样品前处理：利用活检枪取得鲫鱼组织样品(15mm x 1mm x 1mm)，在-30℃条件下速冻15min，然后切薄片(厚度20μm)，制得待测样品平铺于样品台上待测。

(2)仪器调试：调整电喷溶液管路与样品台的角度α为55度，电喷溶液管路与样品的距离a为4mm，质谱仪大气压接口与样品台的角度β为45度，质谱仪大气压接口与样品的距离b为5mm，电喷溶液的流量为5μL/min，雾化气线速度为220m/s。

(3)进样和检测：电喷溶液(体积比为80：19：1的甲醇-水-乙酸混合溶剂)先被加以4kV的电压，并从雾化器的内套管中喷出,雾化器外套管喷出的高速氮气迅速将溶剂雾化并使其加速，令带电的液滴撞击到样品表面。样品中的目标检测物在被高速液滴撞击后发生萃取电离，并溅射进入气相；同时由于氮气的吹扫和干燥作用，含有样品的带电液滴发生去溶剂化，进入毛细管大气压接口，然后被质谱仪的检测器检测。

三、实验结果

本实验以新鲜鲫鱼作为样品，得到m/z＝519.79(MC-RR,[M+2H]²⁺)和m/z＝498.282(MC-LR,[M+2H]²⁺)的质谱特征峰，MC-RR的特征峰面积约为MC-LR的2倍。

试验结果表明：1、对样品进行简单预处理后，可以直接检测水产品中的微囊藻毒素，与传统的质谱检测方法相比，检测速度由数十个小时缩短到几十分钟；2、根据质荷比，可以判定微囊藻毒素的种类，与传统的生化方法相比有一定优势；3、根据微囊藻毒素的特征峰面积，可以对其进行定量分析；4、检测结果中微囊藻毒素的质荷比数值可以精确到小数点后两位，从而可以根据质荷比将微囊藻毒素特征峰和杂质峰分开。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。