一种牛精子获能液及精子体外获能方法

摘要

本发明公开了一种牛精子获能液及精子体外获能方法，属于家畜繁殖技术领域。牛精子获能液主要由以下组分组成：NaCl 6.7500mg/mL，KCl 0.3000mg/mL，NaHCO3 2.5000mg/mL，NaH2PO4·2H2O 0.0620mg/mL，CaCl2·2H2O 0.2960mg/mL，MgCl2·6H2O 0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA‑Na 0.0186mg/mL，酚红0.0100mg/mL，BSA 6.0000mg/mL，葡萄糖1.0000mg/mL，咖啡因0.4800mg/mL，肝素0.0500mg/mL，乳酸链球菌素0.025～0.05mg/mL。该获能液能有效保证精子活力、精子质膜完整率、顶体完整率及线粒体活性，保持精子体外获能效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛精子获能液，同时还涉及精子体外获能方法，属于家畜繁殖技术领域。

背景技术

随着人工授精和体外受精技术的发展，公牛的受精能力已成为影响牛繁殖效率的重要因素(Hoflack等，2006)。而精液品质分析是评估公牛生育潜力的常用程序手段(Rijsselaere等，2002)，因此牛精液品质分析尤为重要(Hoflack等，2007)。同时精液品质的优劣也与母牛的受胎率有紧密联系，它是提高牛繁殖效率的关键因素。影响公牛精液品质的因素诸多，如年龄、营养、季节和获能效果等。而保证精子获能的有效前提是在获能液中添加抑菌剂。目前，在体外获能液中添加的抑菌剂基本都是抗生素类物质。如公布号CN103173406A的发明专利公开的一种牦牛精子获能液，由TALP基础液、BSA(6mg/mL)和丙酮酸钠(1.0mM)组成，TALP基础液为：氯化钠100mM、氯化钾3.1mM、氯化钙2.1mM、氯化镁0.4mM、磷酸二氢钠0.29mM、乳酸钠21.6mM、Hepes 10mM、碳酸氢钠25mM、抗生素(75mg/L青霉素+50mg/L链霉素)及余量水。又如公布号CN104059878A的发明专利公开的一种适用于兔精子体外获能的培养液，配方为：NaCl 6.5453mg/mL、KCl 0.2997mg/mL、NaH₂PO₄·H₂O0.1145mg/mL、MgCl₂·6H₂O>2·2H₂O>

发明内容

本发明的目的是提供一种牛精子获能液。

同时，本发明还提供一种牛精子体外获能方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种牛精子获能液，主要由以下组分组成：NaCl 6.7500mg/mL，KCl 0.3000mg/mL，NaHCO₃>2PO₄·2H₂O>2·2H₂O>2·6H₂O0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA-Na>

优选的，牛精子获能液，主要由以下组分组成：NaCl 6.7500mg/mL，KCl 0.3000mg/mL，NaHCO₃>2PO₄·2H₂O>2·2H₂O>2·6H₂O>

所述乳酸链球菌素(Nisin)是一种天然防腐剂，高效、安全，无毒副作用，对食品病原菌和腐败微生物具有较强的抑制作用(幸治梅等，2003)，在食品工业领域有着较为广泛的应用。Nisin是从乳酸链球菌发酵产物中提取的一种多肽抗菌类物质，分子量：3354.07，分子式：C₁₄₃H₂₃₀N₄₂O₃₇S₇。1914年，Mattick和Hirsch首次命名Nisin，并证明该物质能够抑制革兰氏阳性菌。Nisin对人体基本无毒性，能在肠道内降解成氨基酸，并不改变肠道内原生菌落结构及微生态，同时也不与医用抗生素如青霉素、链霉素等产生交叉抗药性。Nisin作为抑菌剂添加到牛精子获能液中，能够替代抗生素发挥抑菌作用，既能保证牛精子体外获能体系的无菌环境，又能维持牛精子获能效率，为体外大量生产廉价胚胎提供保证，且不存在抗生素诸如耐药性、残留性等问题。

一种牛精子体外获能方法，包括以下步骤：将解冻的精液与上述获能液混合，于38～39℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养30～60min，即可。

所述精液在38～40℃水浴条件下解冻10～15s。

所述获能液在与精液混合之前，先于38～39℃、5％CO₂、饱和湿度条件下预热平衡1～2h。

优选的，于39℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养(如采用上游法处理)45min。

本发明的有益效果：

本发明中牛精子获能液能有效保证精子活力、精子质膜完整率、顶体完整率及线粒体活性，保持精子体外获能效果。其中，乳酸链球菌素在获能液中能够发挥抑菌作用，可完全替代抗生素类物质，避免产生耐药性问题。同时，乳酸链球菌素的价格远低于抗生素，仅为抗生素的1/6～1/5，将其用于牛精子获能液生产可大幅降低生产成本，有利于提高畜牧业研发、生产的经济效益。

本发明中牛精子体外获能方法操作简单、快捷，有利于提高牛体外胚胎的生产质量和效率。

附图说明

图1为牛精子质膜完整性检测；

图2为牛精子顶体完整性检测；

图3为JC-1染色检测牛精子线粒体活性；

图4为各处理组精子获能液的菌落密度。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

牛精子获能液，由以下组分组成：NaCl 6.7500mg/mL，KCl 0.3000mg/mL，NaHCO₃2.5000mg/mL，NaH₂PO₄·2H₂O>2·2H₂O>2·6H₂O0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA-Na>

牛精子体外获能方法，包括以下步骤：

1)从液氮罐中取出荷斯坦牛冻精，迅速将其投入38℃水浴中解冻15s；

2)将解冻后的精液缓慢加入预热平衡(于38℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂培养箱中预热平衡1h)后的获能液试管底部，倾斜45°角，放入38℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂培养箱中上游法处理60min，即可。

实施例2

牛精子获能液，由以下组分组成：NaCl 6.7500mg/mL，KCl 0.3000mg/mL，NaHCO₃2.5000mg/mL，NaH₂PO₄·2H₂O>2·2H₂O>2·6H₂O0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA-Na>

牛精子体外获能方法，包括以下步骤：

1)从液氮罐中取出荷斯坦牛冻精，迅速将其投入38℃水浴中解冻10s；

2)将解冻后的精液缓慢加入预热平衡(于39℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂培养箱中预热平衡1.5h)后的获能液试管底部，倾斜45°角，放入38℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂培养箱中上游法处理45min，即可。

实施例3

牛精子获能液，由以下组分组成：NaCl 6.7500mg/mL，KCl 0.3000mg/mL，NaHCO₃2.5000mg/mL，NaH₂PO₄·2H₂O>2·2H₂O>2·6H₂O0.1000mg/mL，丙酮酸钠0.1120mg/mL，EDTA-Na>

牛精子体外获能方法，包括以下步骤：

1)从液氮罐中取出荷斯坦牛冻精，迅速将其投入40℃水浴中解冻10s；

2)将解冻后的精液缓慢加入预热平衡(于38.5℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂培养箱中预热平衡2h)后的获能液试管底部，倾斜45°角，放入38.5℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂培养箱中上游法处理30min，即可。

试验例

以牛冻精为研究对象，通过在获能液中添加不同浓度的Nisin，研究Nisin对精子抑菌与获能效果的影响，在替代抗生素达到抑菌效果的同时保持精子的体外获能效果，建立一种无抗生素的高效牛体外获能培养体系，提高牛胚胎的生产质量和效率。

1、试验材料

选用洛阳市白马寺种公牛站的荷斯坦牛冻精为试验材料。

2、试验分组

牛精子获能液基础液：NaCl 6.7500mg/mL，KCl 0.3000mg/mL，NaHCO₃>2PO₄·2H₂O>2·2H₂O>2·6H₂O>

试验分六组：

I：基础液，即阴性对照组(Negative control)；

II：基础液+100IU/mL青霉素+100IU/mL链霉素，即阳性对照组(Positivecontrol)；

III：基础液+5μg/mL Nisin；

IV：基础液+25μg/mL Nisin；

V：基础液+50μg/mL Nisin；

VI：基础液+100μg/mL Nisin。

将上述六组获能液配制后过滤除菌，CO₂培养箱内平衡约1h。

3、精子体外获能

分别从液氮罐中取12支同一个体的荷斯坦牛冻精，迅速将牛冻精投入38℃水浴解冻10s，将解冻后的精液缓缓加入预热平衡后的获能液试管底部(每个试验组重复一次)，倾斜45°角，放入39℃、5％CO₂、饱和湿度CO₂培养箱中上游法处理45min。

所得培养物分两部分处理，一部分(经六组获能液处理后的精液)用于抑菌效果检测：吸取上游法处理后的各处理组溶液，分别于8000rpm转速下离心5min，再吸取离心管底部约100μL沉淀物，涂于LB培养基上，37℃培养箱中培养36h，统计菌落数。另一部分(六组重复)用于精液品质检测：吸取上游法处理后的上清液于另一个灭菌离心管中，1500rpm转速下离心5min，去除上层悬液，留底部约100μL进行精子获能效果检测。

4、精子获能效果评价

精子活力测定：精子活力是指精液中呈直线前进运动精子占总精子的百分率，采用目测法评估。

质膜完整性检测：采用低渗肿胀法检测精子质膜的完整性，方法参照李晓霞(2013)。滴片后在200×相差显微镜下观察精子尾部形态，如图1所示，精子尾部形成一个圆环的为精子质膜完整的精子(图1中A)，没有形成圆环的则为质膜损伤(不完整)的精子(图1中B)，每次计数至少200条精子。

顶体完整性检测：采用考马斯亮蓝G-250染色法检测精子顶体完整性，方法参照李晓霞(2013)。染色后用自来水冲洗，自然干燥，在1000×油镜下统计顶体膜完整率及破损率。如图2所示，顶体区为蓝色且顶体边缘光滑的精子为具有完整顶体的精子(图2中A)，顶体区不着色或着色较淡的精子为顶体破损(不完整)的精子(图2中B)，至少观察200条精子。

线粒体活性检测：用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(Beyotime)检测牛精子的线粒体膜电位，精子的染色程序按照试剂盒说明进行。具体为：(1)按照每50μL JC-1(200×)加入8mL超纯水混匀后，再加入2mL JC-1染色缓冲液(5×)混匀，即为JC-1染色工作液；以每1mL JC-1染色缓冲液(5×)加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1×)。取100μL精子密度约为10⁷个/mL的精液，加入100μL>7个/mL。(2)取5μL染色后的精子悬液滴在载玻片上，然后盖上盖玻片，于荧光显微镜的蓝光下观察，如图3所示，记录有线粒体活性(高膜电位)的精子数(在精子尾部中段有微黄或桔红色荧光)和无线粒体活性(低膜电位)的精子数(精子尾部中段产生绿色荧光)，至少观察200个精子。

精子获能效果评价结果见下表1。

表1获能效果评价结果

从表1可知，在精子获能基础液中添加不同浓度的Nisin对精子活力有显著影响(P<0.05)。添加25μg/mL、50μg/mL Nisin的精子活力与阳性对照组(青、链霉素组)差异不显著(P>0.05)，而其他处理组的精子活力显著低于阳性对照组(P<0.05)。同样地，添加25μg/mL、50μg/mL Nisin的精子质膜完整率和顶体完整率与阳性对照组均差异不显著(P>0.05)，且添加25μg/mL Nisin的精子线粒体活性显著高于阳性对照(P<0.05)。因此，在牛精子体外获能过程中Nisin的最佳添加浓度为25μg/mL。

5、抑菌效果评价

沉淀物涂布平板后记录菌落数，各处理组菌落密度见图4(图中Negative control为阴性对照组，不含Nisin；Positive control为阳性对照组，含有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素)。

由图4可知，获能液中添加不同浓度的Nisin均能产生明显的抑菌作用(P<0.05)，其中添加25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL Nisin的精子获能液中菌落数差异不显著(P>0.05)，但均显著低于其他三个处理组。说明添加25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL Nisin对精子获能液有明显抑制作用，且添加25μg/mL Nisin的抑菌效果最好。