一种新的定向进化技术SNDS及所获得耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶

摘要

本发明公开了一种新的定向进化技术SNDS及所获得耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶。本发明以两个亲本酶基因的互补单链DNA为出发序列分别进行酶切消化，消化后产物不经回收直接混合进行无引物PCR、构建突变体库并筛选有益突变体。本发明方法实现序列相似性较低的两个亲本基因的突变，有效扩展了DNA改组方法的应用；简化小片段回收步骤；实现100％重组并显著降低传统DNA shuffling所存在的重组偏好性，产生更好的基因多样性及重组类型，能够在很少的重组子中筛选到有益突变。采用本发明方法对序列相似性仅为50.9％的甲基对硫磷水解酶的OPHC2和MPH基因进行突变重排，筛选获得高效耐热的甲基对硫磷水解杂合酶。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的蛋白质定向进化技术，尤其涉及一种定向进化技术SNDS，本发明还涉及应用该技术获得的耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶，属于蛋白质定向进化领域。

背景技术

自从1994年Stemmer在Nature上首次提出DNA shuffling技术，并以β-内酰胺酶系统为试验对象，将其头孢噻肟的最低抑制浓度比原始菌株提高了32,000倍，DNA shuffling一直是蛋白进化技术中的研究热点。它不像计算机辅助下的理性设计(rational design)如基于结构的重组(structure-guided recombinantion)那样局限(受限于选择的设计点)，也不像随机突变那样低效(产生大量无效突变)；它模拟了自然重组的某些方面，并能在一次实验中快速检测目的DNA上更多的区域，从而使得它在蛋白进化上的效果更为显著和高效。最初的DNA shuffling技术简单易得，使得它广泛的被使用，然而这项技术也有着很大的不足：(1)它产生的突变体库中嵌合率很低(<1％)(Stemmer,W.P.Rapid evolutionof a protein in vitro by DNA shuffling.Nature 370,389-391,doi:10.1038/370389a0(1994)；Kikuchi,M.,Ohnishi,K.&Harayama,S.An effective family shufflingmethod using single-stranded DNA.Gene 243,133-137(2000))，而绝大部分为没有发生重组的野生型，这可后面的筛选带来了极大的不便，从而导致效率很低；(2)这个方法对亲本(parental genes)的相似性要求很高(一般至少>80％)(Bacher,J.M.,Reiss,B.D.&Ellington,A.D.Anticipatory evolution and DNA shuffling.Genome Biol 3(2002)；Joern,J.M.,Meinhold,P.&Arnold,F.H.Analysis of shuffled gene libraries.J MolBiol 316,643-656,doi:10.1006/jmbi.2001.5349(2002)；Kikuchi,M.,Ohnishi,K.&Harayama,S.Novel family shuffling methods for the in vitro evolution ofenzymes.Gene 236,159-167,doi:Doi 10.1016/S0378-1119(99)00240-1(1999))，这样限制了它的使用范围；(3)对重组位点存在偏好性以及不能在一个目的序列中发生多次重组。针对这些不足，研究者做出了一些改进，其中主要分为两个方面：(1)在DNA shuffling的基础上进行改进，比如StEP，DNA family shuffling等等。这些改进虽然解决了部分的问题，但是同时也产生了一些其他的限制。以DNA family shuffling为例，虽然提高了嵌合率和对基因相似性的要求也有所降低，但是突变体库中仍然会出现大部分的野生型且只适用于同源性呈梯度分布的一系列基因；(2)抛弃了DNA shuffling传统的流程，只采用它的核心理念-DNA改组，比如ITCHY等等。虽然这些技术有效的解决了上述不足，但是同时也抛弃了DNA shuffling自身的优点，比如简单易得，高效等。这些改进或使得整个流程相当复杂，也降低了通用性，或者使得有益突变率极低，很难筛选到提升的突变子，而且大部分情况是两者都有。这些方法无法既保存了DNA shuffling的优点，同时又克服上述不足，所以导致虽然改进的方法层出不穷，但是最常用最有效的(相比而言)还是原始的DNA shuffling。

在国内外大量生产并大面积用做杀虫剂的有机磷农药可以破坏乙酰胆碱酯酶的活性，从而引发一系列神经中毒症状，甚至死亡。因此，随着人们生活质量的提高和环保意识的加强，有机磷农药对于环境的污染和生态平衡的破坏越来越受到人们的关注，如何有效的去除有机磷农药残留、降低其毒性成为世界各国研究人员普遍关注并努力攻克的热点问题。

有机磷降解酶(Organophosphorus hydrolase，EC3.1.8.1)，它是一种可以水解磷酯键的酶，一方面，它可以断裂有机磷农药的磷酯键使其脱毒；另一方面，由于不同种类有机磷农药的区别大都是取代基不同，所以一种有机磷降解酶往往可水解多种有机磷农药。其中，甲基对硫磷水解酶(Methyl parathion hydrolase，MPH)，它的最适底物是甲基对硫磷，酶分子结构解析和进化树分析结果表明，它属于β内酰胺酶家族(PFAM accessionno.PF00753)。

甲基对硫磷水解酶大都是在中国发现和分离得到的，主要分为两大类，一类是来源于Pseudomonas sp.WBC-3、Plesiomonas sp.M6、Ochrobactrum sp.M231等菌株的甲基对硫磷水解酶(MPH)，其氨基酸序列相似性很高，最低为98.2％。它们在酶学性质上表现出的共同特点是催化甲基对硫磷的效率高，碱性条件利于催化，热稳定性较差。另外一类，是从Pseudomonas pseudoalcaligenes分离出的OPHC2，与MPH的氨基酸序列最高相似性仅有50.9％，该类酶具有良好的热稳定性，但是催化甲基对硫磷的能力也相对较差。

近年来本发明人实验室一直致力于有机磷降解酶方面的研究工作，从农药污染的土壤中分离得到一些高效降解有机磷农药的细菌，并且分离得到两个编码甲基对硫磷水解酶的基因：来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的OPHC2(GenBank登录号：Accession No.CAE53631)和来源于苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)的MPH-Och(GenBank登录号：Accession No.ACC63894)。其中MPH-Och与已报道的来源于Pseudomonassp.WBC-3的MPH相似性很高，达到98.2％，酶学性质也基本相同。比较MPH-Och与OPHC2发现，这两个酶蛋白氨基酸序列相似性为47.7％，酶蛋白的性质具有较大差异。OPHC2具有良好的耐热性，其降解甲基对硫磷的最适温度为65℃，在70℃保温30分钟后仍有近40％的活性。而MPH-Och酶反应的最适反应温度仅为20℃，在70℃保温不到2分钟，相对酶活性迅速降低至10％以下，保温5分钟后就基本丧失酶活力，其热稳定性要比OPHC2差很多。但是，MPH-Och在常温下对甲基对硫磷的催化效率明显优于OPHC2，它的比活性是23.23U/mg，约是OPHC2的5.8倍。因此，综合这两类酶的优点，开发出新型高效耐热的甲基对硫磷水解酶，对进一步降低该类酶的生产成本，推动其产业化具有重大意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种新的蛋白质定向进化方法，即：单链核苷酸DNA直接重组技术(SNDS，Single-stranded Nucleotide DNA directlyShuffling)；

本发明所要解决的第二个技术问题是应用所述SNDS技术对甲基对硫磷水解酶OPHC2和MPH进行突变重排，以获得高效耐热的甲基对硫磷水解杂合酶。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种蛋白质的定向进化方法(SNDS)，包括以下步骤：

(1)以编码该蛋白质的两条互补单链亲本DNA序列为出发序列，分别用DNase I进行酶切消化；

(2)将步骤(1)酶切消化后的产物不经过回收直接混合进行无引物PCR；

(3)以无引物PCR的产物为模板进行有引物PCR，回收PCR产物；

(4)将步骤(3)回收的PCR产物插入表达载体，转化宿主菌，构建突变体库；

(5)从突变体库中筛选有益突变体，即得。

其中，所述两条单链亲本DNA序列的相似性≥50.9％；优选的，所述蛋白质为甲基对硫磷水解酶。

本发明所述两条单链亲本DNA序列可以采用不对称PCR扩增法或人工合成法等多种方法来获得。比如，通过不对称PCR直接从含有所述亲本酶基因的质粒中扩增出有关单链DNA。所述无引物PCR是在不加入引物的情况下利用PCR对DNase I消化后的随机化片段进行重新排布；所述有引物PCR是利用基因两侧的引物进行PCR扩增得到全长基因的重排产物，所选用的引物依据需要获得的杂合酶类型进行选择。

本发明将两个亲本酶基因的单链DNA分别用DNase I进行消化，然后将DNase I消化后的产物不经过回收直接进行混合重组，从而在混合重组中让部分消化的大片段能够充当类似RACHITT中“scaffold”的功能(Coco,W.M.et al.DNA shuffling method forgenerating highly recombined genes and evolved enzymes.Nature biotechnology19,354-359,doi:Doi 10.1038/86744(2001))，从而达到了实现序列相似性仅为50.9％的两个亲本基因的突变，而且SNDS改组后的新基因的杂合率为100％。

之前，本领域技术人员普遍认为，DNA shuffling技术中将DNase I消化后的产物进行回收有助于减少突变体库中野生型的掺入并提升重组效果。从本发明实验结果来看，将DNase I消化后的产物直接进行混合重组更加有效。无论是对高相似性的亲本还是低相似性的亲本，应用本发明SNDS改组后的新基因的杂合率皆为100％，而传统的DNAshuffling至少需要亲本基因的相似性在80％以上，且产生的新基因的杂合率普遍为1％左右。本发明SNDS技术扩展了DNA改组方法的应用，使其更加通用，并产生了更加有效的突变类型。

本发明SNDS技术显著降低了在传统DNA shuffling中存在的重组偏好性，从而产生了更好的基因多样性。而且，本发明方法产生了更好的重组类型：对高相似性亲本，将产生多交换的重组类型，从而产生更理想的突变类型；而对低相似性亲本，将主要产生单交换的重组类型，从而避免突变体库中活性率太低。综上，本发明SNDS技术更加有效，可以在很少的重组子中筛选得到有益突变。

本发明进一步公开了一种定向进化获取耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶的方法，包括以下步骤：

(1)以甲基对硫磷水解酶OPHC2基因和甲基对硫磷水解酶MPHM基因的互补单链DNA为出发序列，分别用DNase I进行酶切消化；

(2)将步骤(1)酶切消化后的产物不经过回收直接混合后进行无引物PCR；

(3)以无引物PCR的产物为模板进行有引物PCR，回收PCR产物；

(4)将步骤(3)回收的PCR产物插入表达载体，转化宿主菌，构建突变体库；

(5)从突变体库中筛选有益突变酶，即得。

其中，所述甲基对硫磷水解酶OPHC2的GenBank登录号为：CAE53631；所述甲基对硫磷水解酶MPHM的GenBank登录号为：ACC63894。所述甲基对硫磷水解酶OPHC2基因的核苷酸序列的GenBank：AJ605330；所述甲基对硫磷水解酶MPHM基因的核苷酸序列的GenBank：KX982227。

步骤(1)所述用DNase I进行酶切消化的体系包括：酶切消化的总体系为50μL，其中，10-15ng/μL单链DNA 42.5μL，10×Dnase I buffer 5μL，40U/mL Dnase I 2.5μL；所述酶切消化的条件包括：25℃酶切30min，75℃处理10min灭活Dnase I。

步骤(2)所述无引物PCR的体系包括：总体系为50μL，其中，酶切消化后的产物各5μL，5×fastpfu buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL，Fast pfu 1.5μL，余量为dd H₂O；无引物PCR的程序包括：94℃5min；94℃30s，45℃30s，72℃1min30s，45个循环。

步骤(3)所述有引物PCR的引物包括：由SEQ ID No.7和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的引物对1，或者，由SEQ ID No.5和SEQ ID No.8所示的核苷酸序列组成的引物对2；所述有引物PCR的程序包括：94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min10s，20个循环。

步骤(4)所述表达载体包括pET30载体；所述宿主菌包括大肠杆菌。

本发明应用SNDS技术对序列相似性仅为50.9％的甲基对硫磷水解酶OPHC2和MPH两个基因进行改组，从所构建的大肠杆菌突变体库中随机挑选50个阳性菌株进行序列测定，结果基因全部发生杂合突变，突变率为100％。通过对500个克隆进行甲基对硫磷水解酶活性测定，筛选出有33％的菌株有酶活性，从中进一步筛选获得热稳定性及酶活性较MPH有所提升的突变酶。

而利用传统DNA shuffling对甲基对硫磷水解酶OPHC2和MPH两个基因进行改组，通过分析测序结果发现，应用传统DNA shuffling进行突变体构建时不能形成正确的目的条带，而且大片段缺失。

本发明进一步公开了所述方法获得的耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶及其编码基因。

本发明方法获得的耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶B-C1，其氨基酸序列为SEQ IDNo.2所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明方法获得的耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶B-A5，其氨基酸序列为SEQ IDNo.4所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

本发明进一步公开了含有所述基因的重组表达载体以及含有所述重组表达载体的重组宿主细胞。将本发明所述耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶的编码基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明所述重组宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，包括但不限于大肠杆菌细胞。

本发明还公开了一种制备所述耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶的方法，包括以下步骤：(1)用含有所述耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶的编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶的表达；(3)回收并纯化所表达的耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶，即得。

本发明在有引物PCR过程中，选用了两对引物分别进行扩增，一对是为了筛选获得mph在杂合基因前半段，ophc2基因在后半段的引物(由SEQ ID No.7和SEQ ID No.6所示)，另一对是为了筛选获得ophc2在杂合基因前半段，mph基因在后半段的引物(SEQ ID No.5和SEQ ID No.8所示)。序列分析结果表明，B-C1突变基因的5’端含mph基因5’端的789个核苷酸，此后为ophc2的核酸序列，即B-C1突变酶的N端为MPH蛋白N端的263个氨基酸，C端为OPHC2蛋白的C端的33个氨基酸。B-A5突变基因的5’端含ophc2基因5’端的66个核苷酸，此后为mph的核酸序列，即B-A5突变酶的N端含OPHC2N端的22个氨基酸，C端为MPH蛋白的C端的274个氨基酸。

酶学性质分析表明，B-C1和B-A5杂合酶相对酶活性较亲本的MPH和OPHC2均有升高，特别是B-A5，其相对酶活性为248.77U/mg，是MPH的10.68倍。热稳定性测定结果表明，在70℃保温10分钟后，37℃测定酶活性，MPH酶活性完全丧失；以亲本OPHC2为对照，杂合酶B-C1酶活性剩余酶活性可以到达70％，杂合酶B-A5剩余酶活性仍为OPHC2的2.95倍。应用圆二色光谱测定蛋白T_m值，杂合酶B-A5为58℃，比MPH(56℃)提高了2℃。

本发明所述的耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶或者其编码基因在水解有机磷农药，尤其是甲基对硫磷中具有广泛的应用前景。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明SNDS技术的实验步骤与传统DNA shuffling相比更简单：传统DNAshuffling技术在DNA消化后均需回收片段，本发明方法简略此步骤。

(2)本发明SNDS技术实现序列相似性仅为50.9％的OPHC2和MPH两个基因的突变，而传统DNA shuffling至少需要相似性80％以上。本发明SNDS技术扩展了DNA改组方法的应用，使其更加通用。

(3)无论是对高相似性的亲本还是低相似性的亲本，本发明SNDS改组后的新基因的杂合率皆为100％，而传统DNA shuffling普遍为1％左右。

(4)本发明应用SNDS技术所获得的耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶的相对酶活性较亲本升高、热稳定性提高，更适于产业化应用。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。

术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。

附图说明

图1为单链mph与ophc2DNA的电泳图谱；其中，A为PCR扩增获得单链；B为回收获得的单链DNA；

图2为杂合基因的电泳图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、实验材料

1.1菌株及质粒

质粒pET30a(+)-ophc2，pET30a(+)-mph、菌株E.coli BL21、E.coli Top10由本发明人实验室保存，载体pGM-T购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2试剂

质粒提取、胶回收试剂盒购自Axygen公司，Taq polymeras购自天根生化科技(北京)有限公司，T₄-连接酶、限制性内切酶购自NEB公司，重组酶、Fast>

1.3试验仪器

恒温摇床(太仓市科技器材厂)、PCR仪(美国Bio-Rad公司)、恒温箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、凝胶成像分析系统(上海培清科技有限公司)、连接仪(卡尤迪生物科技有限公司)、恒温金属浴(金银杏生物技术有限公司)、漩涡振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、真空冷冻干燥器(德国Christ公司)、高压蒸汽灭菌锅(日本SANYO公司)、台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、立式高速冷冻离心机(美国Sigma公司)、电热恒温水浴锅(上海一恒仪器有限公司)、电击转化仪(美国Bio-Rad公司)、酶标仪(芬兰Thermo公司)、蛋白质电泳仪(北京六一仪器厂)、莱驰MM400研磨仪(德国Retsch公司)。

实施例1应用定向进化技术SNDS获得耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶

1、实验方法

1.1mph与ophc2单链的获取

以实验室保存的质粒pET30a(+)-ophc2质粒为模板，以ophc2-up-BamHI(ggatccGCCGCACCGGCACAACAGAAG)和ophc2-down-XhoI(ctcgagTCAGC GGTCGCTACGGATCGG)引物进行不对称PCR扩增获得单链ophc2；同时，以pET30a(+)-mph质粒为模板，mph-up-BamHI(ggatccGCTGCTCCACAAGTTAGAACTTC)和mph-down-XhoI(ctcgagTTACTTTGGGTTAACGACGG)为引物，进行不对称PCR扩增获得单链mph。

PCR体系如下：

单链PCR程序如下：

扩增条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min10s，31个循环。扩增产物经回收试剂盒回收。

1.2单链消化步骤

回收的mph和ophc2单链DNA分别用Dnase I进行酶切消化，25℃酶切30min，75℃处理10min灭活Dnase I。

消化体系如下：

1.3mph和ophc2杂合基因的获得

酶切后将mph和ophc2小片段混合，进行无引物PCR，体系如下：

程序：

扩增条件：94℃5min；94℃30s，45℃30s，72℃1min30s，45个循环。

1.4有引物PCR

以无引物PCR产物为模板，进行有引物PCR，选用的引物依据需要获得的杂合酶类型进行选择。

本发明中选用了两对引物分别进行扩增，一对是为了筛选获得mph在杂合基因前半段，ophc2基因在后半段的引物(mph-up-BamHI：ggatccGCTGCTCCACAAGTTAGAACTTC和ophc2-down-XhoI：ctcgagTCAGC GGTCGCTACGGATCGG)；另一对是为了筛选获得ophc2在杂合基因前半段，mph基因在后半段的引物(ophc2-up-BamHI：ggatccGCCGCACCGGCACAACAGAAG和mph-down-XhoI：ctcgagTTACTTTGGGTTAACGACGG)。

程序：扩增条件：94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min10s，20个循环。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，回收备用。

1.5大肠杆菌突变体库的构建

将回收的PCR产物和pET30载体分别进行BamHI/XhoI双酶切，回收酶切后的片段，加入T₄连接酶进行连接，连接体系如下：突变基因6μL，pET30>4DNA>4DNA>

连接产物热击转化入大肠杆菌表达菌株BL21。转化后平板中长出的单克隆菌株，经37℃、200rpm震荡液体培养10-12h，转化所得菌株经过质粒提取，酶切鉴定，确定阳性菌株，随机挑选阳性菌株进行序列测定，分析突变率。

1.6甲基对硫磷活性测定筛选有益突变酶

1.6.1初步筛选

向灭菌的96深孔板加入kana抗性的300μL LB培养基，将平板上的菌接入孔中，300rpm/min，10h，37℃，后加入100μL 4mM的IPTG的LB培养基，750rpm/min，4h，37℃，每孔取出50μL进行甲基对硫磷水解酶酶活性测定，初步筛选出有酶活性的菌株。

甲基对硫磷水解酶酶活性测定方法：取100μL酶液加入含有5μL 10mg/mL甲基对硫磷和900μL 50mmol/L Tris-Cl(pH8.0)缓冲液的体系中，37℃保温10min，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，再加入1mL 10％Na₂CO₃溶液显色，410nm测定光吸收值，计算水解产物对硝基酚的含量和酶的活性。一个酶活性单位(U)定义为：在37℃，每分钟释放出1μmol对硝基酚所需的酶量。从克隆中筛选有酶活性的菌株。

1.6.2复筛热稳定性及酶活性升高的突变酶

为了筛选耐热高效的突变酶，将初筛中有活性的菌株再次接入96孔深孔板，300rpm/min过夜培养10h，后加入100μL 4mM的IPTG的LB培养基，750rpm/min，培养4h，每孔取出50μL置于70℃处理5min，10min和15min，再于37℃测定甲基对硫磷水解酶活性。筛选热稳定性及酶活性较MPH有所提升的突变酶。

1.7突变酶纯化

将含有突变酶菌株转接至含有50μg/mL卡纳霉素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养，将该培养液以1％接种量转接至50mL含50μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，37℃，200r/min培养至OD₆₀₀＝0.6后，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，16℃，200r/min振荡诱导20h。诱导后的菌液在4℃，8000r/min离心10min后，弃上清收集菌体。菌体用20mmol/LTris-HCl(pH8.0)重悬，冰上超声破碎。破碎后的粗酶液经4℃，12000r/min离心20min后小心地取出上清，采用亲和层析进行纯化。

1.8酶学性质测定

纯化后的酶蛋白进行酶学性质分析，包括酶活性测定(方法同1.6.1)、热稳定性测定(在70℃保温10分钟后，37℃测定酶活性)。同时，应用圆二色光谱测定蛋白T_m值(蛋白质变性到一半的温度)。

1.9突变酶的序列测定及分析

将带有突变基因的质粒提取出来，进行序列分析。

2、实验结果

2.1mph与ophc2单链的获取

经不对称PCR扩增获得单链ophc2、单链mph，扩增产物经回收试剂盒回收，扩增结果及回收结果见图1。

2.2杂合基因的获得

以无引物PCR产物为模板，进行有引物PCR。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，可以看到大小约为900bp的目的条带(图2)，回收备用。

2.3大肠杆菌突变体库的构建

将回收的PCR产物和pET30载体进行连接，转化大肠杆菌表达菌株BL21，转化后平板中长出的单克隆菌株约500个转化子，经酶切鉴定确定阳性菌株。随机挑选50个阳性菌株进行序列测定，通过分析测序，结果基因全部发生杂合突变，突变率为100％。

2.4有益突变酶的初步筛选

通过甲基对硫磷水解酶酶活性测定，对500个克隆筛选后有33％的菌株有酶活性。

2.5热稳定性及酶活性升高的突变酶的复筛

本发明从初筛有活性的菌株中筛选获得热稳定性及酶活性较MPH有所提升的突变酶B-C1和B-A5。

2.6突变酶的酶学性质测定

本发明将突变酶B-C1和B-A5进行纯化，纯化后的酶蛋白进行酶学性质分析(表1)。

筛选出的B-C1和B-A5杂合酶相对酶活性较亲本的MPH和OPHC2均有升高，特别是B-A5，其相对酶活性为248.77U/mg，是MPH的10.68倍。

热稳定性测定结果发现，在70℃保温10分钟后，37℃测定酶活性，MPH酶活性完全丧失，以另一个亲本OPHC2为对照，杂合酶B-C1酶活性剩余酶活性可以到达70％，杂合酶B-A5剩余酶活性仍为OPHC2的2.95倍。同时，应用圆二色光谱测定蛋白T_m值(蛋白质变性到一半的温度)，B-A5为58℃，比MPH(56℃)提高了2℃。

表1杂合酶酶学性质分析

2.7突变酶的序列测定及分析

序列分析结果发现，B-C1突变基因的5’端含mph基因5’端的789个核苷酸，此后为ophc2的核酸序列，即B-C1突变酶的N端为MPH蛋白N端的263个氨基酸，C端为OPHC2蛋白的C端的33个氨基酸。B-C1突变体基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列为SEQID No.2所示。

B-A5突变基因的5’端含ophc2基因5’端的66个核苷酸，此后为mph的核酸序列，即B-A5突变酶的N端含OPHC2N端的22个氨基酸，C端为MPH蛋白的C端的274个氨基酸。该突变体基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示，其氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。

对比实施例1(传统DNA Shuffling实验)

以实验室保存的质粒pET30a(+)-ophc2质粒为模板，以ophc2-up-BamHI(ggatccGCCGCACCGGCACAACAGAAG)和ophc2-down-XhoI(ctcgagTCAGC GGTCGCTACGGATCGG)引物扩增获得全长的双链ophc2基因；同时，以pET30a(+)-mph质粒为模板，mph-up-BamHI(ggatccGCTGCTCCACAAGTTAGAACTTC)和mph-down-XhoI(ctcgagTTACTTTGGGTTAACGACGG)为引物，扩增获得全长的双链mph基因。

扩增产物经回收试剂盒回收，最终回收产物的浓度应达到30ng/μl。回收的产物用Dnase I进行酶切消化，50μl体系：2U/mL DNaseI；约800ng回收DNA(ophc2和mph各400ng)；25℃酶切30min，75℃处理10min灭活Dnase I。酶切后的50-100bp的小片段DNA以低熔点胶法进行回收。回收片段进行无引物PCR，50μl PCR反应体系如下：

PCR程序：94℃5min；94℃30sec；45℃30sec；72℃1.5min；45个循环，72℃10min。

再以无引物PCR产物为模板，选用了两对引物分别进行扩增，一对是为了筛选获得mph在杂合基因前半段，ophc2基因在后半段的引物(mph-up-BamHI：ggatccGCTGCTCCACAAGTTAGAACTTC和ophc2-down-XhoI：ctcgagTCAGC GGTCGCTACGGATCGG)，另一对是为了筛选获得ophc2在杂合基因前半段，mph基因在后半段的引物(ophc2-up-BamHI：ggatccGCCGCACCGGCACAACAGAAG和mph-down-XhoI：ctcgagTTACTTTGGGTTAACGACGG)。

程序如下：94℃5min，1个循环，94℃30sec，50℃30sec，72℃1min，30个循环，72℃10min。将900bp左右的PCR产物以回收试剂盒回收。

将回收的PCR产物和pET30载体分别进行BamHI/XhoI双酶切，回收酶切后的片段，加入T₄连接酶进行连接，连接体系如下：突变基因6μL，pET302μL，10×T₄DNA>4DNA>

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>一种新的定向进化技术SNDS及所获得耐热高效甲基对硫磷水解杂合酶

<130>BJ-2002-160849A

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>891

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>1

gctgctccac aagttagaac ttctgctcca ggatactaca gaatgttgct gggtgacttc60

gaaattactg ctttgtctga cggtaccgtt gctttgccag ttgacaagag attgaaccaa 120

ccagctccta agactcagtc tgctttggcc aagtacttcc agaaagctcc attggaaacc 180

tccgttaccg gttacttggt caacactggt tccaagttgg ttttggtcga cactggtgct 240

gccggtttgt tcggaccaac cttgggtaga cttgctgcca acttgaaggc cgctggttac 300

caaccagagc aagttgacga gatttacatc actcacatgc atcctgacca cgttggaggt 360

ttgatggttg gtgagcaatt ggctttccca aacgctgtcg ttagagctga ccaaaaggag 420

gccgatttct ggctttctca aaccaacttg gacaaggctc ctgacgattc taaaggtttc 480

ttcaagggtg ccatggcttc ccttaaccca tacgttaagg ccggtaagtt caagcctttc 540

tcgggtaaca ctgacttggt tcctggtatt aaagctttgg cctcccacgg acacaccgct 600

ggtcacacta cctacgttgt tgaatctcaa ggtcaaaagc ttgccttgtt gggtgacttg 660

atcttggtcg ctgctgttca attcgacgat ccatccgtta ctaaccaatt ggactctgac 720

tccaagtctg ctgccgttga gagaaagaaa gctttcgctg atgccgctaa gggaggttac 780

cttatcgctg gtgcgcacct gcccttcccc ggcctgggcc acgtacgcaa ggaagcccaa 840

ggctacgcct gggtacccgt cgagttcagc ccgatccgta gcgaccgctg a891

<210>2

<211>296

<212>PRT

<213>artifical sequence

<400>2

Ala Ala Pro Gln Val Arg Thr Ser Ala Pro Gly Tyr Tyr Arg Met Leu

1 5 1015

Leu Gly Asp Phe Glu Ile Thr Ala Leu Ser Asp Gly Thr Val Ala Leu

202530

Pro Val Asp Lys Arg Leu Asn Gln Pro Ala Pro Lys Thr Gln Ser Ala

354045

Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Lys Ala Pro Leu Glu Thr Ser Val Thr Gly

505560

Tyr Leu Val Asn Thr Gly Ser Lys Leu Val Leu Val Asp Thr Gly Ala

65707580

Ala Gly Leu Phe Gly Pro Thr Leu Gly Arg Leu Ala Ala Asn Leu Lys

859095

Ala Ala Gly Tyr Gln Pro Glu Gln Val Asp Glu Ile Tyr Ile Thr His

100 105 110

Met His Pro Asp His Val Gly Gly Leu Met Val Gly Glu Gln Leu Ala

115 120 125

Phe Pro Asn Ala Val Val Arg Ala Asp Gln Lys Glu Ala Asp Phe Trp

130 135 140

Leu Ser Gln Thr Asn Leu Asp Lys Ala Pro Asp Asp Ser Lys Gly Phe

145 150 155 160

Phe Lys Gly Ala Met Ala Ser Leu Asn Pro Tyr Val Lys Ala Gly Lys

165 170 175

Phe Lys Pro Phe Ser Gly Asn Thr Asp Leu Val Pro Gly Ile Lys Ala

180 185 190

Leu Ala Ser His Gly His Thr Ala Gly His Thr Thr Tyr Val Val Glu

195 200 205

Ser Gln Gly Gln Lys Leu Ala Leu Leu Gly Asp Leu Ile Leu Val Ala

210 215 220

Ala Val Gln Phe Asp Asp Pro Ser Val Thr Asn Gln Leu Asp Ser Asp

225 230 235 240

Ser Lys Ser Ala Ala Val Glu Arg Lys Lys Ala Phe Ala Asp Ala Ala

245 250 255

Lys Gly Gly Tyr Leu Ile Ala Gly Ala His Leu Pro Phe Pro Gly Leu

260 265 270

Gly His Val Arg Lys Glu Ala Gln Gly Tyr Ala Trp Val Pro Val Glu

275 280 285

Phe Ser Pro Ile Arg Ser Asp Arg

290 295

<210>3

<211>891

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>3

gccgcaccgg cacaacagaa gacccaggta ccgggctact accgtatggc actcggtgac60

ttcgaaatta ctgctttgtc tgacggtacc gttgctttgc cagttgacaa gagattgaac 120

caaccagctc ctaagactca gtctgctttg gccaagtact tccagaaagc tccattggaa 180

acctccgtta ccggttactt ggtcaacact ggttccaagt tggttttggt cgacactggt 240

gctgccggtt tgttcggacc aaccttgggt agacttgctg ccaacttgaa ggccgctggt 300

taccaaccag agcaagttga cgagatttac atcactcaca tgcatcctga ccacgttgga 360

ggtttgatgg ttggtgagca attggctttc ccaaacgctg tcgttagagc tgaccaaaag 420

gaggccgatt tctggctttc tcaaaccaac ttggacaagg ctcctgacga ttctaaaggt 480

ttcttcaagg gtgccatggc ttcccttaac ccatacgtta aggccggtaa gttcaagcct 540

ttctcgggta acactgactt ggttcctggt attaaagctt tggcctccca cggacacacc 600

gctggtcaca ctacctacgt tgttgaatct caaggtcaaa agcttgcctt gttgggtgac 660

ttgatcttgg tcgctgctgt tcaattcgac gatccatccg ttactagcca attggactct 720

gactccaagt ctgctgccgt tgagagaaag aaagctttcg ctgatgccgc taagggaggt 780

taccttatcg ctgctgccca cttgtccttc ccaggtattg gtcacatcag agctgaaggt 840

aagggatacc gtttcgttcc tgtcaactac tccgtcgtta acccaaagta a891

<210>4

<211>296

<212>PRT

<213>artifical sequence

<400>4

Ala Ala Pro Ala Gln Gln Lys Thr Gln Val Pro Gly Tyr Tyr Arg Met

1 5 1015

Ala Leu Gly Asp Phe Glu Ile Thr Ala Leu Ser Asp Gly Thr Val Ala

202530

Leu Pro Val Asp Lys Arg Leu Asn Gln Pro Ala Pro Lys Thr Gln Ser

354045

Ala Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Lys Ala Pro Leu Glu Thr Ser Val Thr

505560

Gly Tyr Leu Val Asn Thr Gly Ser Lys Leu Val Leu Val Asp Thr Gly

65707580

Ala Ala Gly Leu Phe Gly Pro Thr Leu Gly Arg Leu Ala Ala Asn Leu

859095

Lys Ala Ala Gly Tyr Gln Pro Glu Gln Val Asp Glu Ile Tyr Ile Thr

100 105 110

His Met His Pro Asp His Val Gly Gly Leu Met Val Gly Glu Gln Leu

115 120 125

Ala Phe Pro Asn Ala Val Val Arg Ala Asp Gln Lys Glu Ala Asp Phe

130 135 140

Trp Leu Ser Gln Thr Asn Leu Asp Lys Ala Pro Asp Asp Ser Lys Gly

145 150 155 160

Phe Phe Lys Gly Ala Met Ala Ser Leu Asn Pro Tyr Val Lys Ala Gly

165 170 175

Lys Phe Lys Pro Phe Ser Gly Asn Thr Asp Leu Val Pro Gly Ile Lys

180 185 190

Ala Leu Ala Ser His Gly His Thr Ala Gly His Thr Thr Tyr Val Val

195 200 205

Glu Ser Gln Gly Gln Lys Leu Ala Leu Leu Gly Asp Leu Ile Leu Val

210 215 220

Ala Ala Val Gln Phe Asp Asp Pro Ser Val Thr Ser Gln Leu Asp Ser

225 230 235 240

Asp Ser Lys Ser Ala Ala Val Glu Arg Lys Lys Ala Phe Ala Asp Ala

245 250 255

Ala Lys Gly Gly Tyr Leu Ile Ala Ala Ala His Leu Ser Phe Pro Gly

260 265 270

Ile Gly His Ile Arg Ala Glu Gly Lys Gly Tyr Arg Phe Val Pro Val

275 280 285

Asn Tyr Ser Val Val Asn Pro Lys

290 295

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>5

ggatccgccg caccggcaca acagaag27

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>6

ctcgagtcag cggtcgctac ggatcgg27

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>7

ggatccgctg ctccacaagt tagaacttc29

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>artifical sequence

<400>8

ctcgagttac tttgggttaa cgacgg 26