甲基对硫磷降解菌的筛选及其甲基对硫磷水解酶基因的克隆

摘要

有机磷农药作为一类高效广谱的杀虫剂自从上世纪40年代发明以来，已在全世界范围内大面积使用。在半个多世纪里，这类杀虫剂增加了农作物的产量，为人类社会的发展做出了重要的贡献。但是随着有机磷农药的长期和大范围使用，越来越多的环境问题，人类健康问题，人类可持续发展问题开始凸显出来。有机磷降解酶可以破坏有机磷农药分子的磷脂键，最终使其脱毒。因此，通过基因工程技术生产高效、廉价具有广谱特性的有机磷降解酶制剂是目前消除有机磷农药污染的最有潜力的方法。 本研究从农药厂被农药长期高度污染的土壤中通过富集培养分离得到一株能够降解甲基对硫磷农药的细菌M231，经过16SrDNA方法鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum)，此菌能组成型分泌甲基对硫磷水解酶MPHXW。 通过保守区设计简并引物，PCR扩增得到该甲基对硫磷水解酶基因的部分片段。通过将已知序列在网上进行比对，进而设计特异引物克隆得到甲基对硫磷水解酶基因mphxw全长。编码基因全长993bp，(G+C)含量为67.27％，具有一个开放读码框，编码330个氨基酸，其中前35个氨基酸残基为信号肽序列，蛋白质理论分子量为35kD。编码基因的核苷酸序列分析表明，虽然该基因与目前发表的来源于苍白杆菌Ochrobactrum的甲基对硫磷水解酶蛋白相似性达到98％，但比它们少一个氨基酸。同时该基因与本实验室先前报道的OPHC2相似性非常低，只有43.7％。mphxw已经在GenBank中登录，登录号是EU596456。 将不带有信号肽的编码序列分别构建了原核表达重组载体pET-mphxw和真核表达重组载体pPIC9γ-mphxw，原核表达产物具有正常生物学功能。同时也筛选到了一批能够分泌表达甲基对硫磷水解酶真核重组子。 从原菌Ochrobactrumsp.M231和原核表达重组子中纯化了该基因的原菌蛋白和原核重组蛋白，对纯化的原菌蛋白进行了质谱分析表明，分离纯化的原菌蛋白和从该菌中克隆得到基因表达蛋白的序列是一致的。对原菌蛋白和原核重组蛋白的酶学性质进行了测定，发现在最适反应温度和最适合反应pH上，两个蛋白都基本相似，分别在20℃和pH9-10附近。通过热稳定性和pH稳定性的研究比较发现，原核重组蛋白比原菌蛋白具有更好的热稳定性和pH稳定性，原菌蛋白的比活高，为148U/mg，比原核重组蛋白高了30倍以上。 下一步希望通过对MPHXW和OPHC2这两个相似性很低，酶学性质差别大的甲基对硫磷水解酶基因在分子结构上进行比较研究，希望能够在解释甲基对硫磷水解酶热稳定性以及催化机理上有新的突破。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章有机磷降解酶及其基因的研究进展

1.1有机磷农药简介

1.2.1有机磷降解酶简介

1.2.2有机磷降解酶空间结构的研究

1.2.3有机磷降解酶催化机制的研究

1.3有机磷降解酶基因的起源

1.4目前发表的有机磷降解酶基因以及它们的区别和联系

1.5问题与展望

1.6研究意义和目的

第二章 甲基对硫磷降解菌的筛选以及甲基对硫磷水解酶基因的克隆与异源表达

2.1实验材料

2.1.1实验材料

2.1.2实验仪器、工具酶和试剂

2.1.3培养基及培养条件和相关溶液的配制

2.2实验方法

2.2.1菌株的分离和筛选

2.2.2甲基对硫磷水解酶的酶活力测量方法

2.2.3细菌基因组的提取

2.2.4甲基对硫磷降解菌的鉴定

2.2.5甲基对硫磷水解酶基因中间片段的克隆

2.2.6甲基对硫磷水解酶基因全长的克隆

2.2.7原核表达重组子的构建

2.2.8甲基对硫磷水解酶基因在大肠杆菌中的诱导表达以及检测

2.2.9酵母表达重组质粒的构建

2.2.10重组酵母菌株的获得

2.3实验结果与分析

2.3.1高效甲基对磷降解菌的筛选

2.3.2高效甲基对硫磷降解菌菌种的鉴定

2.3.3甲基对硫磷水解酶编码基因部分序列的克隆

2.3.4甲基对硫磷水解酶编码基因的克隆

2.3.5 mphxw基因原核重组质粒的构建

2.3.6重组质粒的PCR鉴定

2.3.7 mphxw基因在大肠杆菌中的表达

2.3.8 mphxw基因在毕赤酵母中的表达

讨论

本章小结

第三章 甲基对硫磷水解酶蛋白纯化及其酶学性质分析

3.1实验材料

3.1.1菌株与质粒

3.1.2实验仪器

3.1.3工具酶

3.1.4试剂

3.1.5培养基及培养条件和相关溶液的配制

3.2实验方法

3.2.1甲基对硫磷水解酶原菌粗酶液的提取

3.2.2甲基对硫磷水解酶原菌蛋白的分离和纯化

3.2.3甲基对硫磷水解酶氨基酸序列检测

3.2.4甲基对硫磷水解酶原核重组蛋白的分离和纯化

3.2.5甲基对硫磷水解酶的酶学性质分析

3.2.6甲基对硫磷水解酶降解甲基对硫磷的动力学分析

3.3 结果与分析

3.3.1甲基对硫磷水解酶(MPHXW)原菌蛋白的分离和纯化

3.3.2甲基对硫磷水解酶(MPHXW)氨基酸序列分析

3.3.3甲基对硫磷水解酶(MPHXW)原核重组蛋白的分离和纯化

3.3.4甲基对硫磷水解酶原菌蛋白和原核重组蛋白酶学性质的研究

3.3.5甲基对硫磷水解酶原菌蛋白和原核重组蛋白动力学分析

讨论

本章小结

第四章全文结论

参考文献

致谢

作者简历