参芪降糖制剂含量测定方法及其在整体质量控制中的应用

摘要

本发明提供了一种参芪降糖制剂含量测定方法，所述方法测定的是参芪降糖制剂中10个活性成分的含量：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙；本发明以化合物降糖活性为导向检测复方中的多种活性物质，能够更好的反应整个复方制剂的质量水平；同时，选取Q‑MS离子监测模式进行含量测定，质谱定量准确性高、专属性强、灵敏度高，优于传统HPLC分析方法；根据本发明方法得到的不同批次参芪降糖制剂液相图构建了指纹图谱，进行相似度评价，更科学全面的评价参芪降糖制剂产品的内在质量，为建立更高水平的质量标准提供依据。

说明书

(一)技术领域

本发明属于药物质量控制领域，具体涉及高效液相色谱-单四级杆质谱联用技术(HPLC-Q-MS)对参芪降糖制剂多成分含量测定的方法，以及对由此法得到的参芪降糖制剂液相图构建指纹图谱，还涉及此法在在参芪降糖制剂整体质量控制中的应用。

(二)背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)属于中医“消渴病”范畴：“渴而饮水多，小便数，无脂似麸片甜者，皆是消渴病也”。国际糖尿病联盟(IDF)指出，目前全球有4.15亿糖尿病成年患者，3.18亿人存在患糖尿病风险，其中，II型糖尿病占全球所有糖尿病病例的90％，因糖尿病伴发的高血糖，易导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍等并发症，大大降低了糖尿病患者的生活质量。

目前，临床上糖尿病的治疗除注射胰岛素外主要口服磺脲类和双胍类降糖药物，但西药在有效降低血糖的同时也存在众多的安全性问题和不良反应，如严重的低血糖、乳酸性酸中毒、胃肠道反应及肝损伤、永久性神经功能损伤、头痛、头晕甚至死亡等。近年来研究发现，中药的降血糖作用温和持久，疗效稳定，副作用小，恰好弥补了化药的不足，日益受到国内外内分泌界的高度重视。

参芪降糖颗粒(Shenqi Jiangtang Granule，SJG)，由11味传统中药材组成，纯中药复方制剂，属于国家四类新药，也是国家二级中药保护品种，在临床上主要适用于II型糖尿病气阴两虚证患者，临床数据显示效果良好。方中人参为扶阳益阴之良品，黄芪为补气升阳之要药，两者共为君药；臣以生地、麦冬、天花粉生津润燥而止渴；佐以枸杞子、五味子、覆盆子封固肾关；使以山药、茯苓、泽泻三焦并理。据文献报道：人参中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1均有降糖活性，2015版中国药典规定人参茎叶总皂苷的质量控制指标成分是人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1；黄芪中黄芪甲苷、刺芒柄花素、毛蕊异黄酮均有降糖活性，2015版中国药典规定黄芪药材的质量控制指标成分是黄芪甲苷；现代药理学研究亦证明生地中的低聚糖、梓醇、地黄苷D均有降糖效果；五味子醇甲是中国药典中规定的检测五味子药材的指标性成分；麦冬、天花粉、枸杞子、山药、茯苓发挥降糖效果的主要是多糖类物质或凝集素类化合物。

美国糖尿病协会提倡，糖尿病治疗的目标是把血糖降至正常水平或接近正常水平，同时减少并发症的发生，参芪降糖颗粒多成分、多靶点的作用特点更适于糖尿病的治疗。查阅国内外相关文献发现，目前，已报道的对参芪降糖颗粒的质量控制主要是：通过薄层鉴别了人参皂苷和黄芪皂苷，并用5％香草醛-冰乙酸法测定人参总皂苷和黄芪总皂苷的含量；利用HPLC法测定了参芪降糖颗粒中人参皂苷Re和Rg1的含量。以上方法大多只是对参芪降糖制剂中的一种或两种成分进行定性定量分析，不能反映整个复方制剂的质量水平，且各有不足，比如：选择性差、灵敏度低、试剂污染环境等。HPLC-Q-MS联用已成为复杂体系分离分析以及化合物结构鉴定的良好平台，但迄今未见使用此技术对参芪降糖制剂中的多类活性成分同时进行分析的文献报道，更重要的是，HPLC-Q-MS的高灵敏度、高选择性和高分辨率能够弥补传统HPLC的不足，并可以对复杂的中药复方制剂的多类成分进行同时测定。

(三)发明内容

本发明的目的是对参芪降糖制剂建立同时测定10个活性成分的含量的方法，所述的10个活性成分分别为：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙。并且，本发明利用Chempattern软件对上述含量测定方法得到的参芪降糖制剂液相图建立指纹图谱，进行相似度分析，以期更科学全面的评价参芪降糖制剂产品的内在质量，为建立更高水平的质量标准提供依据。本发明方法可应用于参芪降糖制剂的整体质量控制。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种参芪降糖制剂(通常为片剂、胶囊剂或颗粒剂)含量测定方法，所述方法测定的是参芪降糖制剂中10个活性成分的含量，所述的10个活性成分分别为：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙，所述方法包括如下步骤：

(1)制备混合对照品溶液

分别称取对照品：人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙，以甲醇为溶剂，配制成混合对照品溶液母液；

步骤(1)中，推荐所配制的混合对照品溶液母液中，人参皂苷Rb1的终浓度为99.3325μg/mL、人参皂苷Rc的终浓度为109.2657μg/mL、人参皂苷Rd的终浓度为141.0522μg/mL、人参皂苷Rg1的终浓度为152.5747μg/mL、人参皂苷Re的终浓度为224.4914μg/mL、黄芪甲苷的终浓度为52.4476μg/mL、五味子甲素的终浓度为42.9116μg/mL、五味子乙素的终浓度为55.6262μg/mL、五味子醇甲的终浓度为55.6262μg/mL、五味子醇乙的终浓度为127.1456μg/mL。

(2)制备内标物标准溶液

称取内标物丹参酮IIA，以甲醇为溶剂，配制成内标物标准溶液；

步骤(2)中，推荐所配制的内标物标准溶液中，丹参酮IIA的浓度为80μg/mL。

(3)制备供试品溶液

将参芪降糖制剂粉碎(至40目)，称取粉碎后的参芪降糖制剂粉末与甲醇混合(料液质量比3：50，g/mL)，超声提取(40KHz，1h)，提取液减压蒸除溶剂，得到浸膏；将所得浸膏加水溶解(料液质量比1：10，g/mL)，再用水饱和正丁醇溶液萃取，收集萃取液(正丁醇液层)减压蒸除溶剂，冷冻干燥，得到参芪降糖制剂提取物；以甲醇为溶剂，配制所得参芪降糖制剂提取物溶液，离心(13000rpm，10min)，取上清液，过微孔滤膜(孔径通常为0.45μm或0.22μm)，得到供试品溶液；

步骤(3)中，推荐所配制的参芪降糖制剂提取物溶液中，参芪降糖制剂提取物的浓度为2mg/mL。

(4)供试品检测

采用HPLC-Q-MS仪器，在步骤(3)制备的供试品溶液中加入步骤(2)制备的内标物标准溶液(推荐所述内标物标准溶液的体积用量为所述供试品溶液体积的0.04倍)，进样检测，得到供试品的质谱图；

所述HPLC-Q-MS仪器的工作参数条件如下：

液相色谱分离条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，粒径≤5μm(优选5μm、3.5μm或1.8μm)，流动相A为乙腈，流动相B为体积分数0.1％的甲酸水溶液，采用梯度洗脱，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样体积20μL，检测波长为203nm；

单四级杆质谱条件为：采用ESI电喷雾离子源，电压：3000V，雾化室温度350℃，干燥气流速12.0L/min，正离子模式，SIM离子监测模式，开启离子监测通道1、离子监测通道2。

(5)绘制标准曲线

取步骤(1)配制的混合对照品溶液母液，按照不同浓度梯度稀释成若干份(推荐7份)混合对照品溶液试样，在每份混合对照品溶液试样中加入步骤(2)制备的内标物标准溶液(推荐所述内标物标准溶液的体积用量为每份混合对照品溶液试样体积的0.04倍)，然后采用HPLC-Q-MS仪器，按照步骤(4)中的工作参数条件进行检测，得到混合对照品的质谱图；以混合对照品中各个单一对照品各自的进样浓度(μg/ml)为横坐标，质谱图中各个单一对照品各自对应的峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，进而得到线性回归方程，即分别得到对照品人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙的标准曲线与线性回归方程；

步骤(5)中，推荐所述的混合对照品溶液母液按1、2.5、5、10、25、50、100倍的梯度稀释成7份混合对照品溶液试样。

(6)供试品含量检测结果

将步骤(4)测得的供试品质谱图中各个活性成分化合物各自相应峰面积与内标物峰面积的比值代入步骤(5)中得到的各对照品的线性回归方程，计算得到供试品溶液中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙的含量，进而计算得到参芪降糖制剂中10种活性成分的含量。

进一步，所述步骤(4)中，所述液相色谱分离梯度洗脱的洗脱溶剂按如下时间顺序进行(表中的百分号的含义为体积百分数)：

进一步，所述步骤(4)中，所述单四级杆质谱SIM离子监测模式下，双通道监测目标化合物的名称、分子式、监测开启时间和监测离子分子量如下所示：

离子监测通道1监测的化合物信息

离子监测通道2监测的化合物信息

本发明针对现有参芪降糖制剂质量控制方法的不足，首次提出利用HPLC-Q-MS测定参芪降糖制剂中多指标成分含量的方法，以降糖活性为导向选取参芪降糖制剂中有降糖活性且含量较高的人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芪甲苷、五味子甲素、五味子醇甲、五味子醇乙、人参皂苷Rc、五味子乙素10种化合物作为指标性成分。本发明使参芪降糖制剂的质量评价方法更具科学性、系统性和专属性，同时也可为原料药中人参、黄芪、五味子的鉴别提供一定参考，为进一步提高参芪降糖制剂的质量标准提供科学依据。

本发明的有益效果是：

(1)本发明以化合物降糖活性为导向检测复方中的多种活性物质，避免了只测定一、两个化学成分而判定参芪降糖制剂整体质量的片面性，从而更好的反应整个复方制剂的质量水平；

(2)本发明选取Q-MS离子监测模式(SIM)进行含量测定，质谱定量准确性高、专属性强、灵敏度高，优于传统HPLC分析方法；

(3)本发明方法得到的不同批次参芪降糖制剂液相图，利用Chempattern软件建立参芪降糖制剂指纹图谱，进行相似度评价，更科学全面的评价参芪降糖制剂产品的内在质量，为建立更高水平的质量标准提供依据。

(四)附图说明

图1：实施例1中参芪降糖颗粒供试品溶液在洗脱程序1下的液相色谱图；

图2：实施例1中参芪降糖颗粒供试品溶液在洗脱程序2下的液相色谱图；

图3：实施例2中混合对照品溶液在洗脱程序2下的离子监测通道1质谱图；

图4：实施例2中混合对照品溶液在洗脱程序2下的离子监测通道2质谱图；

图5：实施例2中参芪降糖颗粒供试品溶液在洗脱程序2下的离子监测通道1质谱图；

图6：实施例2中参芪降糖颗粒供试品溶液在洗脱程序2下的离子监测通道2质谱图；

图7：实施例2中参芪降糖颗粒批次001135在洗脱程序2下的液相色谱图；

图8：实施例2中不同批次参芪降糖颗粒供试品溶液的液相色谱指纹图谱；

图9：实施例2中参芪降糖颗粒批间指纹图谱相似度评价示意图。

(五)具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

参芪降糖制剂色谱分离条件的优化，包括以下步骤：

考察了不同洗脱梯度对参芪降糖制剂供试品溶液化学成分分离情况的影响。

(1)色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(4.6×250mm i.d.，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相B；洗脱方式为：线性梯度洗脱，洗脱程序1见表1；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长203nm。所得液相色谱图见附图1，图中可以看出，此洗脱程序不能完全将参芪降糖颗粒中的成分洗脱出色谱柱。

表1.洗脱程序1

(2)色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(4.6×250mm i.d.，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相B；洗脱方式为：线性梯度洗脱，洗脱程序2见表2；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长203nm。所得液相色谱图见附图2，图中可以看出，各色谱峰分离良好，洗脱完全。

表2.洗脱程序2

实施例2

参芪降糖制剂HPLC-Q-MS含量测定方法的构建及应用，包括以下步骤：

(1)仪器与试药：

Agilent 1290高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，Agilent 6120单四级杆质谱仪(安捷伦科技有限公司)，KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，R210+V700型旋蒸蒸发仪(瑞士，BUCHI)，AR224CN电子天平(奥豪斯仪器有限公司)，移液枪一套(大龙兴创实验仪器有限公司)，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(4.6×250mm i.d.，5μm)；

试药：对照品

表3. 10个对照品及内标物丹参酮IIA的化合物信息

参芪降糖颗粒：山东鲁南厚朴制药厂生产，国药准字Z10950075，为颗粒剂，每包重3g。

(2)混合对照品溶液制备：

精密称取人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芪甲苷、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙，以甲醇溶解，配制成母液终浓度分别为：99.3325μg/mL、109.2657μg/mL、141.0522μg/mL、152.5747μg/mL、224.4914μg/mL、52.4476μg/mL、42.9116μg/mL、55.6262μg/mL、55.6262μg/mL、127.1456μg/mL的混合对照品溶液，按需稀释成不同浓度。

(3)内标物溶液制备：

精密称取丹参酮IIA，甲醇溶解，配制成浓度为80μg/mL的标准溶液。

(4)供试品溶液制备：

称取参芪降糖颗粒3.0g至量瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量。(400KW)超声提取60min，后静置放冷，以甲醇弥补减失重量。常压过滤，得参芪降糖颗粒粗提液。减压蒸馏，得参芪降糖颗粒提取浸膏，20mL去离子水溶解，20mL水饱和正丁醇溶液振摇萃取3次。收集正丁醇萃取液减压蒸馏至浸膏状，转移至冻干机冷冻干燥，得参芪降糖颗提取物粉末。甲醇溶解，配制成2mg/mL的参芪降糖颗粒提取物的溶液，高速离心10min(13000rpm)，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，得供试样品溶液；

(5)高效液相色谱分离条件：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(4.6x250mm i.d.，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相B；洗脱方式为：线性梯度洗脱，洗脱程序见表4；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；

表4.梯度洗脱程序

(6)质谱检测条件：

单四级杆质谱仪，离子源：ESI电喷雾离子源；电压：3000V，雾化室温度350℃，干燥器流速12.0L/min，正离子模式，SIM离子监测模式，开启离子监测通道1、离子监测通道2；

离子监测通道1对8个化合物与1个内标正离子模式下各监测SIM离子与监测开启时间如下表5所示：

表5.离子监测通道1监测的化合物信息

离子监测通道2对2个化合物与1个内标正离子模式下各监测SIM离子与监测开启时间如下表6所示：

表6.离子监测通道2监测的化合物信息

(7)标准曲线的绘制：

混合对照品溶液在母液的基础上稀释1、2.5、5、10、25、50、100倍，配制成不同浓度梯度的混合对照品溶液，分别加入混合对照品溶液0.04倍体积的丹参酮IIA内标物标准溶液，混匀，分别取20μl注入液相色谱仪，离子监测通道1质谱图见附图3、离子监测通道2质谱图见附图4。以各自标准品的进样浓度(μg/ml)为横坐标，以质谱图中各标准品与内标物峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程见下表7。

表7.参芪降糖颗粒10种成分标准曲线

(8)精密度实验

a、日内精密度：按照上述色谱与质谱条件，精密吸取混合对照品溶液一天内连续进样6次，计算各色谱峰的保留时间(t_R)以及峰面积比(P_a，分析物峰面积/内标物峰面积)的相对标准偏差(RSD)来考察日内精密度；

b、日间精密度：按照上述色谱与质谱条件，吸取混合对照品溶液分3天进样，计算方法同日内精密度；

日间精密度与日内精密度数据显示仪器精密度良好；

表8.仪器精密度与方法重复性考察结果

(9)重复性实验

取同一(山东鲁南厚朴制药厂，批次00113295)参芪降糖颗粒样品5份，按照上述供试品溶液制备方法制备5份同一批次的供试品溶液，按照上述色谱与质谱条件，精密进样。计算RSD值，结果显示方法的重复性良好。见表8。

(10)稳定性实验

取同一(山东鲁南厚朴制药厂，批次00113295)参芪降糖颗粒样品，按照上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照上述色谱与质谱条件，分别于0、4、8、12和24时测定。结果表明在实验过程中分析物很稳定，见表9。

(11)加样回收率实验

标准加入法测定回收率来考察方法的准确性，加入近似于样品中分析物浓度的0.5倍的各标准品，按照上述色谱与质谱条件，精密进样3次，测含量，计算加样回收率，结果见下表9。

表9.样品稳定性与加样回收率结果

(12)参芪降糖制剂含量测定应用

按照拟定的含量测定方法对来源于山东鲁南厚朴制药厂的批号00113295的参芪降糖颗粒进行含量测定，含量测定结果如下表10所示，离子监测通道1质谱图见附图5、离子监测通道2质谱图见附图6。

表10.山东鲁南厚朴制药厂批号00113295的参芪降糖颗粒含量测定结果(μg/g)

按照同样方法，对山东鲁南厚朴制药厂生产的另外9个不同批次的样品进行含量测定，含量测定结果见下表11(批次00113295同样列于下表)。

表11. 10个批次的参芪降糖颗粒含量测定结果(μg/g)

注：“/”表示峰面积已低于定量限。

以上对参芪降糖制剂(颗粒)的含量测定的方法学考察结果显示：该方法精密度、重复性、稳定性、回收率结果良好，能够准确、快捷地测定样品中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、黄芪甲苷、五味子甲素、五味子醇甲、五味子醇乙、人参皂苷Rc、五味子乙素10种成分的含量，可用于参芪降糖制剂的质量评价研究中。

(13)参芪降糖制剂指纹图谱建立

按上述含量测定的高效液相色谱方法，取上述参芪降糖颗粒供试品溶液20μl注入液相色谱仪，得到参芪降糖颗粒液相谱图，见附图7。

对上述含量测定的10个成分在液相图上进行标定，其中人参皂苷Rb1与黄芪甲苷液相峰中混有杂质，因此以剩余8个成分作为特征峰，利用Chempattern软件建立参芪降糖颗粒液相色谱指纹图谱，进行相似度评价。参芪降糖颗粒液相色谱指纹图谱见附图8，其中1-8号峰分别为：人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素。相似度评价示意图见附图9，其中纵坐标代表相似度。

结果显示，10批次参芪降糖颗粒液相谱图相似度均大于0.985，相似度良好。