一种利用己酸二乙氨基乙醇酯促进雨生红球藻生产虾青素的方法

摘要

本发明公开了一种利用己酸二乙氨基乙醇酯促进雨生红球藻生产虾青素的方法，首先制备雨生红球藻藻液，雨生红球藻到对数生长期后期，此时细胞浓度达到106cells mL‑1，用含10％氮的BBM培养基稀释藻液使其浓度达到2×105cells mL‑1，获得诱导用的藻液；然后用去离子水配成80mM的DA‑6母液，将DA‑6母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使DA‑6浓度达到5‑20mM；然后将上述藻液进行培养，待藻体细胞完全变红后，收集藻细胞此时其虾青素的积累量已达到最高。本发明方法简单可行，成本低廉，并大幅缩短雨生红球藻变红的时间且虾青素的量有较显著地提高，从而很大的提高了虾青素的产率。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种利用己酸二乙氨基乙醇酯促进雨生红球藻生产虾青素的方法。

背景技术

天然虾青素(3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素)是目前自然界发现的最强的抗氧化剂。天然虾青素来源自发夫酵母、鲑鱼、虾壳及雨生红球藻中，而雨生红球藻中含有丰富的虾青素，可达其干重的4％，被誉为天然虾青素的浓缩品。虾青素的抗氧化活性主要体现在一方面它是类胡萝卜素的最高级衍生物；另一方面其共轭双键末端具有不饱和的酮基和羟基，由此基团构成α-羟基酮，因此它要强于一般的类胡萝卜素的抗氧化性，高于其它类胡萝卜素10倍、维生素E 550倍，被誉为“超级氧化剂”。天然虾青素对人体无任何毒副作用，虾青素的抗氧化活性使得其在医药、化妆品和保健品等有很大的应用潜力，另外虾青素也可以作为水产动物的饲料添加剂以及食品添加剂。

雨生红球藻属于一种单细胞绿藻，它只有在胁迫条件下，比如高温、强光照、氮饥饿等，能够大量的积累虾青素。而关于刺激雨生红球藻产虾青素的诱导大多集中在物理和化学因子上，较少有关于植物激素的研究。己酸二乙氨基乙醇酯(DA-6)作为一种植物生长调节剂，能够促进植物生长，具有很强的抗逆作用，而雨生红球藻正是在这种胁迫下才大量积累虾青素。外源添加DA-6能激发植物防御基因的表达，诱导植物的化学防御，生与机械损伤和昆虫取食相似的效果。因此DA-6可能会诱导雨生红球藻大量积累虾青素。

目前国内已有多家公司可以大规模化生产虾青素，也已有了一些相关的技术和专利，例如专利一种从雨生红球藻中提取虾青素的方法(申请号：201410748498.X，申请日：2014-12-10，公开号：CN104529852A，公开日：2015-04-22)公开了一种高效提取虾青素的方法，主要利用冰醋酸冰浴、匀浆机匀浆和液氮低温处理相结合的方法，大大提高了细胞破壁率及虾青素提取率。专利一种雨生红球藻高密度培养的气升式光生物反应器(申请号：200510018203.4，申请日：2005-01-26，公开号：CN1680539A，公开日：2005-10-12)，公开了一种雨生红球藻高密度培养的气升式光生物反应器，包括养殖罐、水处理装置、照明装置、气体供应装置，通过调控反应条件实现全天候高密度养殖，并将藻的养殖和虾青素积累结合在同一反应器中完成。专利大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法(申请号：200610154678.0，申请日：2006-11-20，公开号：CN1966660，公开日：2007-05-23)，公开了一种雨生红球藻大规模培养及虾青素转化的装置，包括光生物反应器、充气装置、培养液灌输装置和静细胞收集装置，通过浮沉控制装置实现全天候高密度养殖，并将藻的养殖和虾青素积累结合在同一反应器中完成。专利用酵母发酵残液培养藻类生产虾青素的方法(申请号：03130442.7，申请日：2003-07-23，公开号：CN1480524A，公开日：2004-03-10)，公开了一种利用酵母发酵残液生产虾青素的方法，是向酵母发酵残液中加入无机盐配成培养基，在特定的容器内培养雨生红球藻或绿球藻，经过分离提取虾青素。上述相关专利技术虽然先进，但是工艺较为复杂，设备要求高，操作较为繁琐，这就增加了生产的成本和技术推广的难度。专利一种利用黄腐酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法(申请号：201510376770.0申请日：2015-07-01)，公开了一种利用利用黄腐酸提高虾青素积累的方法，虽然提高了虾青素的积累，但虾青素积累量以及提取率鉴于生产需求还需进一步提高，培养完的废液也未充分利用。

发明内容

有鉴于此，本发明针对以上的问题，提供了一种利用己酸二乙氨基乙醇酯促进雨生红球藻生产虾青素的方法，该方法的不仅操作简单、成本低，而且可很大程度上缩短积累虾青素的周期及提高虾青素的产率及提取率，培养完藻的废液可以直接用于灌溉农田，提高利用率。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用己酸二乙氨基乙醇酯促进雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以下步骤：

步骤1、藻液的制备：培养雨生红球藻到对数生长期后期，用含10％(质量百分含量)氮的BBM培养基稀释藻液并获得诱导的藻液；

步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：用DMSO配成80mM的DA-6母液，将DA-6母液添加到已经稀释好的诱导的藻液中使DA-6浓度达到5-20mM；然后将上述藻液进行培养，待藻体细胞完全变红后，收集藻细胞；

步骤3、利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素。

进一步地，雨生红球藻为雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU。

进一步地，步骤1中藻液的制备具体为：在25℃、光强2500-2800lx，持续光照条件下培养，培养雨生红球藻到达对数生长期后期，此时细胞浓度达到10⁶cells>-1，利用含10％(质量百分含量)氮的BBM培养基稀释到2×10⁵cells>-1作为诱导藻液。

进一步地，步骤2中诱导雨生红球藻积累虾青素中的培养条件为：28℃、光强11000-12000lx、冷光灯连续光照及氮饥饿的复合胁迫。

进一步地，步骤3中利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素具体为：取5ml上述藻液，3500r/min离心5min，弃上清得藻细胞沉淀；分别向藻细胞沉淀中加入2mL 30％甲醇和5％KOH混合液，66℃水浴15min，4000r/min离心10min，除上清，沉淀加入纯水洗涤2次，除碱液残留；然后加入5mL DMSO，250w超声破壁15min，其中，超声1min，10s间歇，于45℃水浴20min，抽提至藻体发白，离心收集上清测OD490；并按照公式计算得出虾青素的浓度，其中C为虾青素浓度，A为490nm下OD值，Va为DMSO体积，Vb为藻液体积。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明操作简单易行、成本低、虾青素提取率高，原材料为自己筛选的雨生红球藻菌株可按常规方法培养。提高培养完藻的废液利用率。

2)本发明大幅提高了虾青素的产率，实验证明，添加5-20mM的DA-6的诱导组比对照组积累虾青素的周期缩短了13-27％，虾青素的产量比对照组提高了87-91.6％，达到22.708-23.26mg>-1。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明提供一种利用己酸二乙氨基乙醇酯促进雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以下步骤：

步骤1、藻液的制备：雨生红球藻采用雨生红球藻菌株

Haematococcus pluvialis LUGU(NCBI:KM115647)，利用BBM培养基，在25℃、光强2800lx，持续光照条件下培养，培养雨生红球藻到达对数生长期后期，此时藻细胞浓度达到10⁶cells>-1，无菌条件下离心，利用含10％氮的BBM培养基稀释到2×10⁵cells>-1作为诱导藻液；

步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：用去离子水配成80mM的DA-6母液，将DA-6母液添加到已经稀释好的诱导的藻液中使DA-6浓度达到5-20mM；然后将上述藻液在28℃、光强11000-12000lx、冷光灯连续光照及氮饥饿的复合胁迫下进行培养，待藻体细胞完全变红后，收集藻细胞，

步骤3、利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素，虾青素的提取方法：

每隔一天取5ml上述藻液，3500r/min离心5min，弃上清得藻细胞沉淀；分别向藻细胞沉淀中加入2mL 30％甲醇和5％KOH混合液，66℃水浴15min，4000r/min离心10min，除上清，沉淀加入纯水洗涤2次，除碱液残留；然后加入5mL DMSO，250w超声破壁15min(超声1min，10s间歇)，于45℃水浴20min，抽提至藻体发白，离心收集上清测OD490；并按照公式计算得出虾青素的浓度，其中C为虾青素浓度，A为490nm下OD值，Va为DMSO体积，Vb为藻液体积。

实施例1

(1)雨生红球藻采用雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU，利用BBM培养基，在25℃、光强2800lx，持续光照条件下培养，培养雨生红球藻到达对数生长期，此时藻细胞浓度达到10⁶cells>-1，利用含10％氮的BBM培养基稀释到2×10⁵cells>-1作为诱导藻液。

(2)用去离子水配成80mM的DA-6母液，将DA-6母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使DA-6度达到5mM；然后将上述藻液在28℃、光强11500lx、冷光灯连续光照及饥饿营养盐的复合胁迫下进行培养，每天定期取样观察藻细胞颜色变化，发现11天后藻体细胞完全变红后，收集藻细胞利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素，此时其虾青素的积累量已达到最高。

实施例2

(1)雨生红球藻采用雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU，利用BBM培养基，在25℃、光强2800lx，持续光照条件下培养，培养至雨生红球藻到达对数生长期，此时藻细胞浓度达到10⁶cells>-1，利用含10％氮的BBM培养基稀释到2×10⁵cells>-1作为诱导藻液。

(2)用去离子水配成80mM的DA-6母液，将DA-6母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使DA-6浓度达到10mM；然后将上述藻液在28℃、光强11000lx、冷光灯连续光照及饥饿营养盐的复合胁迫下进行培养，每天定期取样观察藻细胞颜色变化，13天后藻体细胞完全变红后，收集藻细胞利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素，此时其虾青素的积累量已达到最高。

实施例3

(1)雨生红球藻采用雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialisLUGU，利用BBM培养基，在25℃、光强2800lx，持续光照条件下培养，培养至雨生红球藻到达对数生长期，此时藻细胞浓度达到10⁶cells>-1，利用含10％氮的BBM培养基稀释到2×10⁵cells>-1作为诱导藻液。

(2)用去离子水配成80mM的DA-6母液，将DA-6母液添加到已经稀释好的诱导藻液中使DA-6浓度达到20mM；然后将上述藻液在28℃、光强12000lx、冷光灯连续光照及饥饿营养盐的复合胁迫下进行培养，每天定期取样观察藻细胞颜色变化，13天后藻体细胞完全变红后，收集藻细胞利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素，此时其虾青素的积累量已达到最高。

己酸二乙氨基乙醇酯(DA-6)作为一种植物生长调节剂可以有效地促进植物的生长和发育，利用一定浓度的DA-6作为诱导剂，诱导雨生红球藻积累虾青素，通过采用上述虾青素的提取方法对各组进行提取虾青素，结果显示：空白对照组(不添加DA-6)积累虾青素完成的时间为15天，第15天时虾青素的含量为12.14mg>-1，DA-6处理后的比对照组积累虾青素的周期缩短了13-27％，且虾青素的产量比对照组提高了87-91.6％，达到22.708-23.26mg>-1。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。