抗生链霉菌FY57及其在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用

摘要

本发明涉及一种抗生链霉菌及其在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，所述的抗生链霉菌FY57(Streptomyces antibioticus FY57)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC M.12560。本发明方法具有成本低、操作简单、稳定性好、环境友好等特点，所产胰蛋白酶抑制剂具有酸碱稳定性、热稳定性和储藏稳定性好及活力高等特点。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种胰蛋白酶抑制剂，特别涉及一种利用海洋源抗生链霉菌制备产胰蛋白酶抑制剂的方法。

(二)背景技术

胰蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶，是人体消化系统必不可少的成分。胰腺分泌的胰蛋白酶原进入小肠，在肠激酶作用下水解形成胰蛋白酶，降解蛋白质生成小分子肽类和氨基酸，提供人体必需的营养。但是，当胰蛋白酶原在胰腺内被激活，会自行裂解胰腺导致胰腺炎的产生，造成不可逆转的组织损伤。胰蛋白酶除了分泌于胰腺中，还少量存在于皮肤、肾脏、肝脏、大脑和免疫系统细胞中。胰蛋白酶参与人体各种生理和病理过程，活性水平异常会导致各种疾病。

胰蛋白酶抑制剂可以与胰蛋白酶发生结合反应，从而调控酶的活性。目前，已知的胰蛋白酶抑制剂主要从大豆、动物内脏等动植物中提取获得，如：抑肽酶、乌司他丁等，它们具有广泛的生物学活性，对急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克等疾病有独特的疗效。动植物源胰蛋白酶抑制剂虽已应用于临床，并取得了良好的医疗效果，但存在诸多不足。首先，动植物源胰蛋白酶抑制剂原料受限；其次，动植物源胰蛋白酶抑制剂主要是分子量较大的蛋白质，生物活性往往不稳定，易受多种理化因素的作用而失活，如凝聚、降解、消旋化等，而且不耐酸碱、不耐高温；另外，作为蛋白类药物，其进入人体后易产生首过消除效应，药效降低，给药方式局限于静脉、皮下注射，易产生免疫反应，危及患者的生命健康。

微生物具繁殖速度快、产活性物质能力强及种类多、生产成本低等多种优势，微生物活性代谢产物已成为当前药物开发的丰富资源，从微生物中开发胰蛋白酶抑制剂，具有重要的社会意义和经济价值。海洋微生物作为一个巨大的尚待开发的资源越来越受到关注，已成为一个新的研究热点。海洋面积占地球面积的70％以上，且海洋生境为一封闭、高压、高盐和低温的特殊环境，这赋予海洋微生物产生结构新颖和作用独特代谢产物的能力。因此，海洋微生物已成为胰蛋白酶抑制剂开发的新资源。

(三)发明内容

本发明目的是从海洋生境中筛选获得产胰蛋白酶抑制剂的新菌株—抗生链霉菌FY57，以及提供一种利用抗生链霉菌FY57制备胰蛋白酶抑制剂的方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株--抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)FY57，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.12560，保藏日期为2016年5月30日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明还提供一种所述的抗生链霉菌FY57在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用，所述抑制剂源自抗生链霉菌FY57经发酵培养获得的发酵液离心后获得的上清液。

进一步，所述的抗生链霉菌FY57在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用为：以抗生链霉菌FY57发酵培养获得的发酵上清液为抑制剂，以胰蛋白酶为作用目标酶，25～50℃，pH6～9，反应5～30min，进行抑制反应；再加入Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(BAPNA)，25～50℃，pH6～9，反应5～60min，在410nm下测定BAPNA降解所释放出对硝基苯胺的吸光值，测定抑制率。抑制剂活性越高，抑制率越高，对硝基苯胺的量越低，410nm下的吸光值越低。

所述的胰蛋白酶为牛胰蛋白酶、兔胰蛋白酶、猪胰蛋白酶、鼠胰蛋白酶、猴胰蛋白酶、鸡胰蛋白酶、马胰蛋白酶或犬胰蛋白酶，优选牛胰蛋白酶。

所述抑制剂为抗生链霉菌FY57发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液，所述抗生链霉菌FY57发酵液中湿菌体浓度为10～50mg/L，所述胰蛋白酶浓度为20～200μg/mL，所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0.05～2.5mg湿菌体/mg胰蛋白酶，所述含湿菌体发酵液是指离心前的含湿菌体发酵液。

所述的发酵上清液按如下步骤制备：(1)斜面培养：将抗生链霉菌FY57接种于斜面培养基，20～37℃培养3～5d，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：可溶性淀粉5～30g/L，K₂HPO₄>4·7H₂O>4·7H₂O>2HPO₄>4·7H₂O>4·7H₂O0.01g/L，海盐25g/L，琼脂25g/L，溶剂为水，pH7.5；(2)种子培养：从斜面菌体挑取1～3接种环菌种接种至种子培养基，20～37℃培养5～7d(25℃，200rpm转速下培养5d)，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：可溶性淀粉5～30g/L，K₂HPO₄>4·7H₂O0.01～0.05g/L，FeSO₄·7H₂O>2HPO₄>4·7H₂O>4·7H₂O>3>2HPO₄>4)₂SO₄>4·7H₂O>3>2HPO₄>4)₂SO₄>4·7H₂O>

更进一步，所述的抗生链霉菌FY57在产胰蛋白酶抑制剂中的应用为：以抗生链霉菌FY57发酵培养获得的发酵上清液为抑制剂源，以牛胰蛋白酶为作用目标酶，37℃，pH8，反应10min，再用Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐法即BAPNA法测定抑制率。

本发明还涉及所述抗生链霉菌FY57发酵培养获得的上清液在制备胰蛋白酶抑制剂中的应用。

所述的BAPNA法测定抑制率为：实验共设三组，分别是样品组(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL菌株FY57的发酵上清液)、阴性对照(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL pH8的Tris-HCl缓冲液)和样品对照组(100μL菌株FY57发酵上清液)；三组实验均在37℃下反应10min，再加入250μL BAPNA后，在37℃下反应20min；然后加入100～300μL30％醋酸终止反应，在25～37℃下保温10～60min；样品对照组加入100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液；所有实验组均在8000～12000rpm下离心5～30min，取上清；上清稀释2～5倍，测定410nm下对硝基苯胺吸光值。

胰蛋白酶抑制率的计算：以胰蛋白酶水解BAPNA产生对硝基苯胺的吸光值代表胰蛋白酶的活性，样品对胰蛋白酶的抑制率通过以下公式计算获得：

所述的BAPNA法测定菌株FY57发酵上清液对胰蛋白酶抑制率为90％左右。

本发明中菌株FY57所产生的胰蛋白酶抑制剂是被分泌到细胞外的，因此，抗生链霉菌FY57发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心后去除菌体，获得的上清液中含有抑制剂，即抑制剂源。所以本发明中以抗生链霉菌FY57发酵液离心后获得的上清液而不是湿菌体来进行抑制反应。所述上清液的用量以离心前含湿菌体发酵液中湿菌体的质量来计。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株新的产胰蛋白酶抑制剂的微生物菌种——抗生链霉菌FY57，利用该菌种生产胰蛋白酶抑制剂的方法具有成本低、操作简单、稳定性好(传代4次的抑制率保持在80％以上)、环境友好等特点，所产胰蛋白酶抑制剂不但酸碱稳定性(能耐受2～13的pH)和热稳定性好(能耐受100℃高温)，而且其储藏稳定性好(25℃下保藏20天仍保持50％左右抑制率)及活力高(稀释度达55倍左右)，这些特点赋予抗生链霉菌FY57所产胰蛋白酶抑制剂在医药领域具有广阔的应用前景。

(四)附图说明

图1为菌株FY57发酵液抑制牛胰蛋白酶水解酪蛋白的示意图；

图2为抗生链霉菌FY57的系统发育树；

图3为pH对菌株FY57发酵液对牛胰蛋白酶的抑制率影响；

图4为温度对菌株FY57发酵液对牛胰蛋白酶的抑制率影响；

图5为煮沸对菌株FY57发酵液对牛胰蛋白酶的抑制率影响；

图6为保藏条件对菌株FY57发酵液对牛胰蛋白酶的抑制率影响；

图7为稀释倍数对菌株FY57发酵液对牛胰蛋白酶的抑制率影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1:抗生链霉菌FY57菌种的筛选与鉴定

(1)菌种筛选

①菌种来源：从厦门鼓浪屿(24.45°N，118.07°E)的海泥中分离筛选获得；

②菌种分离筛选：从厦门鼓浪屿海域(24.45°N，118.07°E)海平面50cm以下收集海泥，置于无菌的样品瓶中带至实验室，然后称取10g海泥样品，加入到90mL的无菌海水中，混匀后即是浓度为10^-1的样品，然后按常规方法分别梯度稀释成浓度为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的样品；分别取不同浓度的样品100μL涂布于海洋高氏固体培养基(终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄>4·7H₂O>4·7H₂O>2HPO₄0.02g/L，MgSO₄·7H₂O>4·7H₂O0.01g/L，海盐25g/L，溶剂为水，pH7.5)中，于25℃、200rpm转速下摇床培养4d，8000rpm离心5min收集发酵液上清，测定胰蛋白酶活性，筛得胰蛋白酶抑制剂产生菌。

③酪蛋白平板法筛选胰蛋白酶抑制剂产生菌

酪蛋白平板的制备(质量组成)：1％的酪蛋白，2％的琼脂，加入pH8.0磷酸钾缓冲溶液中，加热煮沸，边搅拌边加热防止酪蛋白焦化。煮沸后，用玻璃棒将溶液上层的气泡去除干净，倒入平皿中(每个平板倒入体积为25mL)，静置，冷却凝固。用打孔器对称地在平板上打4个直径6mm的孔，用火焰固定。

产生菌所产胰蛋白酶抑制剂的活性测定(BAPNA法)：100μg/mL牛胰蛋白酶溶液(溶剂为无菌水)和pH8.0磷酸钾缓冲溶液预先放到37℃水浴5min，待用。将200μL牛胰蛋白酶溶液和200μL菌株发酵上清液混合(以200μL牛胰蛋白酶溶液和200μL pH8.0磷酸钾缓冲溶液的混合液为阴性对照)加入酪蛋白平板的孔中，37℃下放置12h。在酪蛋白平板上加100μL三氯乙酸，涂布均匀，酪蛋白变性呈乳白色，牛胰蛋白酶的水解圈则是透明的，用尺子测量水解圈的直径。总共测定三批发酵液，每批三组平行。

胰蛋白酶抑制率的计算：胰蛋白酶抑制剂将导致胰蛋白酶水解酪蛋白的体积减少(水解圈变小)，抑制率通过以下公式计算获得：

其中R₁为阴性对照水解圈的半径/mm；R₂为样品水解圈的半径/mm；H为酪蛋白平板的高度/mm；

发现17株菌的发酵上清液能够抑制牛胰蛋白酶水解酪蛋白，导致水解圈减小(比阴性对照小)(表1)，其中，菌株FY57对牛胰蛋白酶的抑制率最高，详见表1和图1。

表1酪蛋白平板法筛选的菌株胰蛋白酶抑制率

(2)菌种FY57的鉴定

①菌种FY57的分子鉴定

基因组DNA的提取：取菌液1.5mL，移入1.5mL EP管中，12000rpm，4℃离心1min，弃上清。向沉淀中加入125μL浓度为0.5M EDTA(pH8.0)，1μL RNaseA(10mg/mL)，20μL溶菌酶(10mg/mL)，剧烈震荡，37℃水浴30min。加70μL 10％SDS，5μL 10mg/mL蛋白酶K，振荡摇匀，将EP管置于37℃水浴5min，然后55℃水浴30min。加70μL 5M NaCl，摇匀，冰浴30min。12000r/min、4℃离心20min。取上清，补水至500μL，加入一倍体积的Tris饱和酚，上下混匀，12000r/min、4℃离心10min。取上清，加两倍体积的无水乙醇，-20℃下放置10min。12000r/min、4℃离心10min，弃上清。用体积浓度75％的乙醇水溶液清洗一遍，晾干后加入50μLddH₂O，冰箱备用。

16S rRNA基因扩增和测序：配制50μL的PCR反应混合液，内含：37μL无菌水，5μL 10×Taq DNA聚合酶缓冲液，4μL浓度为2.5mM的dNTPs，100nM上游引物27F(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，100nM下游引物1492R(5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，1ng菌株FY57基因组DNA和1U Taq DNA聚合酶。然后将反应混合液置于PCR仪上扩增菌株FY57的16S rDNA，扩增程序为：94℃变性5min，然后是30个循环，每个循环包括94℃变性1min，55℃退火50s，72℃延伸90s，循环结束后，72℃再延伸10min，然后保存在4℃下。扩增结束后，用浓度为1.0％琼脂糖凝胶电泳确证PCR产物大小后，送生工生物工程(上海)有限公司进行DNA测序。16S rRNA基因序列(SEQ ID NO.1)为：CTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATCACTCTTGCAGGCATCTGTGAGGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGTCCTTCGGGATGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCAGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGG。

将菌株FY57的16S rDNA序列在NCBI网站上进行同源性比对，再用MEGA6.0软件绘制系统发育树，结果如图2所示，发现菌株FY57与链霉菌属中的一些菌相似性较高，尤其是与两株抗生链霉菌Streptomyces antibioticus strain NBRC 12838和Streptomycesantibioticus strain 1022-257的亲缘关系最近，16S rRNA基因的相似性为100％，因此，基本可以确定菌株FY57是一株抗生链霉菌。

②菌种FY57的形态特征和生理生化特征

根据《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology》(伯杰氏系统细菌学手册)中对抗生链霉菌鉴定要求和鉴定方法，分别测定菌株FY57的形态特征和生理生化特性，结果如下：

菌株FY57的菌丝体呈簇状生长，孢子为椭圆形或杆状，表面光滑，孢子链长而直；营养菌丝体为肉色，气生菌丝体为白色，孢子培养短时间后显示灰色带白斑，培养7d以后，孢子的颜色由灰色转变为黄棕色略带粉紫色。菌株FY57可水解明胶，明胶一开始液化非常慢，5d后速度变快并产生黑色素；可以胨化牛奶变透明，还可产生酪氨酸酶和H₂S。菌株FY57可利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、鼠李糖、肌醇、D-甘露醇和D-木糖，不利用蔗糖和棉子糖，能水解淀粉和纤维素。以上所有的菌落形态特征和生理生化特性与《Bergey'sManual>

综上，将菌株FY57被命名为抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)FY57。

实施例2胰蛋白酶抑制剂

(1)斜面培养：将抗生链霉菌FY57接种于斜面培养基，25℃培养5d，获得斜面菌体，所述斜面培养基终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄0.02g/L，MgSO₄·7H₂O>4·7H₂O>

(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌株接种至种子培养基，25℃，200rpm转速下培养5d，获得种子液，所述种子培养基终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄>4·7H₂O>4·7H₂O0.01g/L，海盐25g/L，溶剂为水，pH7.5；

(3)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至发酵培养基，25℃，200rpm转速下培养7d，获得发酵液；将发酵液经8000rpm，离心10min后，弃去沉淀，收集上清液，获得所述胰蛋白酶抑制剂；所述发酵培养基终浓度组成为：可溶性淀粉10g/L，葡萄糖5g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，海盐25g/L，CaCO₃>2HPO₄>4)₂SO₄>4·7H₂O>

实施例3:BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率

将实施例2制备发酵上清液共设三组测定抑制率，分别是样品组(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL菌株FY57发酵上清液)、阴性对照(100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液+100μL pH8的Tris-HCl缓冲液)和样品对照组(100μL菌株FY57发酵上清液)；三组实验均在37℃下反应10min，再加入250μL BAPNA后，在37℃下反应20min；然后加入100μL体积浓度30％醋酸水溶液终止反应，在37℃下保温10min；样品对照组加入100μL 100μg/mL的牛胰蛋白酶溶液；所有实验组均在10000rpm下离心10min，取上清；上清用无菌水稀释3倍，测定410nm下对硝基苯胺吸光值。

胰蛋白酶抑制率的计算：以胰蛋白酶水解BAPNA产生对硝基苯胺的吸光值代表胰蛋白酶的活性，样品中抑制剂对胰蛋白酶的抑制率通过以下公式计算获得：

测得菌株FY57发酵上清液对胰蛋白酶抑制率为89.5％。

实施例4：菌株FY57产胰蛋白酶抑制剂的遗传稳定性

将菌株FY57在海洋高氏固体培养基(终浓度组成：可溶性淀粉10g/L，K₂HPO₄0.02g/L，MgSO₄·7H₂O>4·7H₂O>

实施例5：菌株FY57的胰蛋白酶抑制剂的酸碱稳定性

取12支50mL的离心管，分别加入按实施例2所制备的菌株FY57发酵上清液10mL，分别用1M NaOH和1M HCl调节pH至2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13，以原发酵液pH8为参照，室温放置6h后，再用NaOH和HCl调回原发酵液的pH8，按实施例3所述的BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果见图3。从图3可见，随着pH从2上升至7，菌株FY57发酵上清液对胰蛋白酶抑制率随之增加；pH从7上升至13，菌株FY57发酵上清液对胰蛋白酶抑制率随之减小，可见，菌株FY57发酵上清液中胰蛋白酶抑制剂的最佳pH为7.0，抑制率高达98.9％；另外，在pH为2.0(强酸)和pH为13.0(强碱)条件下，抑制剂均保持一定的活性，抑制率为30％左右。综上可见，菌株FY57所产胰蛋白酶抑制剂具有较强的耐酸、耐碱能力。

实施例6：菌株FY57的胰蛋白酶抑制剂的热稳定性

(1)取7支1.5mL的离心管，分别加入按实施例2所制备的菌株FY57发酵上清液1mL，然后在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中恒温处理30min，接着再放至室温(25℃)下30min，待恢复到原发酵液的温度(25℃)后，按实施例3所述的BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果见图4。从图4可见，当处理温度维持在70℃以下，抑制剂的活性比较稳定，对牛胰蛋白酶的抑制率保持在80％以上；当处理温度升高至80℃以及90℃，抑制剂活性有所下降，但抑制率仍保持在50％左右；当处理温度升至100℃并处理30min，抑制活性基本丧失。

(2)取7支1.5mL的离心管，分别加入按实施例2所制备的菌株FY57发酵上清液1mL，然后在100℃水浴中恒温处理0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min，接着再放至室温(25℃)下30min，待恢复到原发酵液的温度(25℃)后，按实施例3所述的BAPNA法测定菌株FY57发酵上清液中抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果见图5。从图5可见，整体上，随着煮沸时间的延长，抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率随之降低；当处理时间在10min以内，抑制率保持在60％左右；当处理时间在25min以内，抑制率仍然维持在30％左右。

综上可见，菌株FY57所产胰蛋白酶抑制剂具有极强的耐高温能力。

实施例7：菌株FY57的胰蛋白酶抑制剂的储藏稳定性

将按实施例2所制备的菌株FY57发酵上清液分别在-20℃、4℃、25℃和50℃下保存，每隔一段时间取样，按实施例3所述的BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果见图6。从图6可见，菌株FY57发酵上清液中抑制剂的最佳储存温度为-20℃，保存1个月内抑制剂活性基本没有变化；储存温度上升至4℃，1个月内抑制剂活性也基本没有变化；当储存温度继续上升至25℃，保存20天，菌株FY57发酵上清液中抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率仍然保持在50％左右；当储存温度继续上升至50℃，抑制剂活性下降比较快。综上可见，菌株FY57所产胰蛋白酶抑制剂具有较好的储藏稳定性。储藏温度的上升有助于细菌滋生，从而降解抑制剂。对菌株FY57发酵液中抑制剂的分离纯化有望进一步提高抑制剂的储藏稳定性。

实施例8：稀释倍数对菌株FY57的胰蛋白酶抑制剂的抑制率影响

将按实施例2所制备的菌株FY57发酵上清液用pH8.0磷酸钾缓冲液(pH与发酵液一致)分别稀释5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍和55倍，按实施例3所述的BAPNA法测定抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率，结果见图7。从图7可见，整体上，随着稀释倍数的上升，菌株FY57发酵液中抑制剂对牛胰蛋白酶的抑制率逐渐下降；当稀释倍数为55时，抑制率接近为0，所以菌株FY57发酵液中抑制剂的最大稀释倍数为55左右。由于测定的是未经分离纯化的发酵液的最大稀释倍数，菌株FY57所产抑制剂的实际最大稀释倍数有望远高于55。综上可见，该胰蛋白酶抑制剂的效价是比较高的。