用于诊断胰腺癌的包括用于特异性结合至补体因子B蛋白的抗体和用于特异性结合至糖类抗原19‑9蛋白的抗体的试剂盒

摘要

本申请涉及包括用于特异性结合至补体因子B蛋白的抗体和用于特异性结合至糖类抗原19‑9蛋白的抗体的胰腺癌诊断试剂盒、利用该胰腺癌诊断试剂盒提供用于诊断胰腺癌的信息的方法以及利用该胰腺癌诊断试剂盒的胰腺癌诊断方法。根据本申请，能够提供具有提高的敏感性和特异性的用于胰腺癌诊断的标志物。

说明书

技术领域

本申请涉及包括用于特异性结合至补体因子B蛋白的抗体和用于特异性结合至糖类抗原19-9蛋白的抗体的胰腺癌诊断试剂盒，利用其提供用于诊断胰腺癌的信息的方法以及利用其的胰腺癌诊断方法。

背景技术

胰腺癌作为世界上发病率第九高的主要的癌症，是死亡率第四高的恶性肿瘤(Lowenfels，A.B.等，Best Pract Res Clin Gastroenterol(临床胃肠病学最佳实践与研究)，197-209，2006)。在大多数国家中，胰腺癌在所有恶性肿瘤发病中所占的比重不超过2％-3％，但是死亡人数在所有肿瘤相关死亡中所占的比重高达6％。这是因为预后不良的程度为胰腺癌的两年生存率低至只有10％左右，5年生存率也不超过5％(Lee，C.N.等，Pancreas(胰腺)，94-94，2012)。

由于在大多数情况下胰腺癌在晚期之前没有症状，因此经常一旦诊断出胰腺癌，则已经到非常晚期，因而无法进行手术。此外，即使在能够进行手术的情况下，手术后的患者中的80％-90％的患者因复发而死亡。为了治疗胰腺癌，除了手术治疗之外，还在进行放射治疗、化学治疗等，但是在大多数情况下对患者的生存期的效果仍有限。因此，在早期诊断胰腺癌是至关重要的。

作为诊断胰腺癌的方法，目前有使用计算机断层扫描(Computed Tomography，CT)或磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)的活组织检查，而且最近，作为能够诊断胰腺癌的临床样品，同时测量诸如血浆的体液中的蛋白分析，以判断是否存在胰腺癌或发病可能性。目前，与胰腺癌相关的最常用的肿瘤标志物是糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)，但是已知CA 19-9在除了胰腺癌以外的包括胆道在内的所有消化系统癌的患者的血浆中也会上升，此外已知在患有没有恶性肿瘤的胆管炎和胆道闭塞的情况下也会上升，因此其特异性低(资料来源：韩国国家健康信息门户网站)。此外，在早期癌中，CA 19-9标志物的血中浓度经常显示为正常，因此CA 19-9标志物无法用于早期诊断。

此外，补体因子B(Complement factor b，CFB)作为也称作CFB的蛋白质，是补体活化的替代途径中的重要成分中的一者。替代途径由病原体细胞表面的糖结构激活，而与抗原-抗体复合体的形成无关。首先，血液中少量存在的C3b结合至微生物的表面，从而诱导活化。若C3b与血液中的补体因子B结合，则C3b被补体因子D分解为C3bBb和Ba，而丙哌利定使C3bBb稳定以使C3bBb成为替代途径的C3转化酶，并进入制备更多C3b的扩增阶段。其结果是生成更多的C3转化酶，所生成的C3转化酶和C3b结合至微生物细胞表面，从而形成C3bBb3b复合体。所形成的C3bBb3b复合体起到替代路径的C5转化酶的作用，以将C5分解为C5a和C5b，最终在细菌表面形成MAC(膜攻击复合体)。其结果是，杀死细菌且去除抗原。已知补体因子B是通过与作为该替代路径的初始步骤的c3b蛋白结合而对c5的生成起到重要作用的分泌性蛋白，其作为糖蛋白而具有五个糖基化位点(glycan site)。

已知在卵巢癌(Wu.J.等，JPR，4541-52，2012)、上咽癌(Seriramalu，R.等，Electrophoresis(电泳)，2388-95，2010)、乳腺癌(Doustjalali，S.R.等，Electrophoresis(电泳)，2392-401，2004)等各种患者的血清中会分泌补体因子B。然而，到目前为止，没有尝试过组合补体因子B和糖类抗原以诊断胰腺癌。

发明内容

技术问题

因此，本申请的目的是提供包括用于特异性结合至补体因子B蛋白的抗体和用于特异性结合至糖类抗原19-9蛋白的抗体的胰腺癌诊断试剂盒，利用其提供用于诊断胰腺癌的信息的方法以及利用其的胰腺癌诊断方法，其中，所述补体因子B蛋白是特异性和敏感性优异的、用于胰腺癌诊断的新型生物标志物。

技术方案

本申请提供胰腺癌诊断方法和提供用于诊断胰腺癌的信息的方法，其中，该两种方法均包括测量从个体分离出的血液样品内的补体因子B的蛋白质表达水平。

此外，本申请提供补体因子B作为胰腺癌诊断标志物的用途。具体地，本申请提供包括用于特异性结合至补体因子B蛋白的抗体的用于胰腺癌诊断的试剂盒。

在一个实施方式中，补体因子B蛋白可以由序列号1的氨基酸序列形成。

序列号1：

MGSNLSPQLCLMPFILGLLSGGVTTTPWSLARPQGSCSLEGVEIKGGSFRLLQEGQALEYVCPSGFYPYPVQTRTCRSTGSWSTLKTQDQKTVRKAECRAIHCPRPHDFENGEYWPRSPYYNVSDEISFHCYDGYTLRGSANRTCQVNGRWSGQTAICDNGAGYCSNPGIPIGTRKVGSQYRLEDSVTYHCSRGLTLRGSQRRTCQEGGSWSGTEPSCQDSFMYDTPQEVAEAFLSSLTETIEGVDAEDGHGPGEQQKRKIVLDPSGSMNIYLVLDGSDSIGASNFTGAKKCLVNLIEKVASYGVKPRYGLVTYATYPKIWVKVSEADSSNADWVTKQLNEINYEDHKLKSGTNTKKALQAVYSMMSWPDDVPPEGWNRTRHVIILMTDGLHNMGGDPITVIDEIRDLLYIGKDRKNPREDYLDVYVFGVGPLVNQVNINALASKKDNEQHVFKVKDMENLEDVFYQMIDESQSLSLCGMVWEHRKGTDYHKQPWQAKISVIRPSKGHESCMGAVVSEYFVLTAAHCFTVDDKEHSIKVSVGGEKRDLEIEVVLFHPNYNINGKKEAGIPEFYDYDVALIKLKNKLKYGQTIRPICLPCTEGTTRALRLPPTTTCQQQKEELLPAQDIKALFVSEEEKKLTRKEVYIKNGDKKGSCERDAQYAPGYDKVKDISEVVTPRFLCTGGVSPYADPNTCRGDSGGPLIVHKRSRFIQVGVISWGVVDVCKNQKRQKQVPAHARDFHINLFQVLPWLKEKLQDEDLGFL

在一个实施方式中，个体可以是胰腺癌疑似患者。

在一个实施方式中，还可以包括如下步骤：将从个体分离出的血液样品内的补体因子B的蛋白质表达水平与正常对照组内的补体因子B的蛋白质表达水平进行比较。在本说明书中，正常对照组指的是从没有胰腺癌等疾病的健康的个体分离出的血液样品。比较两个胰腺癌样品后，在胰腺癌疑似患者的样品的补体因子B的蛋白质表达水平高于正常对照组的样品的补体因子B的蛋白质表达水平的情况下，可以将所述疑似患者分类为胰腺癌患者。例如，在胰腺癌疑似患者的样品的补体因子B的蛋白质表达水平高于正常对照组样品的补体因子B的蛋白质表达水平两倍以上的情况下，可以将所述疑似患者分类为胰腺癌患者。

在一个实施方式中，血液样品可以是全血样品、血浆样品或血清样品。

在本申请中，术语“诊断”指的是确认病理状态的存在或特征。鉴于本申请的目的，诊断指的是确定胰腺癌是否发生和复发。

在本申请中，术语“用于诊断的标志物”或“诊断标志物”，作为能够将癌细胞和正常细胞区分并诊断癌细胞的物质，包括相比正常细胞在癌细胞中增加或减少的有机生物分子等，该有机生物分子诸如多肽或核酸(例如：mRNA等)、脂质、糖脂、糖蛋白或糖(单糖、二糖、寡糖等)等。鉴于本申请的目的，胰腺癌诊断标志物是相比正常胰腺组织细胞在胰腺癌细胞中示出高水平的特异性表达的CA 19-9和/或补体因子B的基因及由其编码的蛋白质。

在本申请中，术语“蛋白质表达水平测量”作为为了诊断癌症而在生物学样品中确认是否存在由癌标志物基因表达的蛋白质和该表达程度的过程，针对所述基因的蛋白质利用特异性结合的抗体确认蛋白质的量。作为其分析方法，有蛋白质印迹法(Western Blotting)、酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、放射免疫测定法(Radioimmunoassay，RIA)、放射免疫扩散法(Radioimmunodiffusion)、奥克特洛尼(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭免疫电泳、免疫组织染色、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation Assay)、补体结合试验(Complement Fixation Assay)、FACS(荧光激活细胞分选)和蛋白质芯片(protein chip)等，但不限于此。

在本申请中，“特异性结合”指的是相比其他物质，对目标物质的结合力优异以至于能够通过结合而检测目标物质是否存在。

在本申请中，“抗体”指的是能够特异性结合至抗原或抗原决定基的、实质上由一个或多个免疫球蛋白基因或从其片段衍生或仿效其制备的基因编码的肽或多肽。在本申请中，抗体包括整个抗体或抗体片段，且包括不限于此的各种形式的抗体结构。抗体片段包括抗体的整体长度的一部分、抗体的可变区、或至少包括抗体的抗原结合部位。抗体片段的示例包括双价抗体(diabody)、单链抗体分子、以及从抗体片段形成的多特异性抗体。

在一个实施方式中，抗体可以为多克隆抗体或单克隆抗体。针对补体因子B蛋白的抗体可以通过本领域中通常实施的方法来制备，该方法诸如融合方法(Kohler和Milstein，European Journal of Immunology(欧洲免疫学杂志)，6：511-519(1976))、重组DNA方法(美国专利第4,816,56号)、或噬菌体抗体库方法(Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：58，1-597(1991))。在Harlow，E.和Lane，D.，Using Antibodies(抗体使用)：A Laboratory Manual(实验指南)，Cold Spring Harbor Press(冷泉港实验室出版社)，New York(纽约)，1999；Zola，H.，Monoclonal Antibodies(单克隆抗体)：A Manual of Techniques(技术指南)，CRC Press，Inc.(CRC出版公司)，Boca Raton(博卡拉顿)，Florida(佛罗里达)，1984；和Coligan，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(现代免疫学实验手册)，Wiley/Greene，NY(纽约)，1991中详细公开了针对抗体制备的一般过程。例如，生产单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备通过使永生细胞株与抗体生产淋巴细胞融合来实现，本领域的技术人员熟知在该过程中所需的技术并可以容易地实施该技术。通过将补体因子B蛋白质抗原注射到合适的动物中，从该动物收集抗血清，然后利用公知的亲和技术，从抗血清分离抗体，以获得多克隆抗体。

在本申请中，术语“敏感性”指当患有相应的疾病时其诊断检查结果显示阳性的概率，“特异性”是指在没有患任何疾病时检查结果为阴性的可能性。

作为用于胰腺癌诊断的标志物的候选物质，选择补体因子B蛋白，确认正常人和胰腺癌患者的血浆中补体因子B蛋白的存在并观测变化。其结果是，可以确认到相比正常对照组，在胰腺癌患者的血浆中补体因子B的蛋白表达水平非常高(实施方式1和实施方式2)。此外，当与作为现有已知的用于胰腺癌诊断的标志物的CA 19-9比较时，为了验证CFB作为用于胰腺癌诊断的标志物的效用，执行ELISA和受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线分析，基于这些曲线的最佳截止值，分别分析CFB和CA 19-9的敏感性和特异性(实施方式3至实施方式6)。从其结果可知，除了胰腺癌之外，在肝癌、胆管癌和胃癌中，CA 19-9的表达同样增加，因此特异性较差。也就是说，这意味着CA 19-9不适合单独用作胰腺癌诊断标志物。然而，CFB的特异性表达仅在胰腺癌中增加，敏感性和特异性优异，这意味着适合用作用于胰腺癌诊断的标志物。

此外，可知，在CA 19-9单独用作胰腺癌诊断标志物的情况下，具有特异性较差的问题，但是在将CA 19-9和CFB一起使用时，敏感性和特异性最优异。这意味着CA 19-9不适合单独用作用于胰腺癌诊断的标志物，但是在与CFB一起使用的情况下，可以更准确地诊断胰腺癌。

因此，在一个实施方式中，所述试剂盒还可以包括用于特异性结合至糖类抗原19-9的抗体。

本申请还提供胰腺癌诊断方法和提供用于诊断胰腺癌的信息的方法，其均包括测量从个体分离出的血液样品内的补体因子B和糖类抗原19-9的蛋白质表达水平。

在一个实施方式中，个体可以是胰腺癌疑似患者组。

在一个实施方式中，还可以包括如下步骤：将从胰腺癌疑似患者分离出的血液样品内的补体因子B和CA 19-9的蛋白质表达水平与正常对照组内的补体因子B和CA 19-9的蛋白质表达水平进行比较。比较两个样品后，在胰腺癌疑似患者的样品的补体因子B和CA 19-9的蛋白质表达水平都高于正常对照组的样品的补体因子B和CA 19-9的蛋白质表达水平的情况下，可以将所述疑似患者分类为胰腺癌患者。例如，在胰腺癌疑似患者的样品的补体因子B的蛋白质表达水平高于正常对照组样品的补体因子B的蛋白质表达水平两倍以上且胰腺癌疑似患者的样品的CA 19-9的浓度为37U/ml以上的情况下，可以将胰腺癌疑似患者分类为胰腺癌患者。

在一个实施方式中，血液样品可以是全血样品、血浆样品或血清样品。

本申请还提供胰腺癌诊断方法，其包括利用用于胰腺癌诊断的生物标志物来测量补体因子B和糖类抗原19-9的蛋白质表达水平，该胰腺癌诊断方法包括：

从个体收集血液样品的第一步骤；

使所述血液样品接触用于特异性结合至生物标志物且被可检测地标记的抗体，以形成所述抗体和所述生物标记物的复合体的第二步骤；

对不包括复合体的被标记的抗体和在所述第二步骤中形成的复合体进行分离的第三步骤；

对来自包括在所述第二步骤中形成的复合体的抗体的能够检测的标记的信号进行量化，以测量所述血液样品内的生物标志物的量的第四步骤；

将在所述第四步骤中测量的生物标志物的量和对照组的生物标志物的量进行比较的第五步骤；以及

当在所述第五步骤中，样品中的生物标志物的量多于对照组的生物标志物的量时，诊断为胰腺癌的第六步骤。

其中，生物标志物指的是补体因子B和糖类19-9。

在所述第四步骤中，由于来自生物标志物-抗体复合体的可检测的标记的信号与血液样品内的生物标志物的量成比例，因此从其可知所述生物标志物的量。

在一个实施方式中，对照组的生物标志物的量是没有患胰腺癌的个体的血液样品内的生物标志物的量。

在一个实施方式中，血液样品可以是全血样品、血浆样品或血清样品。

在一个实施方式中，在所述第一步骤和所述第二步骤之间还可以包括如下步骤：通过免疫沉淀使血液样品内的除生物标志物之外的蛋白质与生物标志物分离。

在一个实施方式中，使除生物标志物之外的蛋白质与生物标志物分离的步骤包括：

i)使从个体分离出的血液样品与用于特异性结合至生物标志物的抗体接触，以在所述抗体和所述生物标志物之间形成复合体的步骤；

ii)使在所述i)步骤中形成的复合体沉淀的步骤；

iii)对包括除生物标志物之外的其他蛋白质以及没有形成复合体的抗体的样品的上清液和沉淀的复合体进行分离的步骤。

本发明还提供胰腺癌治疗方法，其包括在根据上述方法诊断为胰腺癌的情况下，利用胰腺癌治疗剂对个体进行处理。胰腺癌治疗剂可以利用已知的具有胰腺癌治疗效果的药物，而没有限制。

有益效果

根据本申请，可以提供具有提高的敏感性和特异性的用于胰腺癌诊断的标志物。

附图说明

图1a示出针对正常人血浆的二维电泳图像，图1b示出针对胰腺癌患者的血浆的二维电泳图像。由箭头指示的点是指补体因子B蛋白。

图2示出在正常人血浆和胰腺癌患者的血浆中的补体因子B的表达差异，即示出了图1a和图1b的点(黑点)部分的二维垂直电泳图像。

图3a示出了通过蛋白质印迹法分析正常人血浆和胰腺癌患者血浆的补体因子B的蛋白质表达水平的结果(N：正常人，C：胰腺癌患者)。

图3b是示出图3a的蛋白质印记条带的强度的图。

图4a示出了通过蛋白质印迹法分析正常细胞株(HPDE)和胰腺癌细胞株(HPAC1、BXPC3、PANC1)中的补体因子B的蛋白质表达水平的结果。

图4b示出了通过RT(逆转录)-PCR(聚合酶链式反应)分析正常细胞株(HPDE)和胰腺癌细胞株(HPAC1、BXPC3、PANC1)中的补体因子B的蛋白质表达水平的结果。

图4c是示出图1b的谱带强度的图。

图5a是通过蛋白质印迹法分析补体因子B(CFB)的蛋白质表达水平的结果。HD表示正常，CP表示胰腺炎，PC表示胰腺癌。

图5b是示出图5a的蛋白质印记条带的强度的图。HD表示正常，CP表示胰腺炎，PC表示胰腺癌。

图6示出通过ELISA分析在各种癌中CFB和CA 19-9的表达水平的结果(a：CFB，b：CA 19-9)。HD表示正常，CP表示胰腺炎，PC表示胰腺癌，HCC表示肝癌，CC表示胆管癌，GC表示胃癌。

图7示出CA 19-9、CFB和CFB+CA 19-9的ROC曲线。

具体实施方式

以下通过实施方式详细说明本发明。下列实施方式仅用于例示本申请，本申请的范围不受限于下列实施方式。

[实施方式1]补体因子B(CFB)的蛋白质表达水平分析

[实施方式1-1]通过电泳和质谱法检测血浆中的CFB蛋白质

为了检测正常人和胰腺癌患者的血浆中CFB的存在和量，执行电泳和质谱法。

血浆从西富兰斯医院基因库和消化内科获得并遵照临床实验委员会(IRB)的规定。将血浆样品按200ul分配，在-70℃下保存至实验前并使用。补体因子B为分泌性蛋白，由于在血浆中存在已知的高丰度蛋白(high abundance proteins)，因此利用Hu-14(Agilent(安捷伦))去除除补体因子B之外的蛋白质，然后执行二维荧光电泳。为了执行二维电泳，针对10名正常人血浆和10名胰腺癌患者血浆的样品，在黑暗条件下利用作为荧光染料的400pmol(皮摩尔)的Cy3、Cy5、Cy2(GE Healthcare(通用医疗集团))对各分析样品和对应于其的标准样品50μg进行标记30分钟，利用1μL的10mM的赖氨酸使反应停止。使分别利用荧光染料标记的3个样品彼此混合后，添加样品缓冲溶液[6M尿素、2M硫脲、4％CHAPS(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)、60mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、30mM三羟甲基氨基甲烷(TRIS)；pH 8.5]，直到最终变成450ul，并与2％的IPG 4-7NL的缓冲溶液一起在常温下进行再水化16小时。利用Immobiline DryStrip pH 4-7NL(通用医疗集团)在MultiPhor II电泳系统(通用医疗集团)中升高至最佳条件的95000V而实施等电聚焦(Isoelectric Focusing，IEF)，并用三丁基膦缓冲溶液[6M尿素、2％硫酸盐(十二烷基硫酸钠，SDS)、30mM三羟甲基氨基甲烷、20％甘油(glycerol)、2.5％丙烯酰胺溶液(acrylamide solution)、5mM三丁基膦]进行一步还原和烷基化25分钟。

在图1a中示出针对正常人血浆的二维电泳结果，在图1b中示出针对胰腺癌患者的血浆的二维电泳结果。图中的箭头表示CFB。从其结果可知在胰腺癌患者中CFB表达增加。

此外，为了了解在正常人和胰腺癌患者的血浆中CFB的表达差异，执行二次垂直电泳。在二次垂直电泳中，利用Ettan Dalttwelve电泳系统(通用医疗集团)并使用9％至16％的聚丙烯酰胺凝胶以进行分离，在结束电泳后，利用Typhoon 9400(通用医疗集团)扫描仪以对应于Cy2、Cy3、Cy5的波长进行扫描。利用DeCyder 2-D分析软件(通用医疗集团)分析各凝胶图像。

从其结果可知，如同二维电泳结果，在胰腺癌患者中CFB表达同样增加(图2)。

在分析图像后，为了确认CFB的存在，针对由图1a和图1b中的箭头所指示的点执行质谱法。从利用考马斯蓝(Coomassie blue)染料染色的凝胶挑选(picking)蛋白质点，在进行褪色并利用胰蛋白酶进行消化后，使用Poros R2和Oligo R3树脂混合物对消化后形成的肽进行脱盐。利用Q-TOF(Agilent)分析蛋白质鉴定，利用MASCOT数据库对通过Q-TOF-MS获得的质谱进行鉴定。

从其结果可以确认到，如下表1所示，由图1a和图1b中的箭头所指示的点为CFB。

[表1]

[实施方式1-2]血浆内的CFB蛋白质表达水平分析

为了分析胰腺癌患者血浆中的CFB蛋白质表达水平，执行蛋白质印迹法。在10名正常人血浆和10名胰腺癌患者血浆中，利用抗体对相同量的蛋白质执行免疫印迹。利用10％SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)分析10μg血浆蛋白质后，为了执行蛋白质印迹法，将整个凝胶转换成硝化纤维(nitrocellulose，NC)膜后，利用包括5％脱脂乳的TBS-T(三乙醇胺缓冲盐水溶液-吐温)缓冲溶液[20mM三羟甲基氨基甲烷、137mM氯化钠、0.1％吐温20(Tween-20)，pH 7.6]阻断一小时。将抗-补体因子B抗体(CFB，Abcam(艾博抗公司))以1∶1000倍在包括5％的脱脂乳的TBS-T缓冲溶液中稀释并进行第一次处理，将抗-小鼠的IgG-HRP(Santa Cruz公司)以1∶10000倍进行第二次处理。利用ECL Plus蛋白质印迹试剂(通用医疗集团)使最终的NC膜反应1分钟，并利用Typhoon9400扫描器进行扫描并分析。

如图3a所示，从其结果可知，在胰腺癌患者组中CFB表达增加。

在将图3a的结果表示为通过谱带强度(band intensity)分析成倍比率(fold ratio)的结果时，确认到相比正常组，在胰腺癌患者中CFB的表达更高(图3b)。

[实施方式1-3]胰腺癌细胞内的CFB表达水平分析

为了分析胰腺癌细胞株中的CFB表达水平，执行蛋白质印迹法和RT-PCR。正常细胞株使用HPDE(人胰腺导管上皮细胞)，胰腺癌细胞株使用HPAC1(人胰腺腺泡上皮癌细胞)、BXPC3(人胰腺腺癌细胞)以及PANC1(人胰腺癌细胞)。使用1mg的各细胞裂解物(cell lysate)，使2ug抗-补体因子B抗体、10ul蛋白质G琼脂糖一起在1ml管中免疫沉淀2小时，然后通过蛋白质印迹法确认正常细胞和胰腺癌细胞内的CFB表达水平。从其结果确认到在正常细胞中没有检测到CFB，而仅在胰腺癌细胞中检测到CFB(图4a)。

接着，利用RT-PCR确认CFB的mRNA表达水平。使用easy-BLUE(iNtRON公司，Gyeonggi(京畿道)，韩国)提取总RNA，使用omniscript RT kit(Qiagen公司，Hilden(希尔登)，德国)合成cDNA。所使用的引物如下：

CFB引物(序列号2)：5′-CAACAGAAGCGGAAGATCGTC-3′(正向)

CFB引物(序列号3)：5′-TATCTCCAGGTCCCGCTTCTC-3′(反向)

GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)引物(序列号4)：

5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(正向)

GAPDH引物(序列号5)：5′-TCCACCACCCTGTFGCTGTA-3′(反向)

PCR条件为执行35个循环：在94℃下变性(denaturation)1分钟，在59℃下退火1分钟，在72℃下引物延伸(primer extension)1分钟。从其结果可以确认如同蛋白质印迹法数据，同样在正常细胞中几乎没有检测到CFB，且仅在胰腺癌细胞中检测到CFB(图4b)。将图1b的结果表示为通过谱带强度(band intensity)分析成倍比率的结果时，确认到相比正常细胞株，在胰腺癌细胞株中CFB的表达更高(图4c)。

[实施方式2]利用多个样品分析补体因子B(CFB)的蛋白质表达水平

为了了解CFB作为候选生物标志物的确切的可能性，使用独立的大规模患者群(large patient cohorts)进行附加的确认实验。

使用44名正常人、12名胰腺炎患者、40名胰腺癌患者的血浆，作为标准，正常人血浆使用混合(pooling)的样品，通过与实施方式1-3相同的方法，执行蛋白质印迹法，从其结果可以确认到，相比于HD和CP，在PC中CFB的表达更高(图5a)。以点示出该蛋白质印迹条带的强度的结果显示，以p＜0.05相比于HD和CP在PC中CFB的表达更高(图5b)。因此，在使用大规模患者群进行独立实验时，也能够确认到在PC中的CFB的表达(以显著的值)高于HD和CP中的CFB的表达约两倍。

[实施方式3]通过ELISA分析各种癌患者中CFB和CA 19-9的蛋白质表达水平

为了比较当前被称为胰腺癌生物标志物的CA 19-9和CFB的表达水平，使用HD、CP、PC、HCC、CC、GC的血浆执行ELISA测试。CFB和CA 19-9ELISA试剂盒分别使用USCN公司产品和Panomics公司产品，针对每个产品，根据各自的实验方法(protocol)进行实验。

首先，针对CFB ELISA，将各个血浆以1∶10000稀释后，在铺放有针对CFB的抗体的孔中分别加入100ul稀释后的血浆。在常温下培养2小时。此后，从孔中去除血浆，并加入100ul的检测试剂A工作液(working solution)，然后在常温下培养1小时。1小时后，从孔中去除溶液，然后加入350ul的洗涤溶液，反复进行3次洗涤。此后，将100ul的检测试剂B工作液加入各个孔中，在常温下反应30分钟。利用洗涤溶液洗涤5次。此后，在各个孔中加入90ul的底物溶液(substrate solution)，在黑暗条件下反应15分钟，然后加入50ul的停止液(stop solution)，然后使用酶标仪在450mm下测量。在该组中CFB的表达水平示出为34.0(范围：26.1-41.3)、73.5(范围：62.3-77.1)、92.0(范围：75.2-121.6)、37.0(范围：28.8-47.5)、41.5(范围：29.1-52.1)、63.0(范围：56.3-72.9)ng/ml(图6a)。

针对CA 19-9ELISA，在铺放有CA 19-9抗体的孔板中分别加入10ul的各个血浆，并在其上加入100ul CA 19-9检测缓冲液(assay buffer)。然后在充分混合30秒后在常温下培养90分钟。此后，从孔中去除缓冲液，使用洗涤缓冲液反复洗涤四次。然后，在各个孔中加入100ul工作结合试剂(working conjugate reagent)，在充分混合30秒后在常温下培养90分钟。从孔中去除试剂，使用洗涤缓冲液反复洗涤四次。然后，在各个孔中加入TMB(四甲基联苯胺)，在混合10秒后，在黑暗环境下反应20分钟。然后，在加入100ul的停止液(stop solution)后混合30秒，然后使用酶标仪在450mm下测量。在该组中CA 19-9的水平分别示出为4.6(范围：2.8-7.2)、10.2(范围：6.0-21.4)、298.8(范围：111.4-832.6)、50.5(范围：18.1-159.5)、137.5(范围：53.8-537.9)、10.0(范围：9.4-16.7)U/ml(图6b)。发现如同CA 19-9，相比非PC组(HD、CP、HCC、CC、GC)，在PC组中血浆内的CFB表达水平同样尤其高(p＜0.002)。此外，示出了，在CFB的情况下，与CA 19-9相比，更好地区分PC患者和非PC患者(p＜0.0001)。

这意味着，不适合将CA 19-9单独用作胰腺癌诊断标志物，相反，适合将仅在胰腺癌中特异性表达增加的CFB用作胰腺癌诊断标志物。

[实施方式4]在胰腺癌诊断中通过ROC曲线分析CFB和CA 19-9的敏感性和特异性

为了确认CFB和CA 19-9区分胰腺癌患者和非胰腺癌患者(HD、CP、HCC、CC、GC)的程度，利用曼-怀氏等级和检验(Mann-Whitney rank sum test)程序执行ROC曲线分析。通过AUC(曲线下面积)值比较CFB和CA 19-9。其结果是，CFB的AUC值为0.958(95％CI(置信区间)：0.956-0.959)，相比CA19-9的AUC值0.833(95％CI：0.829-0.837)，CFB的AUC值更高。当组合CFB和CA 19-9时，AUC值为0.986(0.985-0.986)，相比单独使用CFB和CA19-9(p＜0.01)时的AUC值，示出相当高的AUC值(图7)。

这意味着通过单独的CFB或CFB和CA 19-9的组合可以诊断胰腺癌。

[实施方式5]CFB和CA 19-9基于最佳截止值的胰腺癌诊断

按各个组(HD：正常，CP：胰腺炎，PC：胰腺癌，HCC：肝癌，CC：胆管癌，GC；胃癌)确认CFB和CA 19-9的诊断效率。如下表2所示，其结果是CA 19-9和CFB在PC中示出近似的诊断效率(CA 19-9：80.5％，CFB：73.2％)。然而，在CA 19-9的情况下，在其他癌(HCC、CC、GC)中也示出高的诊断效率(HCC：61.3％，CC：77.2％，GC：17.1％)，相反，CFB在其他癌中示出低的诊断效率(HCC：0％，CC：0％，GC：8.6％)。这意味着与其他癌相比，针对PC，CFB比CA 19-9更具有特异性。

[表2]

[实施方式6]CFB和CA 19-9的敏感性和特异性确认

为了评估CFB、CA 19-9和CFB+CA 19-9作为胰腺癌诊断指标的准确性，根据通过最大约登指数(maximum Youden index)预测的最佳截止值，确认与其他疾病相比的CA 19-9、CFB和CFB+CA 19-9的胰腺癌诊断的敏感性和特异性(％)。其结果是，如下表3所示，将PC和其他组(HD、CP、HCC、CC、GC)比较时，CA 19-9的敏感性是80.4％，特异性是70.0％，CFB的敏感性是73.1％，特异性是97.9％。而且，在将CFB和CA 19-9组合时，敏感性是90.1％，特异性是97.2％。这意味着，相比单独使用CA 19-9和CFB的情况，将CA 19-9和CFB组合时，示出更好的诊断效率。

[表3]