高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液及活性测定方法

摘要

一种高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液及活性测定方法，其中缓冲液的缓冲成分包括:三羟甲基氨基甲烷 10～200mM，氯化钠0～20mM，CHAPS 0～1mM，半乳糖 0～20mM，体积分数为10～40%的甘油；缓冲液的PH值为8.0～9.0。本发明的缓冲液能够在寨卡病毒的酶活检测过程中提高蛋白酶的活性，进而使应用该缓冲液的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定方法所得结果更加准确，从而对寨卡病毒的蛋白酶活性抑制剂筛选起到引导作用，进而推动寨卡病毒的针对性药物研发进程。

说明书

技术领域

本发明涉及药物的技术领域，具体说是一种高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液及活性测定方法。

背景技术

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属黄病毒科(Fla.viviridae)，黄病毒属(Flavivirus)，呈球形，直径约为40—70 nm，有包膜。黄热病病毒属于黄热病科黄热病毒属的病毒，为RNA病毒，具有嗜内脏性及嗜神经性，在室温下容易死基因组为单股正链RNA，长度约为10.8Kb。基因组包含一个开放阅读框(ORF)，编码一个多聚蛋白。

寨卡病毒最早于1947年从乌干达森林中的猕猴身上分离出来。1952年首次从人体分离出来。截至上世纪末，寨卡病毒感染被认为仅在赤周围的非洲、美洲、亚洲和太平洋地区散发，被证实的人类感染病例仅14例。该病毒自2007年开始出现暴发流行。2015年底至2016年初，美洲出现寨卡疫情，并通过旅游者输入到其他国家。截至2016年2月，美洲、非洲、亚洲等地已有超过30个国家出现寨卡病毒传播。虽然寨卡病毒感染者大部分症状较轻微，通常在发病3—7天后可自行痊愈，但医学界普遍认为这种快速传播的病毒可能与异常增多的新生儿小头畸形有关联。2016年2月1日，世界卫生组织召开紧急会议，宣布寨卡病毒的暴发和传播已经构成全球突发公共卫生事件。之后越来越多的证据显示寨卡病毒感染和胎儿畸形以及神经系统疾病之间存在因果关系。

因此测出寨卡病毒表达的蛋白酶的活性并筛选出好的活性抑制剂对杀死这种病毒的传播起着至关重要的作用。现有技术中测定寨卡病毒NS2B-NS3的活性方法，通常为荧光共振能量转移法，如何提高测量的灵敏度以及更加直观的呈现出实验的结果，为该酶活测定方法中最需改进的部分。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液及活性测定方法。

本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液，缓冲成分包括:三羟甲基氨基甲烷 10～100mM，氯化钠0～20mM，CHAPS 0～1mM，半乳糖 0～20mM，体积分数为10～40%的甘油；缓冲液的PH值为8.0～9.0。

本发明还可以采用以下技术措施：

三羟甲基氨基甲烷 10～20mM，氯化钠0～5mM，CHAPS 0～1mM，半乳糖 0～20mM，体积分数为10～20%的甘油；缓冲液的PH值为8.5～9.0。

缓冲液的缓冲成分为:三羟甲基氨基甲烷 10mM，CHAPS 1mM，半乳糖 20mM，体积分数为20%的甘油；缓冲液的PH值为9.0。

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定方法，包括以下步骤：

A、将含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的载体pMV转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素；

B、从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV载体，并将含有目的基因的pMV载体和目标载体pET-duet-1双酶切用琼脂糖凝胶回收，之后将酶切回收的基因片段和目标载体片段按照摩尔比5:1至10:1的比率混合在16℃下连接10到18h；

C、将构建好的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素,将筛选得到的阳性克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取构建好的质粒，用于鉴定和测序，测序结果显示可用；

D、将得到的含有编码寨卡病毒的非结构蛋白酶基因的pET-duet-1载体转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞，并用LB平板筛选阳性克隆；

E、将D中所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素和氯霉素，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入IPTG并于16℃培养16-18个小时；

F、以5000rpm离心15 min收集细胞，然后高压破菌5-6次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；

G、将上清液加入悬菌溶液预平衡的镍柱中，该悬菌溶液为20mM Tris，PH 8.5， 300mMNacl，20mM咪唑，挂柱1个小时；

H、用破菌缓冲液清洗杂蛋白，该破菌缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来，至G250检测不变蓝，洗脱缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、将步骤H得到的寨卡病毒的非结构蛋白酶再用HiTrap Q 阴离子交换层析和superdex75 10/300 凝胶过滤层析进行纯化，得到寨卡病毒的非结构蛋白酶部分；

J、寨卡病毒的非结构蛋白酶的活性测定采用纯度大于95%的荧光底物AC-LKRR-AMC完成；

K、荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent荧光仪,激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；

L、蛋白浓度为100nM,荧光底物浓度为100μM，数据处理使用GraphPad Prism 软件处理；

M、选用权利要求1、2或3中所述的缓冲液；利用缓冲液将蛋白浓度稀释到终浓度100nM,向96孔酶活板加入90μL的蛋白，在37℃下孵育10min，向其中加入10μL的发光底物，摇动25s，读取数据。

上述寨卡病毒的非结构蛋白酶为NS2B-NS3。

本发明具有的优点和积极效果是:

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液能够在寨卡病毒的酶活检测过程中提高蛋白酶的活性，进而使应用该缓冲液的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定方法所得结果更加准确，从而对寨卡病毒的蛋白酶活性抑制剂筛选起到引导作用，进而推动寨卡病毒的针对性药物研发进程。

附图说明

图1是本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液中的CHAPS对蛋白和底物反应的示意图；

图2是本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液中的甘油对蛋白酶活性的作用示意图；

图3是本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液的PH值对蛋白酶活性的作用示意图；

图4是本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液中的氯化钠对蛋白酶活性的作用示意图；

图5是本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液中的三羟甲基氨基甲烷对蛋白酶活性的作用示意图；

图6是本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液中的半乳糖对蛋白酶活性的作用示意图。

具体实施方式

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液，缓冲成分包括:三羟甲基氨基甲烷 10～100mM，氯化钠0～20mM，CHAPS 0～1mM，半乳糖 0～20mM，体积分数为10～40%的甘油；缓冲液的PH值为8.0～9.0。

实施例一：

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液，缓冲成分包括:三羟甲基氨基甲烷 100mM，氯化钠20mM，体积分数为10%的甘油；缓冲液的PH值为8.0。

该缓冲液具有提高寨卡病毒非结构蛋白酶活性的作用。

实施例二：

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液，缓冲成分包括:三羟甲基氨基甲烷 50mM，氯化钠10mM，CHAPS 0.5mM，半乳糖 10mM，体积分数为40%的甘油；缓冲液的PH值为8.5。

该缓冲液具有提高寨卡病毒非结构蛋白酶活性的作用。

实施例三：

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液，缓冲成分包括:三羟甲基氨基甲烷 20mM，氯化钠5mM，CHAPS 1mM，半乳糖 20mM，体积分数为15%的甘油；缓冲液的PH值为8.7。

该缓冲液具有提高寨卡病毒非结构蛋白酶活性的作用。

实施例四：

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液，缓冲成分包括:三羟甲基氨基甲烷 15mM，氯化钠2M，CHAPS 0.6mM，半乳糖 15mM，体积分数为20%的甘油；缓冲液的PH值为9.0。

该缓冲液具有提高寨卡病毒非结构蛋白酶活性的作用。

实施例五：

如图1至图6中所示的各组分在不同配比及缓冲液在不同PH值下对非结构蛋白酶活性的作用示意图，图中的纵坐标为蛋白酶的活性，横坐标为时间。图1中自上而下的1mMCHAPS和0mMCHAPS之间的图像的对比能够明确得出通过提高CHAPS能够提高蛋白酶和底物的亲和力；图2中自上而下的甘油浓度为40mM、30mM、20mM和10mM，可见随着浓度的升高蛋白活性是升高的；图3中自上而下三种不同PH值PH=9.0、8.5和8.0的环境中，当PH=9.0时寨卡病毒非结构蛋白酶活性最高；图4中自上而下三种氯化钠浓度分别为5mM、10mM和20mM，可见浓度越高蛋白酶的活性越低；图5中自上而下所示10mM、20mM、50mM、100mM和200mM五种不同浓度的三羟甲基氨基甲烷，三羟甲基氨基甲烷的浓度越高蛋白酶的活性越低；图6中自上而下所示20mM和0mM两种浓度的半乳糖，可见半乳糖能够提高蛋白酶和底物的亲和力。

优选地，本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定缓冲液，缓冲成分包括:缓冲液的缓冲成分为:三羟甲基氨基甲烷 10mM，CHAPS 1mM，半乳糖 20mM，体积分数为40%的甘油；缓冲液的PH值为9.0。

本实施例中的缓冲液提升蛋白酶活性的效果最佳。

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定方法一，包括以下步骤：

A、将含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的载体pMV转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素；

B、从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV载体，并将含有目的基因的pMV载体和目标载体pET-duet-1双酶切用琼脂糖凝胶回收，之后将酶切回收的基因片段和目标载体片段按照摩尔比5:1的比率混合在16℃下连接10h，其中目标载体为Novagene公司产品；

C、将构建好的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素,将筛选得到的阳性克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取构建好的质粒，用于鉴定和测序，测序结果显示可用；

D、将得到的含有编码寨卡病毒的非结构蛋白酶基因的pET-duet-1载体转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞，并用LB平板筛选阳性克隆；

E、将D中所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素和氯霉素，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入IPTG并于16℃培养16h；

F、以5000 rpm离心15 min收集细胞，然后高压破菌5次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；

G、将上清液加入悬菌溶液预平衡的镍柱中，该悬菌溶液为20mM Tris，PH 8.5， 300mMNacl，20mM咪唑，挂柱1个小时；

H、用破菌缓冲液清洗杂蛋白，该破菌缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300 mMNacl，20mM咪唑，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来，至G250检测不变蓝，洗脱缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、将步骤H得到的寨卡病毒的非结构蛋白酶NS2B-NS3再用HiTrap Q 阴离子交换层析和superdex75 10/300 凝胶过滤层析进行纯化，得到寨卡病毒的非结构蛋白酶NS2B-NS3部分；

J、寨卡病毒的非结构蛋白酶NS2B-NS3的活性测定采用纯度大于95%的荧光底物AC-LKRR-AMC完成；

K、荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent荧光仪,激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；

L、蛋白浓度为100 nM,荧光底物浓度为100μM，数据处理使用GraphPad Prism 软件处理；

M、利用本发明的缓冲液将蛋白浓度稀释到终浓度100 nM,向96孔酶活板加入90μL的蛋白，在37℃下孵育10min，向其中加入10μL的发光底物，摇动25s，读取数据。

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定方法二，包括以下步骤：

A、将含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的载体pMV转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素；

B、从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV载体，并将含有目的基因的pMV载体和目标载体pET-duet-1双酶切用琼脂糖凝胶回收，之后将酶切回收的基因片段和目标载体片段按照摩尔比10:1的比率混合在16℃下连接18h；

C、将构建好的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素,将筛选得到的阳性克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取构建好的质粒，用于鉴定和测序，测序结果显示可用；

D、将得到的含有编码寨卡病毒的非结构蛋白酶基因的pET-duet-1载体转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞，并用LB平板筛选阳性克隆；

E、将D中所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素和氯霉素，当OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG并于16℃培养18个小时；

F、以5000 rpm离心15 min收集细胞，然后高压破菌6次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；

G、将上清液加入悬菌溶液预平衡的镍柱中，该悬菌溶液为20mM Tris，PH 8.5，300mMNacl，20mM咪唑，挂柱1个小时；

H、用破菌缓冲液清洗杂蛋白，该破菌缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，20mM咪唑，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来，至G250检测不变蓝，洗脱缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、将步骤H得到的寨卡病毒的非结构蛋白酶NS2B-NS3再用HiTrap Q 阴离子交换层析和superdex75 10/300 凝胶过滤层析进行纯化，得到寨卡病毒的非结构蛋白酶NS2B-NS3部分；

J、寨卡病毒的非结构蛋白酶NS2B-NS3的活性测定采用纯度大于95%的荧光底物AC-LKRR-AMC完成；

K、荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent荧光仪,激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；

L、蛋白浓度为100 nM,荧光底物浓度为100μM，数据处理使用GraphPad Prism 软件处理；

M、利用缓冲液将蛋白浓度稀释到终浓度100 nM,向96孔酶活板加入90μL的蛋白，在37℃下孵育10min，向其中加入10μL的发光底物，摇动25s，读取数据。

本发明的高通量寨卡病毒非结构蛋白酶的活性测定方法三，包括以下步骤：

A、将含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的载体pMV转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素；

B、从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV载体，并将含有目的基因的pMV载体和目标载体pET-duet-1双酶切用琼脂糖凝胶回收，之后将酶切回收的基因片段和目标载体片段按照摩尔比8:1的比率混合在16℃下连接16h；

C、将构建好的片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板上培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素,将筛选得到的阳性克隆，分别接种于装有5mL的LB培养基的试管培养过夜，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素，然后用质粒小提试剂盒提取构建好的质粒，用于鉴定和测序，测序结果显示可用；

D、将得到的含有编码寨卡病毒的非结构蛋白酶基因的pET-duet-1载体转化到大肠杆菌rosetta(DE3)感受态细胞，并用LB平板筛选阳性克隆；

E、将D中所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基，LB培养基中含100mg/L氨苄青霉素和氯霉素，当OD₆₀₀达到0.7时，加入IPTG并于16℃培养17h；

F、以5000 rpm离心15 min收集细胞，然后高压破菌6次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；

G、将上清液加入悬菌溶液预平衡的镍柱中，该悬菌溶液为20mM Tris，PH 8.5， 300mMNacl，20mM咪唑，挂柱1个小时；

H、用破菌缓冲液清洗杂蛋白，该破菌缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300 mMNacl，20mM咪唑，然后用洗脱缓冲液将目的蛋白洗下来，至G250检测不变蓝，洗脱缓冲液为20mM Tris，PH8.5，300mM Nacl，500mM咪唑；

I、将步骤H得到的寨卡病毒的非结构蛋白酶NS2B-NS3再用HiTrap Q 阴离子交换层析和superdex75 10/300 凝胶过滤层析进行纯化，得到寨卡病毒的非结构蛋白酶NS2B-NS3部分；

J、寨卡病毒的非结构蛋白酶NS2B-NS3的活性测定采用纯度大于95%的荧光底物AC-LKRR-AMC完成；

K、荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent荧光仪,激发光和发射光的波长分别为355nm和460nm；

L、蛋白浓度为100 nM,荧光底物浓度为100μM，数据处理使用GraphPad Prism 软件处理；

M、利用缓冲液将蛋白浓度稀释到终浓度100 nM,向96孔酶活板加入90μL的蛋白，在37℃下孵育10min，向其中加入10μL的发光底物，摇动25s，读取数据。

其中质粒小提试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的TIANprep产品。

荧光底物AC-LKRR-AMC为上海吉尔生化有限公司的产品。

Fluoraskan Ascent荧光仪为美国Thermo Scientific的产品。

目标载体pET-duet-1为Novagene公司产品。

应当注意，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，如果在文中没有特别说明，则本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

本文中所涉及的各种实验用品（包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等）之中，对于那些特殊的或者不宜获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本发明申请日之前，可以通过各种方式（例如购买、自行制备等）很方便地获得。在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。