4对EST‑SSR引物和制备方法及其在樱属植物指纹图谱构建中的应用

摘要

本发明公开了4对EST–SSR引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示；选择樱属植物EST序列进行SSR引物的设计并利用樱属植物材料进行SSR引物的筛选；能够应用于樱属植物指纹图谱的构建；根据SSR扩增结果可以快速、准确地将中国野生樱属植物区分开来，并正确反映其间的亲缘关系，可用于我国野生樱属植物的遗传多样性分析、种质鉴定、物种鉴别与保护等方面。

说明书

技术领域

本发明涉及EST-SSR引物、制备方法，具体涉及4对EST-SSR引物和其制备方法及在樱属植物指纹图谱构建中的应用。

背景技术

据《Flora of China》记载全世界约有樱花150种，而中国约有48个种及8个变种，远超日本、朝鲜、台湾及其它国家和地区，尤以野生资源较为丰富，但我国从古至今都只重视食用樱桃的栽培，对于观赏类樱花品种的培育不多，远落后于日本。然而目前对樱花的开发和利用却以日本最为成功，而我国对樱花的研究尚处于起步阶段，很多野生资源还未得到充分的开发和利用，缺乏自主品种培育。目前国内观赏类樱花大多从日本引种，但适应性不强，寿命短，而且还容易感染病虫害，因此亟需培育出适应性和抗性较强的自主樱花品种。

目前各类分子标记已广泛应用于李属植物相关研究。如张俊卫等利用RAPD分子生物学技术来分析桃、李、杏、梅、樱花类植物分类，其研究结果支持将它们分成不同的属；蔡宇良利用RAPD分子技术分别对我国野生樱桃居群和欧洲樱桃品种进行了遗传多样性分析和DNA指纹鉴定；周春玲等利用RAPD技术对19个樱花品种进行了品种分类和亲缘关系鉴定；Downey等用甜樱桃和酸樱桃的引物对66个黑樱桃基因型作指纹分析；Cantini等用桃、甜樱桃和酸樱桃的10对SSR引物绘制了59份四倍体酸樱桃种质资源指纹图谱；张琪静等利用SSR分子技术对相关樱桃品种进行了遗传多样性分析，并开发了甜樱桃的指纹检索系统；李苗苗利用cpSSR与ISSR分子标记技术分别对我国樱属植物和中国樱桃进行了地理亲缘关系以及遗传结构和多样性的研究；2013年南京林业大学张琼硕士撰写的硕士论文《樱属观赏品种资源调查及部分种与品种SSR分析》对我国的部分樱属植物和樱花品种进行了相关分子研究，探讨了彼此间的亲缘关系。

其中SSR分子标记具有多态性高、重复性好、共显性遗传、技术简单和特异性强等优点，已应用于物种鉴定、物种分类系统比较以及作为构建遗传图谱的重要工具，此外还作为一种重要的辅助育种手段。EST–SSR标记是编码序列的一部分，能够作为某些性状或者基因的直接标记，随着EST数据库的不断丰富，利用EST序列开发SSR标记已成为一种简便而有效的方法。本发明以部分中国野生樱花为试验材料，利用NCBI中丰富的樱属植物EST序列，设计EST–SSR引物用于我国野生樱属植物指纹图谱的构建，以利于我国樱属植物的物种分类、资源保护以及杂交全本的选择等。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：4对EST–SSR引物，其序列如下所示(序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列)：

PC1：F:CACACACACCTTCTCTCTCCTG

R:GTTGTTATTGGTCTTGCTGCTG

PC10：F:GGCACAAAAGAGAGGAACTTGT

R:AGGGTTACAGCCTCAATACCAA

PC12：F:ATATGGGCTGCGTTTATATTGG

R:GATTGCACATGCCTTTGTCTTA

PC17：F:AATTTGCAGAGATGGCTTCC

R:CTTCTCCTTGGCTTCTTTTGTC

本发明还提供一种上述4对引物的开发方法，包括如下步骤：

(1)基因组DNA提取

由于樱属植物叶片中多糖、多酚含量较多，传统方法难以提取高质量的基因组DNA，采用植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)按照其说明书进行樱属植物DNA的提取，提取完成后利用Bio-Photometr核酸检测仪检测DNA的浓度和纯度，之后再依据所得的DNA浓度，用预热的TE溶液将DNA样品溶液稀释成50ng·μL^-1作为DNA模板，-20℃保存备用；

(2)序列来源

登录NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)，在搜索栏中输入Cerasus(樱属)，搜索EST序列，随机选择其中部分EST序列进行后续的SSR位点查找及其引物设计；

(3)SSR位点查找

在线搜索软件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)对选择的EST序列进行SSR位点搜索(http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool)，搜索标准为：二、三、四、五和六核苷酸的最小重复次数分别为10、6、5、4、3次，EST序列长度大于100bp，SSR起始点位置距离5'和3'应不小于20bp；

(4)SSR引物设计

用Primer5.0和Oligo7软件进行引物设计和评价，设计引物时设置的主要参数为：GC含量40％～70％，退火温度50～62℃，引物长18～24bp，上下游引物Tm值之差应在1℃范围之内，预期扩增产物长度100～500bp；共设计出合格的SSR引物有20对，引物命名为PC加序号，如PC1；

(5)EST-SSR引物初步筛选

将20对通过评估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成。引物最适复性温度的筛选于Eppendorf公司生产的Mastercycler普通梯度PCR仪上进行；PCR反应体系为20μL，其中包括：10μL的2×TaqPCRMasterMix(含有Taq酶、dNTP和优化的反应缓冲液)，0.4μL的模板DNA，0.8μL的引物对(5μmol·μL^-1)×2，8μL的ddH₂O；反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，复性(48-64℃)30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min，4℃保存；随机选择8种野生樱属植物用于引物以及最适退火温度的筛选，各引物对的最适退火温度通过梯度PCR试验确定；最终通过琼脂糖凝胶电泳筛选出有目标条带的引物16对；

(6)EST-SSR引物进一步筛选

(6.1)PCR扩增

在最适退火温度下，对樱属植物材料进行PCR扩增，2×TaqPCRMasterMix购自天根生物公司，PCR反应体系为20μL，其中包括：10μL的2×TaqPCRMasterMix(含有Taq酶、dNTP和优化的反应缓冲液)，0.4μL的模板DNA(50ng·μL^-1)，0.8μL的引物对(5μmol·μL^-1)×2，8μL的ddH₂O；反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，复性(48-64℃)30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(6.2)聚丙烯酰氨凝胶电泳

步骤(6.1)的扩增产物采用6％的聚丙烯酰胺凝胶(60mL的ddH₂O中含有27g尿素、6mL>

本发明还涉及一种上述4对EST-SSR引物在樱属植物指纹谱图构建中的应用。

本发明的有益效果和优点：

1.在分子标记技术中，SSR分子标记与RAPD等其他分子标记相比，具有多态性高、重复性好、共显性遗传、技术简单和特异性强等优点，其中EST–SSR标记是编码序列的一部分，能够作为某些性状或者基因的直接标记，EST-SSR扩增结果比gSSR更稳定，能降低条带判读的难度，同时也更能反映出个体或群体的遗传变异；

2.本发明的4对EST-SSR引物可以快速、准确地将中国野生樱属植物区分开来，并正确反映其间的亲缘关系，可用于我国野生樱属植物的遗传多样性分析、种质鉴定、物种鉴别与保护等方面。

附图说明

图1 PC1、PC10、PC12和PC17等4对核心引物在24份供试材料中的扩增；

图2基于SSR扩增结果构建的24份供试材料的UPGMA聚类图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。实施例

试验材料

采集野生樱属植物原种(变种)30余种，本试验选取其中24个原种(变种)用于EST–SSR引物的筛选，如下表所示：

试验步骤

(1)基因组DNA提取

由于樱属植物叶片中多糖、多酚含量较多，传统方法难以提取高质量的基因组DNA，采用植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒(上海莱枫生物科技有限公司)进行樱属植物DNA的提取，具体步骤见说明书，提取完成后利用Bio-Photometr核酸检测仪检测DNA的浓度和纯度，之后再依据所得的DNA浓度，用预热的TE溶液将DNA样品溶液稀释成50ng·uL^-1。-20℃保存备用。

(2)序列来源

登录NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)，在搜索栏中输入Cerasus(樱属)，得到111850条EST序列(截止到2015年9月15日)，随机选择其中部分EST序列进行后续的SSR位点查找及其引物设计；

(3)SSR位点查找

在线搜索软件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)对该部分EST序列进行SSR位点搜索(http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool)，搜索标准为：二、三、四、五和六核苷酸的最小重复次数分别为10、6、5、4、3次，EST序列长度大于100bp，SSR起始点位置距离5'和3'应不小于20bp；

(4)SSR引物设计

用Primer5.0和Oligo7软件进行引物设计和评价，设计引物时设置的主要参数为：GC含量40％～70％，退火温度50～62℃，引物长18～24bp，上下游引物Tm值之差应在1℃范围之内，预期扩增产物长度100～500bp；共设计出合格的SSR引物有20对，引物命名为PC加序号，如PC1；

(5)EST-SSR引物筛选

将20对通过评估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成。引物最适复性温度的筛选于Eppendorf公司生产的Mastercycler普通梯度PCR仪上进行；PCR反应体系为20μL，其中包括：10μL的2×TaqPCRMasterMix(含有Taq酶、dNTP和优化的反应缓冲液)，0.4μL的模板DNA(即步骤(1)获得用TE稀释成50ng·μL^-1的DNA样品溶液)，0.8μL的引物对(5μmol·μL^-1)×2，8μL的ddH2O；反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，复性(48-64℃)30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min，4℃保存；随机选择8种野生樱属植物用于引物以及最适退火温度的筛选，各引物对的最适退火温度通过梯度PCR试验确定；最终通过琼脂糖凝胶电泳筛选出有目标条带的引物16对；

(6)EST-SSR引物进一步筛选

(6.1)PCR扩增

在最适退火温度下，对24份樱属植物材料进行PCR扩增，2×TaqPCRMasterMix购自天根生物公司，PCR反应体系为20μL，其中包括：10μL的2×TaqPCRMasterMix(含有Taq酶、dNTP和优化的反应缓冲液)，0.4μL的模板DNA(50ng·μL^-1)，0.8μL的引物对(5μmol·μL^-1)×2，8μL的ddH2O。反应程序为94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，复性(48—64℃)30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(6.2)聚丙烯酰氨凝胶电泳

步骤(6.1)的扩增产物采用6％的聚丙烯酰胺凝胶(60mL的ddH₂O中含有27g尿素、6mL>

[1]制备6％聚丙烯酰胺变性凝胶；

[2]灌胶：轻轻灌凝胶液，防止出现气泡；聚合时间lh以上；

[3]预电泳：恒功率预电泳30min，温度达到43℃左右；

[4]样品变性：20μL PCR样品加入8μL 3×LoadingBuffer[98％甲酰胺，0.5MEDTA(pH8.0)，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青]，混匀后，在95℃变性5min，立即放至冰上10min以上；

[5]加样和电泳：吸打加样槽，清除残胶、尿素和气泡，每一个加样孔点入5μL样品；40W恒功率电泳约1.0～2.0h；电泳结束后，小心分开两块玻璃板；

[6]银染程序：

固定：将凝胶板置于lL乙酸溶液(10％)中，轻轻摇荡5-6min。

漂洗：用1.5L双蒸水漂洗2-3min。

染色：在1.5L新配的染色液中(l.5g硝酸银)，轻轻摇荡15min。

漂洗：用1.5L双蒸水漂洗，时间不超过10秒。

显影：在1.5L显影液中(显影液含氢氧化钠22.5g，37％甲醛12mL)轻轻摇荡，直至出现带纹。

定影：在1.5L10％乙酸溶液中定影2-3min。

漂洗：用1.5L双蒸水漂洗2-3min。

干胶：室温下自然晾干。

最终从16对引物中选择出多态性高、普带清晰的引物4对，其核苷酸序列如下所示：

PC1：F:CACACACACCTTCTCTCTCCTG

R:GTTGTTATTGGTCTTGCTGCTG

PC10：F:GGCACAAAAGAGAGGAACTTGT

R:AGGGTTACAGCCTCAATACCAA

PC12：F:ATATGGGCTGCGTTTATATTGG

R:GATTGCACATGCCTTTGTCTTA

PC17：F:AATTTGCAGAGATGGCTTCC

R:CTTCTCCTTGGCTTCTTTTGTC

(7)聚类分析

根据SSR扩增结果(图1)，利用NTSYSpc2.10e软件进行Jaccard相似性系数分析，计算出它们之间的遗传相似系数，再由遗传相似系数，进行UPGMA聚类分析，构建了24份樱属植物的遗传关系图(图2)，由图2可知，该4对EST-SSR引物(PC1、PC10、PC12和PC17)基本可将24份中国野生樱属植物区分开来，也基本能够正确反映绝大部分材料之间的亲缘关系，因此该4对引物可作为中国野生樱属植物的核心EST-SSR引物组合予以使用(可适当结合前人的一些gSSR引物，二者搭配使用，效果更好)，可用于我国野生樱属植物的遗传多样性分析、种质鉴定、物种鉴别与保护等方面。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁波城市职业技术学院

<120> 4对EST-SSR引物和制备方法及其在樱属植物指纹图谱构建中的应用

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacacacacc ttctctctcc tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttgttattg gtcttgctgc tg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcacaaaag agaggaactt gt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agggttacag cctcaatacc aa 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atatgggctg cgtttatatt gg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gattgcacat gcctttgtct ta 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aatttgcaga gatggcttcc 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cttctccttg gcttcttttg tc 22