基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的SPR传感器及其制备方法和应用

摘要

本发明属于毒素检测技术领域，公开了基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的SPR传感器及其制备方法和应用。该SPR传感器包括玻璃芯片、微囊藻毒素适配体、DNA探针1、DNA探针2和贵金属纳米材料，能够通过测定SPR信号变化进行微囊藻毒素的检测。本发明SPR传感器制备方法简单，检测速度快、选择性高、稳定性好、适用范围宽、操作简单，易于构建野外监测便携检测仪器，而且成本远低于大型的分析检测仪器。

说明书

技术领域

本发明属于毒素检测技术领域，具体涉及基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的表面等离子体(SPR)传感器及其制备方法和应用。

背景技术

微囊藻毒素(MCs)是有害蓝藻水华释放的一类环状七肽类肝毒素，具有强烈的致癌作用，是诱发肝癌、肠胃炎等疾病的重要环境因素。鉴于微囊藻毒素的毒性及其危害，世界卫生组织(WHO)已将微囊藻毒素LR(MC-LR)列为饮用水中需控制的有害污染物。蓝藻水华引发的微囊藻毒素次生污染及其对人体健康的危害已引起了人们的关注，已成为全球共同面临的一个环境科学问题。

目前针对水体中的微囊藻毒素的分析检测技术主要有仪器分析和传感器检测两大类，前者包括高效气相色谱法(HPGC)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)等方法，具有检测灵敏度高、选择性好、特异性强等优点，但仪器检测价格昂贵、样品前处理过程复杂、对实验条件和操作技术的专业化程度要求高、检测时间较长、检测成本高、并且仪器体积大，不易于现场监测和实现突发性污染事件的监控，具有一定的应用局限性。传感器检测方法包括酶联免疫法、放射性免疫法、盐水虾法和生物探针等方法，传感器检测法的前处理过程相对比较简化，检测时间短，可以实现快速检测，并且对实验条件和操作专业化程度要求不高，适用于大批量样品的现场快速检测。但是所使用的酶价格昂贵、易失活，加之目前这类传感器检测方法普遍存在灵敏度低、稳定性差、探针价格昂贵等问题，因而限制了该技术的大范围推广使用。近年来，分子印迹技术对目标物具有特异性识别和结合的能力，其构建的分子印迹比色传感器可以实现快速检测微囊藻毒素，但是分子印迹膜制备过程需用到对环境有污染的有机试剂。由于以上这些分析方法与技术自身存在的不足，严重制约了对水体中微囊藻毒素污染动态的及时了解。因此，针对我国水体低浓度、高毒性、多种有机和无机污染物共存的污染现状，发展快速、简便、高灵敏、特异性强和现场使用的检测微囊藻毒素传感器，对于监控水体中微囊藻毒素污染控制措施的实施、保障饮水安全、缓解水资源紧张具有重大意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的SPR传感器；本发明的目的之二在于提供制备所述SPR传感器的方法；本发明的目的之三在于提供SPR传感器在检测微囊藻毒素中的应用；本发明的目的之四在于提供利用所述的SPR传感器检测囊藻毒素的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的SPR传感器，所述传感器包括玻璃芯片、微囊藻毒素适配体、DNA探针1、DNA探针2和贵金属纳米材料；所述玻璃芯片的表面负载一层贵金属纳米层，所述DNA探针1通过5’端修饰的巯基与所述玻璃芯片表面负载的贵金属纳米层通过共价键结合；所述DNA探针2通过3’端修饰的巯基与贵金属纳米材料结合；所述DNA探针1的5’端与所述DNA探针2的3’端互补结合；所述微囊藻毒素适配体一端与所述DNA探针1的3’端互补结合，另一端与所述DNA探针2的5’端互补结合。

进一步，所述DNA探针1为碱基序列如SEQ ID No.1所示的单链DNA；所述DNA探针2为碱基序列如SEQ ID No.2所示的单链DNA；所述微囊藻毒素适配体为碱基序列如SEQ ID No.3所示的单链DNA。

进一步，所述贵金属纳米层的厚度为10-20nm。

进一步，所述贵金属纳米材料的粒径是30-50nm。

进一步，所述贵金属包括金、银或铜。

2、SPR传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备玻璃芯片：将玻片清洗使表面为带正电荷的氨基，然后浸入柠檬酸稳定贵金属纳米溶液中使贵金属纳米通过静电作用力沉积于处理后的玻片上，得玻璃芯片；

(2)DNA探针1修饰玻璃芯片：将步骤(1)所得玻璃芯片浸入含DNA探针1溶液中，使所述DNA探针1通过共价键与玻璃芯片表面负载的贵金属纳米层结合；

(3)DNA探针2修饰贵金属纳米颗粒：将DNA探针2加入贵金属纳米溶液中，使所述DNA探针2通过共价键与贵金属纳米材料表面结合；

(4)SPR传感器制备：将步骤(2)中DNA探针1修饰的玻璃芯片浸入DNA探针2修饰贵金属纳米溶液中，然后加入微囊藻毒素适配体，得SPR传感器。

进一步，包括如下步骤：

(1)制备玻璃芯片：玻片先通过氨水：过氧化氢：超纯水体积比例为1：1：1的混合溶液清洗1h，然后在无水条件下置于10％氨丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中10min，再用超纯水清洗，使表面为带正电荷的氨基，最后浸入柠檬酸稳定贵金属纳米溶液中2h使贵金属纳米通过静电作用力沉积于处理后的玻片上，得玻璃芯片；

(2)DNA探针1修饰玻璃芯片：将步骤(1)所得玻璃芯片浸入含DNA探针1溶液中1h，使所述DNA探针1通过共价键与玻璃芯片表面负载的贵金属纳米层结合；

(3)DNA探针2修饰贵金属纳米颗粒：将DNA探针2加入贵金属纳米溶液中1h，使所述DNA探针2通过共价键与贵金属纳米材料表面结合，然后进行超滤，除去未结合的DNA探针2；

(4)SPR传感器制备：将步骤(2)中DNA探针1修饰玻璃芯片浸入DNA探针2修饰贵金属纳米溶液中，然后加入微囊藻毒素适配体，得SPR传感器。

3、所述的SPR传感器在检测微囊藻毒素中的应用。

4、利用所述的SPR传感器检测囊藻毒素的方法，其特征在于：将所述SPR传感器加入含有微囊藻毒素的溶液中，测定SPR信号变化即可。

本发明中利用SPR传感器检测囊藻毒素的原理如下：DNA探针1与DNA探针2以微囊藻毒素适配体作为桥梁通过碱基互补配对形成Y型DNA二倍体，从而在玻璃芯片表面形成一层新的贵金属纳米层，获得更强和更丰富的SPR信号，目标物微囊藻毒素与微囊藻毒素适配体特异性结合，改变其结构，使之失去桥梁的作用后就不能在玻璃芯片表面形成一层新的贵金属纳米层，进而该SPR传感器测定SPR信号变化进行微囊藻毒素的检测。

本发明的有益效果在于：本发明所述SPR传感器基于核酸适配体信号放大策略的实现微囊藻毒素的检测，利用贵金属薄膜的表面等离子体共振和贵金属纳米结构独有的局域表面等离子体共振原理，通过测定SPR信号变化达到快速、灵敏检测微囊藻毒素的目的。本发明SPR传感器制备方法简单，检测范围宽、选择性高、稳定性好、操作简单、试剂绿色无污染，能够满足对光信号的实时分析，易于构建野外监测便携检测仪器，而且传感器的玻璃芯片可以重复使用，成本远低于大型的分析检测仪器。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为微囊藻毒素传感器的传感机制示意图；

图2为微囊藻毒素LR测定中所用低聚核苷酸的示意图；

图3为微囊藻毒素传感器对微囊藻毒素的测试结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的SPR传感器的制备方法，具体制备方法的步骤如下：

(1)制备玻璃芯片：将玻片先用氨水：过氧化氢：超纯水体积比为1：1：1的混合溶液清洗1h，然后在无水条件下置于体积分数为10％的氨丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中10min，再用超纯水清洗，使表面为带正电荷的氨基，最后浸入柠檬酸稳定金纳米溶液中2h使金纳米颗粒通过静电作用力沉积于处理后的玻片上，得玻璃芯片；

(2)DNA探针1修饰玻璃芯片：将步骤(1)所得玻璃芯片浸入含0.03μM DNA探针1的溶液中1h，使DNA探针1通过Au-S键与玻璃芯片表面的金纳米颗粒结合，用超纯水清洗，自然晾干待用；其中DNA探针1为5’端修饰巯基DNA单链，碱基序列为5’-SH-ctgtgacggtaatt-3’(SEQ ID No.1)；

(3)DNA探针2修饰金纳米颗粒：将DNA探针2加入粒径为30-50nm金纳米溶液中1h，使DNA探针2通过Au-S键共价结合于金纳米材料表面，然后进行超滤，除去未结合的DNA探针2；其中DNA探针2为3’端修饰巯基的DNA单链，碱基序列为3’-SH-gacactggtatggt-5’(SEQ ID No.2)；

(4)SPR传感器制备：将步骤(2)中DNA探针1修饰玻璃芯片浸入DNA探针2修饰金纳米溶液中，然后加入微囊藻毒素适配体，得SPR传感器；其中微囊藻毒素适配体为DNA单链，碱基序列为5’-ggcgccaaacaggaccatgacaattacccataccacctcattatgccccatctccgc-3'(SEQ ID No.3)。

DNA探针1的5’端与所述DNA探针2的3’端互补，微囊藻毒素适配体起桥梁作用，其一端与DNA探针1的3’端互补，另一端与DNA探针2的5’端互补，通过碱基互补配对形成Y型DNA二倍体，其结构如图1所示，从而将DNA探针2修饰的金纳米颗粒引入玻璃芯片表层，由于玻璃芯片表层的金纳米颗粒增多，其产生的SPR信号将更强更丰富。当目标物微囊藻毒素与微囊藻毒素适配体特异性结合后，微囊藻毒素适配体的结构随之改变，导致其桥梁作用丧失，从而不能在玻璃芯片表面引入由DNA探针2修饰的金纳米颗粒，进而改变SPR信号，通过此原理进行微囊藻毒素的检测。

制得的SPR传感器形成如图2所示的结构，包括玻璃芯片、微囊藻毒素适配体、DNA探针1、DNA探针2和金纳米材料；其中玻璃芯片的表面负载一层金纳米层，所述DNA探针1通过5’端修饰的巯基与玻璃芯片表面通过Au-S键共价结合；所述DNA探针2通过3’端修饰的巯基与金纳米材料结合再与玻璃芯片表面结合；所述DNA探针1的5’端与所述DNA探针2的3’端互补结合；所述微囊藻毒素适配体一端与所述DNA探针1的3’端互补结合，另一端与所述DNA探针2的5’端互补结合。

上述实施例中，金纳米可以为银纳米或铜纳米，并且玻璃芯片表面的贵金属纳米颗粒可以与DNA探针2修饰贵金属纳米颗粒不同，也可以相同。

实施例2

基于核酸适配体信号放大策略的检测微囊藻毒素的SPR传感器检测水中微囊藻毒素含量的方法，包括如下步骤：

(1)按照实施例1中制备SPR传感器的方法步骤进行传感器的制备；

(2)将步骤(1)的传感器分别浸入含有0μM、10μM、100μM微囊藻毒素的PBS缓冲溶液中，然后测定SPR信号变化，结果如图3所示，由图可知，传感器在未被水洗之前，虽含有不同浓度的微囊藻毒素，但由于注入的DNA探针2修饰的贵金属纳米颗粒停留在其表面，所以三组响应值同时增大，但水洗过后，随着微囊藻毒素含量的增加玻璃芯片表面结合的DNA探针2修饰的贵金属纳米颗粒越少，相应的SPR响应值也越小。基于此可以测定不同浓度的微囊藻毒素。同时，传感器经体积比为9:1的甲醇-乙酸混合液清洗后可重复利用。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。