一种用于快速鉴定米象、玉米象和谷象的方法

摘要

本发明公开的一种用于快速鉴定米象、玉米象和谷象的方法，其特征在于，其在得到米象、玉米象和谷象的COI基因序列的基础上，找出它们之间的非同源区域，根据非同源区域序列设计如下三对特异性引物，经这些特异性引物扩增后，根据最终获得的电泳条带的有无或条带大小的不同区分三者。本发明简化了传统分类鉴定技术步骤，解决了测序成本高等问题，提供的PCR引物方法不仅能提高米象、玉米象和谷象鉴定的效率和准确性，而且操作简便快捷，适合于鉴定米象、玉米象和谷象，具有重要的理论意义和应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于应用生物技术领域，具体涉及一种用于快速鉴定米象、玉米象和谷象的方法。

背景技术

米象(Sitophilus oryzae)是米谷中的小黑甲虫，俗称蛘子。主要寄主在玉米、稻米、小麦、高粱、面粉等各种贮藏的谷物中。木地板的家庭出现的也较多。

玉米象(Sitophilus zeamais)是中国储粮的头号害虫，也是世界性的重要储粮害虫。玉米象属于钻蛀性害虫，成虫食害禾谷类种子，以及面粉、油料、植物性药材等仓储物，以小麦、玉米、糙米及高粱受害最重；幼虫只在禾谷类种子内为害。

米象与玉米象外形极相似。主要区别在于米象阳茎背面无纵沟，雌虫“Y’字形骨片两臂钝圆。米象的前胸和鞘翅较瘦，前胸沿中线刻点少于20个，体长通常小于3毫米。主要为害稻谷、花生等；只在仓内繁殖；耐寒力、耐饥力、产卵力较弱，发育较慢。

谷象(Sitophilus granarius)也是重要的储粮害虫，其危害与玉米象、米象相似。分布仅限于新疆和甘肃，是重要的植检对象。谷象前胸刻点稀，椭圆形，鞘翅无斑点，后翅退化，不能飞，体长2.8～3.5毫米。

米象、玉米象和谷象都是节肢动物门、六足总纲、昆虫纲、有翅亚纲、鞘翅目、象甲科(Curculionidae)的1种，是亲缘关系很近的一类害虫，采用肉眼观察不易区分，一般采用分子鉴定的方法对它们进行区分，该方法是通过COI序列的扩增及核苷酸测序，根据测序结果在数据库中进行比对最终将它们鉴定为不同的种属。分子鉴定的方法经扩增和测序两个环节，费时费力且成本较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对现有米象、玉米象和谷象鉴定所存在的不足而提供一种用于快速鉴定米象、玉米象和谷象的方法。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：

一种用于快速鉴定米象、玉米象和谷象的方法，其特征在于，其在得到米象、玉米象和谷象的COI基因序列的基础上，找出它们之间的非同源区域，根据非同源区域序列设计如下三对特异性引物，经这些特异性引物扩增后，根据最终获得的电泳条带的有无或条带大小的不同区分三者；

用以鉴别米象的特异性引物如下：

SO-GSP1-2F：ATCAGGAATAGTAGGTACATC；

SO-GSP1-3R：AGAGGAGGAGAATAGCAGTGATTCTT；

用以鉴别玉米象的特异性引物如下：

SZ-GSP1-2F：GTTCTGATTACTCCCTCCATCA；

SZ-GSP1-2R：AATCAACAGAGGCTCCTTCGTGT；

用以鉴别谷象的特异性引物如下：

SG-GSP1-F：TGGAACCTCTTTAAGACTATTAATTCGA；

SG-GSP1-R：AGGTGGGTAAACTGTTCACCCTGTTCCA。

本发明的有益效果如下：本发明简化了传统分类鉴定技术步骤，解决了测序成本高等问题，提供的PCR引物方法不仅能提高米象、玉米象和谷象鉴定的效率和准确性，而且操作简便快捷，适合于鉴定米象、玉米象和谷象，具有重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1为本发明米象经特异性引物扩增后的电泳示意图。

图2为本发明玉米象经特异性引物扩增后的电泳示意图。

图3为本发明谷象经特异性引物扩增后的电泳示意图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1、鉴定米象、玉米象和谷象的特异性引物对的设计

基于测得的米象、玉米象和谷象COI基因的片段，设计如下可鉴定米象、玉米象和谷象的特异性引物对：

鉴定米象的特异性引物对如下:

SO-GSP1-2F:ATCAGGAATAGTAGGTACATC；

SO-GSP1-3R:AGAGGAGGAGAATAGCAGTGATTCTT。

鉴定玉米象的特异性引物对如下:

SZ-GSP1-2F：GTTCTGATTACTCCCTCCATCA；

SZ-GSP1-2R：AATCAACAGAGGCTCCTTCGTGT。

鉴定谷象的特异性引物对如下:

SG-GSP1-F：TGGAACCTCTTTAAGACTATTAATTCGA；

SG-GSP1-R：AGGTGGGTAAACTGTTCACCCTGTTCCA：

上述鉴定米象、玉米象、谷象的特异性引物对合成方法如下:

SO-GSP1-2F:ATCAGGAATAGTAGGTACATC合成方法如下：采用固相亚磷酰胺y三酯法。具体步骤如下：

1)将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；

2)合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应；

3)带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉；

4)在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过PAGE手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。

2.SO-GSP1-3R:AGAGGAGGAGAATAGCAGTGATTCTT合成方法同上

3.SZ-GSP1-2F：GTTCTGATTACTCCCTCCATCA合成方法同上

4.SZ-GSP1-2R：AATCAACAGAGGCTCCTTCGTGT合成方法同上

5.SG-GSP1-F：TGGAACCTCTTTAAGACTATTAATTCGA合成方法同上：

6.SG-GSP1-R：AGGTGGGTAAACTGTTCACCCTGTTCCA合成方法同上：

2、样品处理及DNA提取

分别将米象、玉米象和谷象中的2种昆虫样品用蒸馏水洗净，置于1.5ml离心管中，打碎处理为细胞悬液，离心倒上清，加入200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。再加入20μl蛋白酶K(100μg/ml)，56℃水浴2h，加入200μl缓冲液GB，混匀后70℃处理10分钟，离心后加入200μl无水乙醇，充分振荡，转移该溶液至吸附柱CB3，离心弃废液，向吸附柱加500μl缓冲液GD，离心弃废液，再用600μl漂洗液洗两次后，待乙醇挥发后用灭菌双蒸水洗脱就得到的DNA样品，用于PCR扩增。

3、特异性PCR扩增

反应体系为25μl，加入2×Taq Mix12.5μl、特异性PCR引物对(10mM)各1μl、及5-10ng DNA模板，加灭菌双蒸水至25μl。

PCR反应程序：预扩增94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃45s，共35个循环，但是图1对应的退火温度为63.8℃；末次延伸72℃，7min，4℃保存。取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1、图2、图3所示，获得的电泳条带的有无或条带大小的不同区分三者。

图1、图2和图3中以米象为模板扩增出1条大概520bp的条带，而玉米象和谷象均没有条带；玉米象为模板时有1条约130bp的条带与米象的大小不一致，而谷象没有条带；只有以谷象为模板时可扩增出1条约310bp的条带，其余均没有条带。