公开/公告号CN106350541A
专利类型发明专利
公开/公告日2017-01-25
原文格式PDF
申请/专利权人 苏州兰希亚生物科技有限公司;
申请/专利号CN201610819040.8
申请日2016-09-13
分类号C12N15/867;A61K48/00;A61K38/17;A61P37/02;
代理机构北京奉思知识产权代理有限公司;
代理人吴立
地址 215125 江苏省苏州市苏州工业园区星湖街218号生物纳米园A1楼北座二楼E190单元
入库时间 2023-06-19 01:25:36
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-01-17
授权
授权
2019-09-27
专利申请权的转移 IPC(主分类):C12N15/867 登记生效日:20190910 变更前: 变更后: 申请日:20160913
专利申请权、专利权的转移
2018-06-29
专利申请权的转移 IPC(主分类):C12N15/867 登记生效日:20180612 变更前: 变更后: 申请日:20160913
专利申请权、专利权的转移
2017-03-01
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/867 申请日:20160913
实质审查的生效
2017-01-25
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种重组人白细胞介素2受体亚单位γ及其表达载体构建方法,属于基因工程技术领域。
背景技术
免疫缺陷病(Immunodeficiency disease,IDD),指的是免疫系统任何一个部分功能异常或缺失从而导致免疫功能障碍的疾病。根据疾病发病机制的不同,免疫缺陷病可以分为原发性免疫缺陷病(Primary immunodeficiency disease,PIDD)和继发性免疫缺陷病(Secondary immunodeficiency disease,SIDD)。这其中大多数PIDD都是遗传疾病,而且多发于1岁以下的儿童。根据遗传突变的不同,原发性免疫缺陷病(PIDD)又可以细分为多种亚类,目前已经报道的便有包括X染色体连锁、常染色体隐性、常染色体显性在内的超过300种遗传病。
基因治疗指的是将目标基因导入特定的细胞类型中以治愈疾病。在原发性免疫缺陷病的基因治疗中,基因治疗的常规方式是分离患者的造血干细胞,借助于病毒载体例如逆转录病毒将目标基因导入以恢复受损基因的表达,修复完成的造血干细胞或造血前体细胞中,重新导入患者体内以恢复患者自身的免疫系统(Alain Fischer et.al.Naturereviews disease primers,2015).
原发性免疫缺陷病的基因治疗最早开始于20世纪90年代早期。目前,基因治疗在四类原发性免疫缺陷病中的研究最为引人瞩目:X连锁重度免疫缺陷病(X-SCID),腺苷脱氨酶缺陷型重度免疫缺陷病(ADA-SCID),Wiskott-Aldrich综合症(WAS)和慢性肉芽肿(CGD)。研究者使用γ逆转录病毒(γRV)载体进行相关的基因治疗临床实验。例如在最早开展基因治疗的原发性免疫缺陷病ADA-SCID中,在使用γRV病毒载体进行的临床实验中已取得了成功。自2000年开始的40名接受γRV病毒载体治疗的ADA-SCID患者中,患者的存活率高达100%,而无病生存率更是高达75%。
虽然在临床研究中γRV病毒载体能够成功的实现外源基因的导入,但除ADA-SCID患者之外,其它患者均出现白血病或脊髓发育不良等症状,这与所用病毒载体的安全性不足关系密切。为克服以上困难,研究者在病毒载体改造方面花费巨大精力并构建得到安全系数更高的病毒载体自失活逆转录病毒(SIN-γRV)与自失活慢病毒(SIN-LV,Self-inactivating lentiviral vector)。这些新型载体已经广泛应用于原发性免疫缺陷病的基因治疗临床实验中,其安全性也得到了证实。例如从2012年开始,ADA-SCID的临床治疗也开始采用安全系数更高的慢病毒载体SIN-LV,相关治疗的初步结果也非常让人欣喜。
针对另一种原发性免疫缺陷病X-SCID,γRV病毒载体也已应用其中。1999-2006年,一共有20名患者接受了γRV病毒载体介导的基因治疗,其中18名患者存活至今。然而由于γRV病毒载体的安全性问题,有5名患者在治疗后数年内患上了T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)。在此之后,2010年开始,研究者采用安全性更好的SIN-γRV和SIN-LV病毒载体开展X-SCID的基因治疗,其中以SIN-γRV病毒载体开展的临床实验结果于2014年发表在《新英格兰医学杂志》上:研究者在欧洲和美国募集了9名SCID-X1患者,使用安全性更好的SIN-γRV病毒载体携带IL2RG转基因感染患者(X-SCID的发病源自IL2RG基因的缺失。)骨髓来源的CD34阳性细胞进行治疗。治疗后的12.1-38.7个月后,接受治疗的9名患者中有8人依然存活,这其中7人已经具有功能性的外周血T细胞,并能够有效的清除感染。此外研究还指出SIN-γRV病毒载体的安全性比传统的γRV病毒载体有了明显的提高。
但是,目前国际上尚无应用自失活慢病毒(SIN-LV)治疗X-SCID疾病的临床试验报道,本发明即设计并应用自失活慢病毒(SIN-LV)构建IL2RG载体来对先天性免疫缺陷疾病进行基因治疗。
除以上提到的ADA-SCID和X-SCID之外,非SCID类的原发性免疫缺陷病的基因治疗也正在开展。与SCID类疾病相比,非SCID类的原发性免疫缺陷病难以开展造血干细胞移植治疗,因而基因治疗便显得更加迫切。以WAS和CGD为代表的非SCID类原发性免疫缺陷病,在早期γRV病毒载体介导的基因治疗中同样碰到了安全性问题,不过随着病毒载体的改进,目前正在进行的WAS和CGD基因治疗临床实验中,均采用了安全性更好的SIN-γRV和SIN-LV病毒载体,并且临床的初步结果表明,接受治疗的患者的整体状况有了非常明显的改善。
因此,选用的病毒载体是安全性更高的SIN-LV载体,构建IL2RG过表达的SIN-LV病毒载体,对载体中的启动子进行改造,获得具有高启动子活性的SIN-LV-IL2RG载体,具有重要的研究和临床价值。
发明内容
本发明的提供了一种重组载体,其特征在于:该重组载体包含病毒载体和至少部分的IL2RG编码多核苷酸。
其中,所述病毒载体选自自身失活的慢病毒载体;优选所述病毒载体选自FUGW;优选所述病毒载体的启动子选自EF1a启动子、CAG启动子、hUbi启动子、CBh启动子;优选所述病毒载体的序列如SEQ ID NO﹕2所示;优选所述重组载体的序列选自由SEQ ID NOs﹕3、4、5和6组成的组中的序列。
如前所述的重组载体,所述重组载体是在FUGW载体的多克隆位点中连接了IL2RG基因的DNA片段,优选所述的IL2RG基因的序列如SEQ ID NO﹕1所示。
本发明提供了一种如前所述的重组载体的制备方法,其特征在于:将至少部分的IL2RG编码多核苷酸连接到病毒载体的多克隆位点中构建重组载体,再将阳性重组载体转染宿主细胞培养,获得所述的重组载体;所述病毒载体选自自身失活的慢病毒载体;优选所述病毒载体选自FUGW;优选所述病毒载体的启动子选自EF1a启动子、CAG启动子、hUbi启动子、CBh启动子;优选所述病毒载体的序列如SEQ ID NO﹕2所示;优选所述的IL2RG基因的序列如SEQ ID NO﹕1所示;优选所述重组载体的序列选择自SEQ ID NOs﹕3、4、5和6组成的组中的序列。
如前所述的制备方法,其特征在于,在所述至少部分的IL2RG编码多核苷酸末端分别引入BamHI和MfeI酶切位点,优选所述的酶切位点是通过引物引入的;优选所述的引物序列为:如SEQ ID NO﹕7所示的GGTACCGAGCTCGGATCCGC和如SEQ ID NO﹕8所示的CCCAATTGGCGGGTTTATCACTTATCGTCGTC。
如前所述的制备方法,其特征在于,所述的FUGW载体通过BamHI和EcoRI酶切。
如前所述的制备方法,其特征在于,所述连接采用的是T4连接酶。
如前所述的制备方法,其特征在于,所述宿主细胞是293T细胞。
如前所述的制备方法,其特征在于,所述方法包括筛选阳性重组载体的步骤:通过大肠杆菌感受态TOP10转化,单克隆挑选,PCR鉴定,测序确定。
本发明还提供了一种病毒,其包含如前所述的重组载体。
本发明还提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞包含如前所述的重组载体。
其中,所述宿主细胞选自293T细胞、造血干细胞、造血前体细胞。
本发明还提供了一种组合物,所述的组合物包含权利要求1-3任一项所述的重组载体或权利要求10所述的病毒或权利要求11或12所述的宿主细胞中的至少一种。
本发明还进一步提供了如前所述的重组载体或如前所述的病毒或如前所述的宿主细胞或如前所述的组合物在制备治疗原发性免疫缺陷病药物中的用途。
其中,所述的原发性免疫缺陷病选自:抗体缺陷病、T细胞缺陷病、T细胞和B细胞联合缺陷病、吞噬细胞缺陷病和不替系统缺陷病中的任一种。
在如前所述的用途中,所述的药物还包含可药用的稀释剂、赋形剂或给药载体。
发明的有益效果
本发明的有益效果在于利用安全性更高的SIN-LV载体,构建IL2RG过表达的SIN-LV病毒载体,并将SIN-LV过表达IL2RG感染大鼠模型(IL2RG基因敲除大鼠模型),通过分析大鼠模型的症状变化,可以对基因治疗X-SCID的有效性做出准确的评估。在此基础上,充分评估相关基因治疗安全性和有效性的基础上开展临床的基因治疗,实现国内的X-SCID基因治疗零的突破。
附图说明
图1示出启动子为hUbi的SIN-LV-IL2RG载体图谱。
图2示出启动子为hUbi的SIN-LV-IL2RG载体转染293T细胞后的免疫印记图。
图3示出启动子为EF1a的SIN-LV-IL2RG载体图谱。
图4示出启动子为CAG的SIN-LV-IL2RG载体图谱。
图5示出启动子为CBh的SIN-LV-IL2RG载体图谱。
图6示出经启动子改造的SIN-LV-IL2RG载体转染293T细胞后的免疫印记图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的,在下文中使用了专用术语,但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。
术语“载体”是指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子,包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。本发明中,术语“病毒载体”利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞,进行感染的分子机制,发生于完整活体(in vivo)或是细胞培养(in vitro)中,也可应用于包括但不限于基础研究、基因疗法或疫苗开发等领域。
术语“FUGW载体”也称为FUGW质粒,其包括但不限于经过启动子改造的载体,其中启动子包括但不限于:EF1a启动子、CAG启动子、hUbi启动子、CBh启动子。
术语“Ubi”、“UBI”具有相同含义,是一类启动子,有两种形式:一种是人类泛素启动子,UbC;另一种是植物泛素启动子Ubi。因此,在人类疾病领域中,“Ubi”与“UbC”具有相同含义.
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
具体实施例:
实施例1、SIN-LV-IL2RG构建
本发明重组人白细胞介素2受体亚单位γ基因(IL2RG)的序列是根据GenBank数据库提供的IL2RG基因序列(如SEQ ID NO﹕1所示)进行人工合成而成。
重组人白细胞介素2受体亚单位γ基因的重组应用慢病毒载体的构建方法,其步骤包括:
合成人白细胞介素2受体亚单位γ基因(IL2RG)序列,设计引物(分别带有BamHI和MfeI酶切位点),IL2RG for:GGTACCGAGCTCGGATCCGC(如SEQ ID NO﹕7所示);IL2RG rev(MfeI):CCCAATTGGCGGGTTTATCACTTATCGTCGTC(如SEQ ID NO﹕8所示)。
通过PCR扩增,其中选用的PCR聚合酶为KOD PLUS(TOYOBO,KOD-201)。反应体系如下:
10×KOD PLUS缓冲液:5μL;
dNTPs(2.5mM each):5μL;
25mM的硫酸镁:2μL;
KOD Plus DNA聚合酶:1μL;
DNA模板(50ng/μL):1μL;
IL2RG引物(正向、反向10μM):各1.5μL
双蒸水:33μL。
PCR扩增条件:
95℃3分钟;(98℃10秒,54℃30秒,68℃1分10秒)×40循环;68℃10分钟;10℃2分钟。
PCR产物经DNA割胶纯化后,采用BamHI和MfeI双酶切(内切酶均来自NEB),FUGW载体(经过启动子改造的载体,其中启动子包括但不限于:EF1a启动子、CAG启动子、hUbi启动子、CBh启动子)采用BamHI和EcoRI双酶切(内切酶均来自NEB)。
酶切产物经割胶回收,采用T4连接酶连接(来自NEB)IL2RG酶切产物与FUGW酶切产物)。连接产物通过大肠杆菌感受态TOP10转化,挑选单克隆,PCR鉴定、测序鉴定后挑选阳性克隆保存。阳性克隆载体是:
1)启动子为hUbi的SIN-LV-IL2RG载体,载体序列如SEQ ID NO﹕3所示,载体图谱如图1所示;
2)启动子为EF1a的SIN-LV-IL2RG载体,载体序列如SEQ ID NO﹕4所示,载体图谱如图3所示;
3)启动子为CAG的SIN-LV-IL2RG载体,载体序列如SEQ ID NO﹕5所示,载体图谱如图4所示;
4)启动子为CBh的SIN-LV-IL2RG载体,载体序列如SEQ ID NO﹕6所示,载体图谱如图5所示;
实施例2、SIN-LV-IL2RG的验证
阳性克隆经转染293T细胞验证。SIN-LV-IL2RG表达载体转染293细胞后,48小时提取总蛋白,进行Western Blot分析,发现SIN-LV-IL2RG(hUbi启动子)表达正常(图2)。
实施例3、不同载体表达效果的比较
启动子分别为EF1a启动子、CAG启动子、hUbi启动子、CBh启动子的SIN-LV-IL2RG表达载体转染293细胞后,48小时提取总蛋白,进行Western Blot分析,相比阴性对照组(未转染载体),EF1a启动子、CAG启动子、hUbi启动子、CBh启动子的SIN-LV-IL2RG表达载体转染后的细胞中IL2RG均有表达,且EF1a启动子、hUbi启动子的SIN-LV-IL2RG表达载体转染后的细胞中IL2RG表达量较高(图6),说明以上启动子与目的基因在细胞中的表达相关性较好,蛋白表达效果也较好。
在蛋白表达系统中,对于表达不同的蛋白,通常需要采用不同的载体。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。在本申请中为提高IL2RG蛋白在细胞中的表达水平,申请人发现,多种不同启动子驱动IL2RG蛋白在293T细胞中的表达活性中,EF1a启动子、CAG启动子、hUbi启动子、CBh启动子的SIN-LV-IL2RG表达载体经过细胞转染后,IL2RG尽管均有表达,但是相比其他启动子,EF1a启动子和hUbi启动子的SIN-LV-IL2RG效果最好。这些说明不同启动子与目的蛋白的表达水平之间存在差异,因此EF1a启动子或hUbi启动子和SIN-LV-IL2RG载体中IL2RG蛋白表达效果这两者之间契合度好。
实施例4、SIN-LV-IL2RG重组慢病毒的应用
将SIN-LV过表达IL2RG感染大鼠模型(IL2RG基因敲除大鼠模型),通过分析大鼠模型的症状变化,可以对基因治疗X-SCID的有效性做出准确的评估。在此基础上,还能进一步制备GMP级别的SIN-LV病毒,在充分评估相关基因治疗安全性和有效性的基础上开展临床的基因治疗,实现国内的X-SCID基因治疗零的突破。
以上,基于本发明的实施方式进行了说明,但本发明不限定于此,本领域的技术人员应该明白,在本发明的主旨的范围内能够以进行变形和变更的方式实施,这样的变形和变更的方式,理应属于本发明的保护范围。
机译: 构建先天性免疫缺陷基因治疗载体的方法及其用途
机译: 基于基因治疗DNA载体VTVAF17的基因治疗DNA载体,携带选自基因IL11,LIF,DICER,HOXA10,WT1的靶基因,以提高这些靶基因的表达水平,制备方法和用途应变大肠埃希氏菌SCS110-AF / VTVAF17-IL11或大肠埃希氏菌SCS110-AF / VTVAF17-DIF或大肠埃希氏菌SCS110-AF / VTVAF17-DICER或大肠埃希氏菌SCS110-AF / VTVAF17-HOXA10或大肠埃希氏菌/ VTVAF17-WT1,携带基因治疗性DNA载体,其生产方法,工业生产基因治疗性DNA载体的方法
机译: 基于VTvaf17基因治疗性DNA载体的基因治疗性DNA载体,其携带选自基因NOS2,NOS3,VIP,KCNMA1,CGRP的靶基因,以增加这些靶基因的表达水平,其制备方法和用途,菌株大肠杆菌SCS110-AF / VTvaf17-NOS2或大肠杆菌SCS110-AF / VTvaf17-NOS3或大肠杆菌SCS110-AF / VTvaf17-VIP或大肠杆菌SCS110-AF / VTvaf17-KCNCS1或Escherichia / VTvaf17基因治疗DNA载体,其生产方法,基因治疗DNA载体的工业化生产方法