大豆威廉姆斯82中NAC膜结合转录因子基因GmNTL7及其应用

摘要

本发明公开了一种大豆威廉姆斯82中的NAC膜结合转录因子基因GmNTL7及含所述基因GmNTL7的植物表达载体。本发明还公开了所述基因GmNTL7在拟南芥植株中提高其盐胁迫、干旱胁迫耐受性的应用。实验证明，本发明所述转基因植株比非转基因植株的耐盐能力得到了很大程度的提高，此为提高作物抗旱、耐盐性提供了理论依据和实践基础，预示本发明所述的基因可广泛用于培育抗旱、耐盐的植物品种。

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种大豆(Glycine max(L.)Merr)威廉姆斯82(Williams 82)中NAC膜结合转录因子基因——GmNTL7及其应用。

背景技术

植物暴露在自然环境当中，经常受到各种环境胁迫的影响，比如干旱、极端的温度、养分缺乏和病虫害等。这些环境胁迫不仅制约了植物的生长发育，同时也导致了粮食作物的减产。高等植物自身生长发育和对环境变化的响应是通过调控目的基因的表达来实现。而转录因子和基因顺式作用元件的相互作用，可以作为基因表达调控的分子开关。正是转录因子与抗逆功能基因启动子区域顺式作用元件的相互作用激活了抗逆相关基因的表达，提高了植物的综合抗逆性。有一类特殊的转录因子，因其含有一段跨膜区被称为膜结合转录因子(Membrane-bound transcription factors,MTFs)。膜结合转录因子直接整合在细胞内的膜结构上(如细胞质膜，内质网膜、核膜等)，处于休眠状态，当受到外界环境变化刺激后，膜结合转录因子便从膜上释放，转变为激活状态，并转运到细胞核内行使功能。

MTFs在酵母、原核生物和动植物中均已被发现，并证实其可通过激活目的基因的表达来行使多种功能。值得注意的是，大部分的植物膜结合转录因子在调节植物对环境胁迫响应上发挥着重要的作用。NAC转录因子家族是植物特有的一类转录因子家族，继2006年Kim等首次在拟南芥中发现NAC转录因子家族存在MTFs类型，并命名为NTM1(NAC WITH TRANSMEMBRANE MOTIF 1)以来，目前在植物中，已有9个NAC膜结合转录因子的功能已被发掘和报道。如表1：

表1植物膜NAC结合转录因子的功能

自从植物膜结合转录因子首次发现至今，人们对膜结合转录因子的研究已经取得了重大进展，涉及到植物生长发育、激素信号响应等多个方面。尤其值得关注的是，膜结合转录因子对植物的抗病性、抗寒性、抗旱性和耐盐性等逆境适应均具有十分重要的调控作用。但目前对其信号传导和调控机制的研究尚缺乏突破性的研究成果，并且多集中在模式植物拟南芥中。经检索，目前还未见大豆NAC膜结合转录因子及其相关功能的报道。

发明内容

针对目前的技术状况，本发明的目的是提供一种大豆(Glycine max(L.)Merr)威廉姆斯82(Williams 82)中NAC膜结合转录因子基因——GmNTL7及其应用。

本发明所述的大豆威廉姆斯82中NAC膜结合转录因子基因，其特征在于：所述基因命名为大豆威廉姆斯82NAC膜结合转录因子基因GmNTL7，该基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含有上述大豆威廉姆斯82中NAC膜结合转录因子基因的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体命名为表达载体pK2GW7::GmNTL7，该表达载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明所述的大豆威廉姆斯82中NAC膜结合转录因子基因在提高植株抗旱、耐盐中的应用。

其中：所述植株优选是大豆或拟南芥。进一步的，所述拟南芥是Col-0野生型，大豆品种是鲁豆11。

本发明中，申请人从大豆Williams 82中分离得到NAC膜结合转录因子基因—GmNTL7，将该基因转到模式植物拟南芥中证明其功能，结果得到了抗旱、耐盐性提高的转基因拟南芥植株。

具体的，大豆威廉姆斯82NAC膜结合转录因子基因GmNTL7在拟南芥植株中表达GmNTL7应用的例证。

申请人首先在Williams 82植株中克隆到了NAC膜结合转录因子基因GmNTL7；利过Gateway系统将GmNTL7基因通过BP反应连接到pDONR221载体上(见图1)，然后通过转化的方法在大肠杆菌DH5α中得到大量克隆，接着进行LR反应把此基因GmNTL7连接到表达载体pK2GW7(见图2)上，并在大肠杆菌DH5α中表达；接着筛选转基因大肠杆菌，并提取转化质粒，最后将转化质粒转入农杆菌菌株GV3101中。将转化农杆菌菌株转入模式植物拟南芥，验证表达了基因GmNTL7的功能。

本发明的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了Williams82NAC膜结合转录因子基因并在拟南芥中进行表达，使转基因拟南芥获得了非转基因拟南芥所不具备的高盐胁迫耐受性的能力。充分证明了本发明所述的大豆威廉姆斯82NAC膜结合转录因子基因GmNTL7在提高植株在干旱胁迫及盐胁迫中具有重要的作用，预示本发明所述的基因可广泛用于培育抗旱、耐盐的植物品种。

附图说明

图1为入门载体pDONR221图谱。

图2为植物表达载体pK2GW7图谱。

图3为Williams 82 NAC转录因子基因GmNTL7的CDS全长克隆电泳图，

其中：M为Marker，泳道1、2、3、4为基因的CDS全长克隆。

图4为35S::GmNTL7转基因的拟南芥纯系筛选。

图5为Williams 82 NAC转录因子基因GmNTL1在转基因拟南芥中RT-PCR表达分析。

图6为35S::GmNTL7转基因拟南芥植株表型分析，

其中：A图为转基因植株在0,100,150mmol/L NaCl条件下的抗盐性分析，B图为转基因植株0,200,250mmol/L甘露醇条件下的抗旱性分析。

图7为GmNTL7基因表达的蛋白产物的亚细胞定位分析，

其中：ER：内质网；Empty vector：专一性定位于内质网的蛋白。

图8为Williams 82 NAC膜结合转录因子基因GmNTL7转鲁豆11的PCR检测图，

其中：上图为35S-F/R引物进行PCR扩增的结果，下图为35S-F+GmNTL7-R引物进行PCR扩增的结果；

泳道M为Marker，泳道阳性对照为阳性质粒对照；泳道阴性对照为阴性植株对照；

上图中：泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11均为转GmNTL7转基因阳性植株；下图中：泳道1、2、4为转GmNTL7转基因阳性植株。

图9为为35S::GmNTL7转基因拟南芥植株非生物胁迫下表达量变化，

其中：A图为200mmol/L NaCl处理0、1、12h后转基因拟南芥植株根、茎、叶中GmNTL7表达量变化；B图为20％PEG处理0、1、12h后转基因拟南芥植株根、茎、叶中GmNTL7表达量变化。

具体实施方式

实施例1、GmNTL7的克隆

1.1Williams 82总RNA的提取

(1)将Williams 82植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末(直接应用于下面的实验或者冻于-80℃超低温冰箱保存备用)；

(2)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.9ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇，上下翻转15次混匀溶液，室温放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，8,000rpm，离心5min；

(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA 10min；

(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A₂₆₀/A₂₈₀达到1.7-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。

1.2 RNA的反转录

(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl反应体系)：

(2)轻轻混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向离心管中依次加入下列物质

(4)轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，-20℃保存备用。

1.3 GmNTL7基因克隆

GmNTL7 OX-F：5’-AA AAA GCA GGC TATGGGTGCCGTCGTCGA-3’

GmNTL7 OX-R：5’-AGAA AGCTGGTCAAGGAGAG ACACATCT-3’

(1)高保真酶Primer Star进行Gateway系统的第一步扩增的反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)克隆基因片段的纯化回收(天根试剂盒)

1)将切下带有目的片段的凝胶放入1.5ml离心管并称凝胶重量，加入3倍体积的溶胶液，60℃溶胶10min，溶胶期间不断的翻转；

2)凝胶完全融化后，全部吸取到回收柱中，放置片刻；

3)室温，12000rpm，离心30Sec，弃溶液；

4)在柱中加入700μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

5)在柱中加入500μl的漂洗液，12000rpm，离心1min，弃漂洗液；

6)空柱，12000rpm，离心2min；

7)回收柱开盖晾干1-2min，放入新的干净的1.5ml离心管，加入60℃预热的40μl灭菌水或者EB缓冲液，放置2min；

8)12000rpm离心1min，所得溶液即为回收片段。

(3)高保真酶Primer Star进行Gateway系统的第二步扩增。

attb引物序列：

attb-F：5’-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3’

attb-R：5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3’

反应体系如下(50μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测，见图3。

1.4克隆基因片段的BP反应

BP反应(Gateway系统)体系如下：

25℃反应8小时-过夜。

1.5大肠杆菌感受态的制备(无菌操作)

(1)取DH5α菌种接种于20ml LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；

(2)按1:100接种于50ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养1小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

(3)将菌液放置在冰上30min；

(4)4℃，4200rpm，离心10min，弃上清，加入10ml预冷的0.1M的CaCl₂悬浮菌体；

(5)将菌液放置在冰上10min；

(6)4℃，4200rpm，离心10min，弃上清，加入2ml预冷的0.1M的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积30％甘油经液氮速冻后-80℃保存备用。

1.6大肠杆菌的质粒转化(无菌操作)

(1)将1-5μl质粒DNA或者连接产物加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

(2)42℃，温水浴热激90sec，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml LB培养基，37℃培养40-50min；

(4)室温，4000rpm，离心3min，收集菌体；

(5)将菌涂布于含有相应抗生素的培养平板上，37℃倒置培养过夜。

1.7大肠杆菌PCR验证

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8 DNA测序

挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Kan(25mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果：基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

经过序列分析，上述cDNA序列与大豆Willms82的核苷酸同源100％，三次实验证明得到的就是Willms82 NAC膜结合转录因子基因，命名为GmNTL1，所述基因GmNTL1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

1.9大肠杆菌质粒DNA的提取

(1)挑取单克隆接种于10ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养8h；

(2)室温，12,000rpm，离心1min，收集菌体；

(3)弃上清，加入100μl低温预冷的溶液I，振荡悬浮菌体；

(4)加200μl新鲜配制的溶液II，快迅翻转混匀，冰浴5min；

(5)溶液澄清后加入150μl低温预冷的溶液III，轻轻混匀后冰浴5min；

(6)4℃，12000rpm，离心10min，吸取上清至新的1.5ml离心管中；

(7)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，振荡混匀；

(8)室温，12,000rpm，离心10min，转移上层水相于另一新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，再抽提一次，振荡混匀；

(9)室温，12,000rpm，离心10min，转移上层水相于另一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀并于-20℃放置30min；

(10)室温，12,000rpm，离心10min，弃上清保留沉淀。

(11)用75％乙醇洗涤沉淀两次，真空干燥5min，溶于40μl灭菌水，放至-20℃保存备用。

1.10克隆基因片段的LR反应

LR反应(Gateway系统)体系如下：

25℃反应8小时。

1.11大肠杆菌感受态的制备和质粒转化(同1.5、1.6)

1.12大肠杆菌PCR验证(同1.7)

1.13大肠杆菌质粒DNA的提取(同1.9)

验证转入pK2GW7载体的阳性pK2GW7::GmNTL7质粒的克隆区域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

1.14农杆菌感受态的制备(无菌操作)

(1)取农杆菌GV3101菌种接种于10ml YEP液体培养基中，28℃摇床培养过夜；

(2)按1：50接种于50ml YEP液体培养基中，28℃振荡培养3-4小时，至OD₆₀₀值为0.4-0.6；

(3)4℃，4,200rpm，离心10min，收集菌体；

(4)弃上清，加入10ml预冷的0.15mol/L的NaCl悬浮菌体；

(5)重复步骤3；

(6)弃上清，加入2ml预冷的20mmol/L的CaCl₂悬浮菌体，分装于1.5ml离心管中，现用或加入终体积7％DMSO经液氮速冻后-80℃保存备用。

1.15农杆菌的质粒转化(无菌操作)

(1)将10μl质粒DNA加入50μl的感受态细胞中，轻弹离心管混匀，冰浴30min；

(2)液氮速冻1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml YEP培养基，28℃培养2-4h；

(4)室温，4,000rpm，离心3min，收集菌体；

(5)将菌涂布于含有相应抗生素的YEP培养平板上，28℃倒置培养48h。

1.16转化农杆菌的PCR验证

反应体系如下(20μl体系)：

扩增条件如下：

反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.17 GmNTL7蛋白亚细胞定位

(1)从未开花的3-4周植株上选取完全展开的叶片(通常是第5-7片真叶)。

(2)(胶带撕也可)用新的单面刀片将叶片中部切成0.5-1mm的小条，保证切面没有组织的挤压。情况好的话，每克鲜重能产生107原生质体(40-60ml酶液消化100-150片叶子)。对于常规实验，5-10ml酶液消化10-20个叶片能产生0.5-1*10-6个原生质体，可用于25-100个样品(每个样品用1-2*10-4个原生质体)

(3)将叶片条迅速且轻柔的转移到备好的酶液中(5-10ml酶液加10-25个叶片)，用平头镊子使叶条两边切面都进入酶液。

(4)将叶条在黑暗中抽真空30min。

(5)(40rpm,60-90min)继续在黑暗中室温静止酶解至少3小时。轻摇后酶液呈绿色，说明原生质体解离下来。

(6)用显微镜检查原生质体，正常拟南芥叶肉细胞原生质体应约30-50μm。

(7)用W5溶液将酶/原生质体等体积稀释。

(8)用水将75μm尼龙网上的乙醇洗净并吸去多余水分，并用W5浸湿，然后过滤上述混合物。

(9)将上清转入30ml圆底离心管，100g(或者<1000rpm)离心1-2min。尽可能去除上清，并轻柔转动重悬原生质体。

(10)用血球计数板在100倍显微镜下对原生质体计数，按2*10-5ml-1的比例用W5重悬原生质体。冰上放置30min。

(11)15min后，原生质体将开始沉淀在管底。用移液器尽可能吸去W5，不要碰到沉淀。按2*10-5ml-1比例用MMG重悬原生质体，并放置在室温。

(12)在2ml离心管中加入10μl DNA(相当于5-10kb的质粒10-20μg)。

(13)加入100μl原生质体(2*10-4)，轻柔混和。

(14)加入110ml PEG溶液，轻敲离心管充分混匀(每次可转6-10个样品)。

(15)室温放置5-10min。

(16)用440μl W5稀释，轻柔混匀以终止转化。

(17)100g离心2min，去除上清。

(18)用1ml W5重悬原生质体置入6孔细胞培养板。

(19)室温培养一定时间。

(20)重悬原生质体，100g离心2min收集。

(21)去除上清直接观察活细胞，在激光共聚焦显微镜下观察GmNTL7表达的蛋白产物在细胞内的定位。

实施例2、在拟南芥中表达Williams 82 NAC膜结合转录因子基因GmNTL7的功能验证

2.1花侵染法转化拟南芥

(1)拟南芥(Col-0野生型)生长至抽苔1cm时，将顶端减掉以诱导侧生花序的生成；

(2)在转化前一天，取1ml活化过的含有表达载体质粒的农杆菌GV3101加到含相应抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培养基中，28℃震荡培养至OD₆₀₀约为1.0-1.2；

(3)室温，4,200rpm,离心10min，收集菌体，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重悬菌体，使OD₆₀₀约为0.8；

(4)用移液器将农杆菌滴到花序上进行浸染，待所有花序都被侵染后，将拟南芥放入真空干燥器中抽真空1min；

(5)用保鲜袋覆盖花序，至于20-22℃避光培养一天剪开顶部露出花序，再培养一天后揭去保鲜袋，培养至种子成熟。

2.2拟南芥种子的表面消毒

将适量待灭菌的拟南芥中子放入1.5ml离心管中，加入1ml 75％的乙醇(含有0.03％体积比的TritonX-100)震荡消毒1min，再用70％的乙醇震荡消毒1min(两次)，最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入培养基中。

2.3转基因植株的筛选

对收获的T0代种子进行表面消毒，然后后均匀涂布于1/2MS平板上(含相应的抗生素Baste)。春化处理3d后移入人工气候室生长。萌发约10天，子叶深绿色的植株为转基因植株，而子叶发浅绿甚至黄化的植株为非转基因植株。将转基因植株转入土中生长直至收获得到T1代转基因种子，T1代植株单株收种子，每株收取的种子继续筛选，将后代分离比为3∶1(阳性∶阴性)的阳性植株移栽后生长至收获T2代转基因种子，单株收种后，每株收取的种子经筛选可以得到纯系T2代转基因种子，见图4。

2.4植物RNA的提取

(1)将植物材料放入研钵中，利用液氮将其研磨成粉末(直接应用于下面的实验或者冻于-80℃超低温冰箱保存备用)；

(2)等液氮挥发后，立即将100-200mg植物粉末转入到1.5ml离心管中，然后迅速的加入1ml Trizol提取液，涡旋震荡使样品充分溶入提取液中，室温放置5min；

(3)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.9ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.2ml氯仿剧烈振荡混匀15sec，室温放置2-5min；

(4)4℃，12,000rpm，离心10min，将0.4ml上清液转移到新的1.5ml离心管中，再加入0.4ml异丙醇，上下翻转15次混匀溶液，室温放置15mim；

(5)4℃，12,000rpm，离心10min，弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀两次，4℃，8,000rpm，离心5min；

(6)弃上清，开盖于超净工作台中上干燥RNA约2-5min，加入40μl RNase-Free水，在60℃中充分溶解RNA 10min；

(7)用紫外分光光度计测RNA样品的OD值和浓度，A₂₆₀/A₂₈₀达到1.7-2.0为佳；琼脂糖凝胶电泳检测的质量。

2.5 RNA的反转录

(1)向离心管中依次加入下列物质(40μl反应体系)：

(2)轻轻混匀后，65℃变性5min，立即插到冰上，冰浴至少1min；

(3)向离心管中依次加入下列物质

(4)轻轻混匀后，42℃恒温水浴1h，65℃变性10min，-20℃保存备用。

2.6转基因植株的RealTime-PCR检测

PCR法筛选转基因阳性植株：将具有抗性的植株的cDNA用GmNTL7基因RT-PCR引物进行PCR检测。

GmNTL7基因RT-PCR引物序列：

GmNTL7 RT-F：5’-AGCATGTGAATGGTTATCCT-3’

GmNTL7 RT-R：5’-GAGAAAGAATCAACAAAGCCT-3’

普通Taq酶进行RealTime-PCR扩增的反应如下(15μl体系)：

扩增条件如下：

注：内标基因选用GmTUB。

结果见图5。

2.7 NaCl、PEG处理下GmNTL7在不同组织器官内的表达量分析

(1)将Col-0植株在200mmol/L NaCl处理0h,1h,12h后分别取其根、茎、叶，提取RNA(方法同2.4)，将RNA分别反转为cDNA(方法同2.5)，进行RealTime-PCR检测(方法同2.6)。

(2)将Col-0植株在20％PEG处理0h,1h,12h后分别取其根、茎、叶，提取RNA(方法同2.4)，将RNA分别反转为cDNA(方法同2.5)，进行RealTime-PCR检测(方法同2.6)。

2.8甘露醇和NaCl处理拟南芥

(1)拟南芥种子的表面消毒(同2.2)。

(2)甘露醇和NaCl处理

将灭了菌的Col-0、GmNTL7-1、Gm NTL7-2种子分别均匀涂布于1/2MS平板上(含相应的抗生素Baste)。春化处理3天后移入人工气候室生长。萌发约4d，根长至1cm左右，将拟南芥小苗移至添加不同浓度的甘露醇(250、300、350、400mmol/L)或NaCl(50、100、150、200mmol/L)的1/2MS培养基平板上。待小苗长至11d，观察小苗根长生长状况。

结果见图6。