一种人柯萨奇病毒A组16型病毒株及其在制备灭活疫苗中的应用

摘要

本发明公开了一种人柯萨奇病毒A组16型病毒株CA‑193(简称CA‑193病毒株)及其在制备灭活疫苗中的应用，所述应用是利用MRC‑5细胞增殖CA‑193病毒株，病毒增殖液通过甲醛或β‑丙内酯灭活后进行离心、浓缩及柱层析过滤纯化，获得CA16灭活疫苗；本发明提供了一种可用于制备人CA16灭活疫苗的疫苗病毒株，其亚型属于中国大陆主要流行的B1亚型；该疫苗病毒株在MCR‑5细胞上具有较好的生长特性，可以获得稳定较高的病毒滴度(7.5‑8.25lgTCID

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株新的人柯萨奇病毒A组16型病毒株及其灭活疫苗的制备方法，属于生物技术领域。

(二)背景技术

人柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16，CA16)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，是引发手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)的主要病原体之一，通过粪-口途径及密切接触方式传播，易在5岁以下儿童中爆发和流行。CA16的结构为20面立体对称球形颗粒，直径为23-30nm，无包膜和突起，其核酸为单股正链RNA，全长为7410bp左右，编码四个结构蛋白及七个非结构蛋白。通过VP1结构蛋白的核苷酸序列分析，可将CA16分为A，B，C三个亚型，在中国大陆主要流行的是B亚型。以往认为CA16病毒感染的病例只出现咳嗽、流涕等轻微症状，对CA16的研究力度不够，现在发现CA16感染亦可引发心肌炎、脑干脑炎、无菌性脑膜炎和肺炎等重症症状，其死亡病例也在美国、法国、日本、中国大陆和中国台湾等地区报道，同时分析HFMD临床病人发现CA16病毒还存在与肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)共感染和基因重组的现象，加大了重症HFMD的防控难度。

疫苗是防控手足口病的最主要手段之一，目前用于CA16疫苗生产的基质细胞主要是Vero细胞，Vero细胞虽然有易标准化，可大规模生产的优点，但是由于是传代细胞，可能存在致瘤性；而人胚肺二倍体成纤维细胞MRC-5来源人体，无外源蛋白过敏原，无致瘤性，因此更受到疫苗研发人员的青睐，至今没有利用人二倍体MRC-5细胞制备CA16疫苗的报道。同时CA16病毒在人二倍体细胞的复制速度较慢，病毒滴度不高，也制约了人二倍体细胞在CA16疫苗制备中的应用，目前全球范围内针对CA16病毒仍没有特效的疫苗上市。

(三)发明内容

本发明目的之一是提供一株新的，适于制备灭活疫苗的人柯萨奇病毒A组16型病毒株CA-193(简称CA-193病毒株)。

本发明之二是针对目前市面上尚无CA16上市疫苗，提供一种利用人胚肺二倍体成纤维细胞MRC-5(简称MRC-5细胞)制备CA16灭活疫苗的方法。

本发明提供的CA-193病毒株在MRC-5细胞中具有最佳的生长特性和适应特性，可以在较短时间内获得较高稳定的病毒滴度；同时利用该菌株制备的纯化疫苗在动物体内具有良好的免疫保护效果。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新的人柯萨奇病毒A组16型病毒株(Coxackievirus A16)CA-193(人柯萨奇病毒A组16型/CA-193)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2016年8月9日，保藏编号CCTCC NO：V201643，保藏地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072。本发明已经完成病毒全基因组测序，并向Genbank数据库提交序列，其序列标号为：KU854873。

本发明还提供一种所述人柯萨奇病毒A组16型病毒株CA-193在制备人二倍体成纤维细胞MRC-5柯萨奇病毒A组16型灭活疫苗(简称CA16灭活疫苗)中的应用，所述应用是利用MRC-5细胞增殖CA-193病毒株，取增殖液通过甲醛或β-丙内酯灭活后进行离心、浓缩及柱层析过滤纯化，获得CA16灭活疫苗。

进一步，所述增殖液是将CA-193病毒株接种至MRC-5细胞，接种量为MOI＝0.1-0.001，37℃吸附2h后弃培养液，加入含体积浓度3％血清的MEM培养基，37℃培养至90％以上细胞出现病变后，收集细胞悬液，反复冻融，离心，上清即为增殖液。

进一步，所述人柯萨奇病毒A组16型病毒株CA-193以病毒毒种的形式接种，所述病毒毒种按如下方法制备：取CA-193病毒株接种至MRC-5细胞，接种量为MOI＝0.1-0.01，37℃吸附2h后弃培养液，加入含体积浓度3％血清的MEM培养基，37℃培养至90％以上细胞出现病变后，收集细胞悬液，反复冻融，离心，上清即为病毒毒种。

更进一步，具体所述应用为：待MRC-5细胞铺满培养瓶后弃培养液，以MOI＝0.1-0.001的接种量接种CA-193病毒株或病毒毒种，置37℃培养3-5天至细胞发生病变后收集细胞悬液，反复冻融三次后1000g离心10分钟，收集上清即为增殖液；收获的增殖液加入甲醛或β-丙内酯37℃灭活72-96小时，6000g离心30分钟后取上清，超滤浓缩至原体积的1％-50％(优选1％)，经过Sepharose或者Sephacryl凝胶柱层析，收集第一个洗脱峰并经0.22μm滤膜过滤除菌后即为CA16灭活疫苗。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供了一种可用于制备人CA16灭活疫苗的疫苗病毒株，其亚型属于中国大陆主要流行的B1亚型；该疫苗病毒株在MCR-5细胞上具有较好的生长特性，可以获得稳定较高的病毒滴度(7.5-8.25lgTCID₅₀/ml)。疫苗制备方法完善，杂质含量少，免疫原性与免疫保护性较好，同时由于细胞培养基质为MRC-5细胞，安全性更好，也更符合国际上及CFDA对疫苗研发生产的规定与要求。

(四)附图说明

图1：Vero，MRC-5细胞感染CA-193病毒后的显微图，A为Vero细胞感染CA-193病毒24小时后变化图，B为MRC-5细胞感染CA-193病毒24小时后变化图，放大倍数：100×。

图2：CA-193病毒株在MRC-5细胞传代后的病毒滴度水平。

图3：沙鼠接种不同单位抗CA-193疫苗后的中和抗体水平。

图4:沙鼠接种0-640U抗CA-193疫苗，被CA16病毒攻击后的存活率。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1CA-193病毒株的分离与鉴定

2010年从杭州市第六人民医院一名12个月大的手足口病男性患者获得咽拭子及疱疹液样本，样本经过0.22μm滤膜过滤处理，滤液接种至单层长满非洲绿猴肾传代细胞(Vero，购自美国典型菌种保藏中心(ATCC CCL-81))的25cm²方瓶中，待80％以上Vero细胞出现病变后收集细胞悬液，反复冻融三次，1000rpm离心10分钟后取上清即为病毒液，取1ml病毒液接种Vero细胞(25cm²方瓶)，反复传代三次后通过蚀斑法得到CA-193病毒株，并确定为第1代原始菌株。图1中A为Vero细胞感染CA-193病毒株的情况。

Qiagen Rneasy Mini Kit试剂盒(购自QIAGEN公司)提取CA-193病毒株的总RNA，实验步骤根据试剂盒提供的方法，如下：

a)取200μl病毒液，加入600μl体积的RLT，振荡器振荡1min。

b)加入600μl预冷的-20℃无水乙醇混匀。

c)分2次各取约600μl混合液加入分离柱中，12000rpm离心30s，弃滤液；

d)取700μl RW1洗液洗柱，12000rpm离心30s；

e)取500μl RPE洗液洗柱，12000rpm离心30s；

f)取500μl RPE再洗一次，12000rpm离心30s；

g)柱子12000rpm空离2min；

h)换一新EP管，在柱中加30μl DEPC水，静置2min后12000rpm离心1min，DEPC水洗脱RNA，-70℃保存备用。

采用Takara公司PrimeScript^TM>

合成7对引物(F表示上游引物，R表示下游引物)，序列如下：

RT302-1F TTAAAACAGCCTGTGGGTTGTT

RT302-1R ACTGGACATGCACGCAAAATC

RT302-2F CACGACCTGACGTGTCAGTGA

RT302-2R AATGTCCTCCGTGTCCTTGC

RT302-3F TGACTATTACACCACCGGCATT

RT302-3R TGGTGAAACTAACCGGGTAGTGT

RT302-4F ACTATAGGGTAGTGAATCGGCATCT

RT302-4R TTTCTCTTCCAGGGATGCCA

RT302-5F CATTCTAGCGTTTACTCACTCCCT

RT302-5R TGTAGGGAAGTTGTACATCATGGTT

RT302-6F AGTTTAGGGACGTCACCAAGTTTAT

RT302-6R CTAGCCAACACATCATCTCCGTA

RT302-7F CAACCACACCCATCATGTGTATC

RT302-7R TTGCTATTCTGGTTATAACAAATTTACC

通过PCR反应进行序列扩增，PCR的退火温度Tm均为60℃，PCR产物交由上海生工股份有限公司测序，用DNAstar Seqman软件进行拼接得全长为7411bp的基因组序列(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)，提交Genbank数据库(Genbank ID:KU854873)。通过序列比对发现CA-193病毒株与其他柯萨奇病毒A组16型分离株shzh03-10(AY895095.1)，shzh01-26(AY895103.1)，521-06F/SD/CHN/2007(GQ429223.1)，GS001F/GS/CHN/2007(GQ429230.1)，GS0151V/GS/CHN/2008(GQ429246.1)，QH0202T/QH/CHN/2008(GQ429266.1)编码VP1蛋白的序列相似性达99％以上，证明菌株属于柯萨奇病毒A组16型(Coxackievirus A16)，进化上属于大陆流行的B1a基因亚型，记为人柯萨奇病毒A组16型病毒株(Coxackievirus A16)CA-193。

实施例2疫苗的制备

(1)二倍体细胞的复苏与培养

将冻存的人胚肺二倍体成纤维细胞MRC-5(购自美国典型菌种保藏中心(ATCCCCL-171))置37℃水浴解冻，接种至含20％胎牛血清的MEM培养基(Invitrogen)，转至细胞培养箱，37℃，5％CO₂培养至细胞铺满培养瓶表面后，用含0.25％胰蛋白酶消化3-5分钟，轻轻吹打细胞至单细胞悬液，以1:2比例进行传代培养，传至第六代，获得第六代MRC-5细胞。

(2)病毒的培养与扩增

CA-193病毒毒种的制备：待步骤(1)第六代MRC-5细胞铺满75cm²培养瓶，弃培养液，将实施例1中CA-193病毒株接种至MRC-5细胞，接种量为MOI＝0.1-0.01，37℃吸附2h后弃培养液，加入含体积浓度3％血清的MEM培养基，37℃培养至90％以上细胞出现病变后，收集细胞悬液，反复冻融，离心，上清即为病毒毒种。

待步骤(1)第六代MRC-5细胞铺满75cm²培养瓶，弃培养液，加入CA-193病毒毒种，以MOI＝0.1接种到所述MRC-5细胞培养瓶中，轻轻摇动培养瓶使CA-193病毒与MCR-5细胞接触均匀，37℃吸附2h后弃培养液，加入含体积浓度3％血清的MEM培养基25ml，37℃培养48-72h。结果见图1中B所示，细胞感染病毒后出现典型的细胞病变，细胞发生皱缩，肿胀，变圆，部分细胞漂浮。待90％以上细胞出现病变后，收集细胞悬液，反复冻融3次，1000g离心10分钟，上清即为在MRC-5细胞中传代的第2代CA-193病毒液，重复上述过程得到第3-7代CA-193病毒液，即为增殖液，同时用Reed-Muench法测定病毒滴度，图2显示CA-193病毒株在MRC-5细胞中传代后的滴度，滴度均较高并稳定在7.5-8.25lgTCID₅₀/ml之间。

(3)灭活疫苗粗品的制备

往步骤(2)制备的增殖液中加入体积比为1:4000的福尔马林或β-丙内酯，35℃灭活72-96小时，6000g离心30分钟后取上清。上清1ml接种第10代MRC-5细胞(25cm²培养瓶)，并盲传三代，如果没有细胞发生病变的话，说明病毒已经被完全灭活，收集的上清即为灭活疫苗粗品。

(4)疫苗的浓缩与纯化

将制得的疫苗粗品用10万超滤器进行透析浓缩至原体积1/10，透析液为0.01M、pH7.4的PBS，浓缩液用Sepharose-4FF(GE XK50/100)或者Sephacryl凝胶柱层析洗脱纯化，收集第一个洗脱峰即为疫苗原液，疫苗原液经0.22μm滤膜过滤除菌后即为CA16灭活疫苗纯品。疫苗纯品加入终浓度为0.6mg/ml氢氧化铝佐剂，轻摇溶解1h，按0.5-1％(W/V)比例加入人血白蛋白，即为疫苗半成品，疫苗纯品经无菌试验合格，进行分装，每支1.0-1.5ml，即为CA16灭活疫苗成品。成品疫苗进行外观检查，无菌试验，pH值测定，效力测定，防腐剂试验，毒性试验，检测均合格，检查方法按《中华人民共和国药典三部》2010年版规定的检查项目进行。

实施例3疫苗效价的测定

实施例2制备的疫苗纯品通过常规的ELISA方法进行效价测定。100μl用PBS倍比稀释的疫苗滴加入96孔板，4℃包被过夜。特异性抗CA16多抗以1:2000-1:10000浓度PBS稀释后加入96孔板，37℃孵育60分钟，接着用HRP连接的二抗(1:5000-1:10000，PBS稀释)孵育1h，450nm波长下检测吸光度，吸光度大于0.1即视为阳性，并将阳性最大稀释度的疫苗效价定为400U。

实施例4中和抗体实验

选30日龄沙鼠，腹腔免疫5U，10U，20U，40U，160U含0.6mg/ml Al(OH)₃佐剂(Sigma)的CA16灭活疫苗，免疫流程为0天第一针，7天后加强免疫一针，免疫两针后第14天眼眶采血200μl，血液4℃放置过夜后，12000rpm离心5分钟，取上层血清进行中和抗体实验，步骤如下：

a)用无FBS的MEM培养基对血清进行倍比稀释，起始稀释浓度为1:8，随后为1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512。

b)取50μl血清稀释液，将等体积的含100TCID₅₀CA-193病毒液与之混匀，37℃孵育2h。

c)将步骤b中混合液加入已铺好Vero细胞的96孔板中(10000个细胞/孔)，37℃孵育2h。

d)向步骤c)的孵育液中直接加入含有FBS的MEM培养基，使FBS终浓度达到3％。

e)3-5天后观察Vero细胞的病变情况(CPE)。

图3为30日沙鼠接种不同单位CA-193疫苗株后的中和抗体水平情况，可以看出在接种疫苗单位大于10U后，沙鼠血清能产生有效的中和抗体水平(>1:8)，并且随着接种疫苗单位的提高，中和抗体水平也不断升高。

实施例5疫苗免疫保护效果的评价

采用7日龄沙鼠动物模型对制备得到的CA-193疫苗进行免疫效果评价，以效价为640U,160U,40U,10U,2.5U及阴性对照PBS免疫沙鼠，免疫程序为第0、7天各1针，第14天腹腔接种CA16病毒株(Genbank ID:KX056216)，接种病毒量为100×LD₅₀，即3.16×10³TCID₅₀/只CA16病毒，14天内观察沙鼠的体重及存活率。结果见图4，接种疫苗效价在40U以上能完全保护沙鼠，接种疫苗效价在10U的可以保护70％以上沙鼠，而未接种疫苗的对照组沙鼠全部死亡，说明本方法制备的CA16疫苗有很好的免疫保护效果。