一种增殖细胞核抗原的单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株

摘要

一种增殖细胞核抗原的单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述分泌增殖细胞核抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系的保藏号为CGMCC No.12045。所述杂交瘤细胞系分泌的增殖细胞核抗原的单克隆抗体，其特征在于，其能够特异的结合增殖细胞核抗原；优选地，所述单克隆抗体的亚型为IgG2b。

说明书

技术领域

本发明涉及一种增殖细胞核抗原(PCNA)的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及所述的抗体的应用。

背景技术

DNA的合成复制是细胞增殖分裂的重要基础⁽¹⁾。细胞从G1期进入S期从而进行DNA的复制，将整个基因组复制成为完全相同的两份。然后细胞经过G2期再进入M期进行有丝分裂，从而一个细胞分裂为两个细胞，实现了细胞的增殖，将遗传信息传递给新的细胞。DNA的复制需要招募一系列的DNA合成相关的蛋白的参与，而增殖细胞核抗原(proliferatingcell>(2-3)，3个PCNA单体分子形成一个环状同源三聚体复合物。该环状复合物内直径3.4nm，而DNA的直径为2nm，并且环状结构内部为正电荷。因此，在DNA复制过程中，PCNA就能像套环一样将DNA套在其中，并可以沿着DNA滑动。同时PCNA作为一个招募其它功能蛋白的平台，将各种与DNA合成相关的蛋白募集过来，并随着PCNA在DNA上的滑动实现DNA的不断复制。由于PCNA与DNA的合成复制密切相关，因此它的表达量变化几乎是与DNA的合成水平的变化一致。而DNA的合成是细胞增殖的重要表现，因此PCNA的表达是反应细胞增殖状态的良好指标。

众所周知，肿瘤细胞具有非常旺盛的增殖能力，因此PCNA的蛋白表达水平相比正常细胞都呈现明显的高表达。采用免疫组化方法检测肿瘤组织中的PCNA蛋白表达水平，可以评价肿瘤的细胞增殖状态。

PCNA目前已经用于胃癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌等的肿瘤临床诊断。有文献报道⁽⁵⁾，在结直肠癌患者中，PCNA表达高的肿瘤细胞生长能力强，细胞分化程度低，恶性程度高，易发生淋巴结转移，预后较差。同样，在卵巢癌组织中⁽⁶⁾，PCNA在低分化的肿瘤中表达明显高于高分化的肿瘤中的表达。PCNA高表达的肿瘤一般更易发生浸润和转移，其表达增高的程度与细胞的去分化有关。其结果表明PCNA是一个通用性很好的肿瘤诊断指标，主要用于辅助判断肿瘤的分化程度以及增殖活性，为肿瘤的治疗和预后的判断提供重要的参考依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种PCNA单克隆抗体(anti-PCNA)、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明一个方面提供了一种分泌增殖细胞核抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系的保藏号为CGMCC No.12045。

本发明的另一个方面提供了一种由前述的杂交瘤细胞系分泌的增殖细胞核抗原的单克隆抗体，其特征在于，其能够特异的结合增殖细胞核抗原；优选地，所述单克隆抗体的亚型为IgG2b。

本发明再一个方面提供了上述杂交瘤细胞系及上述的单克隆抗体在检测靶增殖细胞核抗原中的应用。

本发明再一个方面提供了一种包含上述杂交瘤细胞系及上述的单克隆抗体的试剂盒。

本发明再一个方面提供了前述的杂交瘤细胞系及前述的单克隆抗体在检测癌细胞的试剂盒中的应用，所述癌细胞优选为乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞，更优选为直肠癌。

发明再一个方面提供了前述杂交瘤细胞系的制备方法，

1.抗原制备：

(1)获得目的基因

以Trizol Reagent试剂提取HeLa细胞总RNA，将总RNA反转录为cDNA并以cDNA为模板通过PCR扩增PCNA基因；

(2)构建重组表达载体

将步骤(1)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体pET41a，构建重组质粒pET41a-PCNA；载体经过酶切和测序鉴定后用于转化表达细菌；

(3)获得含重组表达质粒的表达菌种

将步骤(2)获得的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，用含有硫酸卡那霉素的LB固体培养基筛选，挑取单克隆用于抗原表达；

(4)诱导表达和纯化

将含有表达质粒的Rosetta(DE3)细菌单克隆接种于10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃度，220rpm培养10hr；将菌液按1:100稀释倍数接种于200m的LB培养基，培养至OD值为0.6，加入0.1mM IPTG诱导表达，在20℃度下作用5hr，收集菌液超声破碎，从上清中纯化重组抗原PCNA，以SDS-PAGE电泳分析；

2.杂交瘤的制备：

(1)免疫动物

使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方法进行三次免疫注射：

第一次免疫 用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏完全佐剂，含100ug抗原)；

第二次免疫 间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原)；

第三次免疫 间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原)；

测效价 根据融合时间安排，第三次免疫7-10天后取血检测，用western法检测效价，选择效价达到1:1000的小鼠用于融合；

加强免疫 融合前3天，向待取脾小鼠进行加强免疫，小鼠腹腔注射200ul液体(含60ug抗原，溶剂为1×PBS，pH7.4)；

(2)、细胞融合

采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，放入带200目不锈钢网的平皿中研磨，制备细胞悬液；将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按1:5-1:10比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇(50％)；采用HAT选择培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选；

用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：将抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸盐缓冲液)稀释为8ug/ml加入96孔酶标板中，50ul/孔，放入4℃冰柜中包被过夜。弃去包被液，用PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板三次，加入封闭液3％BSA-PBST(加入3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)，100ul/孔，37℃孵育1小时；弃去封闭液，PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板一次，甩干板子；将杂交瘤细胞培养上清加入酶标板100ul/well，同时加入PBST(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照。37℃孵育1小时；弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加入稀释好的anti-mouseIgG/HRP，100ul/well，37℃孵育1小时；弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加底物TMB100ul/well，室温，避光37℃，10-15min后加入50ul终止液(2mol/L硫酸)；使用酶标仪测定，酶标仪设置为：450nm比色；和阴性对照相比，OD值2.5倍之上的为阳性；筛选得到抗PCNA的杂交瘤细胞株，命名为2E1，亚型鉴定为IgG2b。

以有限稀释法，对筛选出的阳性杂交瘤细胞株2E1进行单克隆筛选，获得能产生WB稀释比>1:1000的单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆，获得阳性杂交瘤细胞为抗人PCNA杂交瘤细胞系2E1，其已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12045，保藏日为2016年3月10日。

发明再一个方面提供了前述的单克隆抗体的制备方法，将前述的杂交瘤细胞株2E1接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中获得抗体(所获抗体命名为anti-PCNA)；

优选地，使用Protein G亲和纯化法纯化单克隆抗体：将用PB溶液平衡好的Protein G填料装入纯化柱中，加入经PB溶液稀释的单克隆抗体anti-PCNA的腹水过柱；上样结束后，用PB溶液洗柱子至流穿液OD值<0.01；然后用0.1M pH3.0的甘氨酸-盐酸溶液洗脱，收集整个洗脱峰的溶液；洗脱液经过透析浓缩并更换为PBS溶液；SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95％以上。本发明的阳性杂交瘤细胞为抗人PCNA杂交瘤细胞系2E1，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12045，保藏日为2016年3月10日。

附图说明

图1、PCNA抗体十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测。

图2、免疫印迹检测不同裂解液(CHO-K1、C6、COS7、3T3、Hela)中PCNA蛋白的表达(抗体稀释倍数1:1000)。

图3、PCNA抗体的免疫荧光测试(所用细胞系：HeLa，抗体稀释比1:100)。

图4、PCNA抗体的免疫沉淀测试(所用细胞系：HeLa)

图5、PCNA抗体的免疫组化检测(结直肠癌病理切片，抗体稀释倍数1:400)。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。

试剂、酶、载体及细胞株：

(1)细胞株：HeLa( CCL-2^TM)、CHO-K1( CCL-61^TM)；C6(CCL-107^TM)、COS7( CRL-1651^TM)、3T3(>TM)。

(2)实验动物：雌性BALB/c小鼠(湖南斯莱克景达实验动物有限公司)；

(3)载体：pET41a(Novagen)

(4)酶及抗体试剂：构建载体过程和PCR过程的各种酶购自Fermentas，ELISA实验所用抗体anti-mouse IgG/HRP(Jackson Immuno Research)，ELISA底物TMB(Sigma)、逆转录试剂盒(Fermentas)，BSA购自(北京元亨金马生物科技有限公司)

(5)其他试剂如无特别说明为国产分析纯。

实施例1：杂交瘤细胞株PCNA及其产生的单克隆抗体的获得。

1.抗原制备

(1)获得目的基因

以Trizol Reagent试剂提取HeLa细胞总RNA，将总RNA反转录为cDNA并以cDNA为模板通过PCR扩增PCNA基因。

(2)构建重组表达载体

将步骤(1)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体pET41a，构建重组质粒pET41a-PCNA。载体经过酶切和测序鉴定后用于转化表达细菌。

(3)获得含重组表达质粒的表达菌种

将步骤(2)获得的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，用含有硫酸卡那霉素的LB固体培养基筛选，挑取单克隆用于抗原表达。

(4)诱导表达和纯化

将含有表达质粒的Rosetta(DE3)细菌单克隆接种于10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养10hr。将菌液按1:100稀释倍数接种于200ml新鲜的LB培养基，培养至OD值为0.6，加入0.1mM IPTG诱导表达，在20℃下作用5hr，收集菌液超声破碎，从上清中纯化重组抗原PCNA。SDS-PAGE电泳分析，重组抗原分子量与预测的大小一致。

2.单克隆抗体的制备和纯化

(1)免疫动物

一般使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方法进行三次免疫注射。

第一次免疫 用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏完全佐剂，含100ug抗原)。

第二次免疫 间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原)。

第三次免疫 间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原)。

测效价根据融合时间安排，第三次免疫7-10天后取血检测，用常规的western法检测效价，选择效价达到1:1000的小鼠用于融合。

加强免疫 融合前3天，向待取脾小鼠进行加强免疫，小鼠腹腔注射200ul液体(含60ug抗原，溶剂为1×PBS，pH7.4)。

(2)、细胞融合

采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，放入带200目不锈钢网的平皿中研磨，制备细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1:5-1:10)，并加入促融合剂聚乙二醇(50％)。采用HAT选择培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。

用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：将抗原用包被液(pH 9.6、0.05M碳酸盐缓冲液)稀释为8ug/ml加入96孔酶标板中，50ul/孔，放入4℃冰柜中包被过夜。弃去包被液，用PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板三次，加入封闭液3％BSA-PBST(加入3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)，100ul/孔，37℃孵育1小时。弃去封闭液，PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板一次，甩干板子。将杂交瘤细胞培养上清加入酶标板100ul/well，同时加入PBST(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照。37℃孵育1小时。弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加入稀释好的anti-mouse IgG/HRP，100ul/well，37℃孵育1小时。弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加底物TMB100ul/well，RT，避光37℃，10-15min后加入50ul终止液(2mol/L硫酸)。使用酶标仪测定，酶标仪设置为：450nm比色。和阴性对照相比，如果是OD值2.5倍之上就是阳性。最后筛选得到一株效价最好的抗PCNA的杂交瘤细胞株，命名为2E1，亚型鉴定为IgG2b。

将筛选出的阳性杂交瘤细胞株2E1进行单克隆筛选(有限稀释法)，获得能产生高效价(WB稀释比>1:1000)单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人PCNA杂交瘤细胞系2E1，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.12045，保藏日为2016年3月10日。

(3)单克隆抗体的制备与纯化

将步骤(2)获得的细胞株2E1接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中纯化抗体(所获抗体命名为anti-PCNA)。

抗PCNA单克隆抗体的纯化：使用Protein G亲和纯化法。将用PB溶液平衡好的Protein G填料装入纯化柱中，加入经PB溶液稀释的单克隆抗体anti-PCNA的腹水过柱。上样结束后，用PB溶液洗柱子至流穿液OD值<0.01。然后用0.1MpH3.0的甘氨酸-盐酸溶液洗脱，收集整个洗脱峰的溶液。洗脱液经过透析浓缩并更换为PBS溶液。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95％以上(参见图1)。

实施例2：单克隆抗体鉴定及应用

1.小鼠抗PCNA单克隆抗体(anti-PCNA)的免疫印迹检测鉴定

提取各种肿瘤细胞系的细胞裂解液，总蛋白浓度调整到2mg/ml，上样至8％的SDS-PAGE胶孔中，20ug/孔，电泳后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭后，用实施例1制备得到的anti-PCNA抗体进行免疫染色：加入实施例1步骤(3)制备并纯化的anti-PCNA，工作浓度为1:1000，4度孵育过夜，然后加入HRP标记的山羊抗鼠抗体，工作浓度1:20000，于37度反应1hr，每个浓度梯度均出现36KD的条带(参见图2)，与文献报道相符，证明此抗体为抗PCNA的特异性抗体；抗体稀释梯度达到1:1000(抗体工作浓度能达到0.2ug/ml)有清晰条带，能够检测PCNA在CHO-K1(Lane 1)、C6(Lane 2)、COS7(Lane 3)、3T3(Lane 4)、HeLa(Lane 5)细胞中的表达。

2.免疫荧光细胞染色鉴定

HeLa细胞用PBS洗两次，4％多聚甲醛室温固定30min，PBS冲洗，用0.5％Triton X-100PBS室温透化20min。然后加入5％BSA PBS以封闭非特异性反应。加入实施例1步骤(3)制备并纯化的anti-PCNA单克隆抗体1:100，37度孵育30min。冲洗，加入FITC标记的山羊抗鼠IgG，室温避光孵育1hr。去除游离的二抗，PBS冲洗，荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察，用蓝色光激发观察绿色荧光信号。实验结果(图3)清楚观察到细胞核中呈现明显绿色荧光，定位和文献报道一致。说明此抗PCNA的特异抗体可以用于免疫荧光检测观察PCNA的表达和定位。

3.免疫沉淀检测鉴定

配制适量新鲜HeLa细胞裂解液，将细胞收集到离心管中用细胞裂解液冰浴裂解0.5-1hr。13000rmp/min 15min 4度，小心取上清(避免细胞残渣和脂肪膜)，将1ul anti-PCNA抗体与500ul预冷的细胞裂解物混合，4℃翻转过夜。阴性对照抗体采用小鼠正常血清纯化IgG 1ul。取70-100ul 10％的ProteinG珠子加入抗原抗体复合物混合，4℃孵育(翻转摇床)3-4h。400g 4℃离心5min去上清，用预冷裂解缓冲液洗3次。最后一次离心后，小心吸取上清，加入25-35ul 2X Loading buffer煮5-10min，14000g 4℃离心5min，取上清，用于免疫印迹检测。

结果显示(图4)，anti-PCNA小鼠单克隆抗体能够有效的将PCNA蛋白从复杂的细胞裂解液样品中纯化出来。免疫沉淀效果非常好。

4.免疫组化检测

结直肠癌组织的石蜡切片经过脱蜡水化后，加入3％H2O2室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。采用高压抗原修复方法进行抗原修复，溶液使用枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)。经5％正常山羊血清(PBS稀释)封闭后，加入anti-PCNA单克隆抗体1:200，37度孵育30min，PBS冲洗3次，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG，室温孵育1hr。PBS冲洗5次，添加显色剂显色(DAB)。自来水充分冲洗，复染，封片。实验结果(图5)清楚观察到细胞核中呈现明显染色，说明此抗PCNA的特异抗体可以用于免疫组化检测观察PCNA在组织中的表达和定位。