一种用于鲤春病毒血症病毒检测的核酸适配体及其应用

摘要

本申请公开了一种用于鲤春病毒血症病毒检测的核酸适配体及其应用。本申请的用于鲤春病毒血症病毒检测的核酸适配体，包括式一所示通式的一种或两种DNA片段，式一：5’‑P

说明书

技术领域

本申请涉及鲤春病毒血症病毒检测领域，特别是涉及一种用于鲤春病毒血症病毒检测的核酸适配体及其应用。

背景技术

鲤春病毒血症(Spring viremia of carp)是世界动物卫生组织(OIE)名录疫病，致死率高，宿主主要为鲤科鱼类，对我国的鲤科鱼养殖业造成很大威胁。鲤春病毒血症的病原为鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of carp virus，缩写SVCV)，属于弹状病毒科。SVCV病毒粒子呈子弹状，长90～180nm，宽60～90nm，基因组长度为11019nt。

目前对于SVCV的检测主要包括核酸检测和酶联免疫检测，例如，吴斌等发表的“数字RT-PCR检测鲤春病毒血症的方法建立与应用”《中国动物检疫》,2015(7):72-76；安伟等发表的“鲤春病毒血症病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立”《中国预防兽医学报》,2015,37(9):699-702；以及，李泽明等发表的“鲤春病毒血症病毒M单克隆抗体的制备及鲤天然免疫蛋白TRIM32特性初步研究”《华中农业大学》,2015。

核酸适配体(Aptamer)又被称为核酸适配子，是一类单链短DNA或RNA片段，由于其具有一定的空间结构，对特定的靶分子具有亲和力。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域，并在前沿医学领域，如抑制人畜共患病毒、抗肿瘤药物研发等方面有应用。传统的酶联免疫检测，由于抗原-抗体反应灵敏度和特异性均较好，产业技术较成熟，因此，市场上的许多试剂盒都是基于此原理开发的。但是，酶联免疫采用的蛋白质易受pH、温度等环境因素影响而变性，且合成价格昂贵。相比较而言，核酸适配体由DNA或RNA构成，主要是DNA，比蛋白质体积更小，并且同样拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度和特异性，同时合成更容易、稳定性更好。在不远的将来，核酸适配体有望取代传统的酶联免疫反应。

核酸适配体属于比较前沿的技术，目前运用于水生动物病毒的研究还比较少，尚未有关于SVCV核酸适配体或相关试剂的研究和报道。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于鲤春病毒血症病毒检测的核酸适配体及其应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于鲤春病毒血症病毒检测的核酸适配体，该核酸适配体包括式一所示通式的一种或两种DNA片段，

式一：5’-P₁-N-P₂-3’

其中，P₁和P₂分别为Seq>

Seq ID No.1：5’-GGACACTCAAGGTTCATCAG-3’

Seq ID No.2：5’-GAGTAGTTCAGGATAGGACG-3’

Seq ID No.3：

5’-GCTCCCATGTTTTTTCCCCCTCCTCTCCCCCTGGTTCCTA-3’

Seq ID No.4：

5’-TTACTGTTTTGGTCTTCATTGGTGCTTGGTTCGCTCTCTA-3’。

需要说明的是，式一中P₁和P₂为本申请特别设计的能够与鲤春病毒血症病毒特异性结合的序列，通过P₁和P₂的序列确定了本申请核酸适配体的检测特异性，而N为则为一段插入的随机序列，长度通常在20～50nt，本申请经过研究分析最终确定N为Seq>

因此，本申请的核酸适配体实际上有两个DNA片段，即核酸适配体包括Seq IDNo.5所示序列的DNA片段和/或Seq ID No.6所示序列的DNA片段；

Seq ID No.5：

5’-GGACACTCAAGGTTCATCAGGCTCCCATGTTTTTTCCCCCTCCTCTCCCCCTGGTTCCTAGAGTAGTTCAGGATAGGACG-3’

Seq ID No.6：

5’-GGACACTCAAGGTTCATCAGTTACTGTTTTGGTCTTCATTGGTGCTTGGTTCGCTCTCTAGAGTAGTTCAGGATAGGACG-3’。

可以理解，本申请的两个DNA片段的核酸适配体，由于其具有相同的P₁和P₂序列，经试验证实，两者都具有很强的鲤春病毒血症病毒检测特异性，能够用于鲤春病毒血症病毒检测，因此，这两DNA片段可以单独使用，也可以配合使用，在此不做具体限定。

优选的，核酸适配体的DNA片段上具有至少一种功能基团标记，这些功能基团标记包括巯基标记、氨基标记、放射性同位素标记、荧光素标记、生物素标记、毒素标记和酶标记。

可以理解，本申请的核酸适配体具有很强的特异性，能够用于鲤春病毒血症病毒检测，而根据不同的使用环境或条件，可以对本申请的核酸适配体进行各种修饰，以配合具体的信号显示方法或工具，例如巯基标记、氨基标记、放射性同位素标记、荧光素标记、生物素标记、毒素标记和酶标记。需要说明的是，前面提到的各种功能基团标记，其标记的获得或制备方法都是已知的，本申请将这些标记引入到本申请的核酸适配体中，使得核酸适配体具备相应的功能，进而拓展了核酸适配体的应用领域。当然，本申请的核酸适配体也可以不进行以上这些功能基团标记。

优选的，核酸适配体的DNA片段具有全硫化修改、端基封闭修改或PEG修饰中的至少一种。其中PEG修饰是指带有官能团的聚乙二醇修饰。

同样的，对本申请的核酸适配体进行全硫化修饰、端基封闭修饰或PEG修饰，这些修饰的获得或者制备方法本身也是已知的，本申请将其引入到本申请的核酸适配体中也是为了使其具备相应的功能，这些修饰同样不是本申请的核酸适配体的必备条件，只是根据不同的使用条件或环境而选择进行的，在此不做具体限定。

本申请的另一面公开了本申请的核酸适配体在鲤春病毒血症病毒检测或者在制备鲤春病毒血症病毒检测试剂盒或设备中的应用。

本申请的另一面公开了一种用于鲤春病毒血症病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的核酸适配体。

可以理解，本申请的核酸适配体本身就是针对鲤春病毒血症病毒检测而研究的，当然可以将本申请的核酸适配体制成试剂盒，例如将其DNA片段制成干粉或者高浓度溶液存放于试剂盒中，以方便鲤春病毒血症病毒检测。又或者将DNA片段固定在酶标板上，以方便直接使用。可以理解，申请的试剂盒中除了含有本申请的核酸适配体以外，为了方便使用，还可以包含酶标板以及相应的试剂，如磷酸盐缓冲液PBS、磷酸盐吐温缓冲液PBST等，在此不做具体限定。

本申请的再一面公开了一种用于鲤春病毒血症病毒检测的核酸适配体的制备方法，包括合成式二所示通式的适配体库，然后通过指数富集配体系统进化技术对适配体库进行筛选，获得用于鲤春病毒血症病毒检测的核酸适配体；

式二：5’-P₁-N’-P₂-3’

其中，P₁和P₂分别为Seq>

需要说明的是，其中，指数富集配体系统进化技术是指Selective expansion ofligands by exponential enrichment，缩写SELEX，是核酸适配体筛选的常规技术，在此不做具体限定。本申请的关键在于建立了P₁和P₂分别为Seq>1和P₂的序列才是确定本申请核酸适配体的检测特异性的关键。

优选的，本申请的制备方法还包括采用富集引物对筛选获得的核酸适配体进行PCR扩增富集，富集引物的上游引物为Seq ID No.1所示序列，富集引物的下游引物为SeqID No.7所示序列，并且下游引物的5’端具有磷酸化修饰，在PCR扩增完成后，采用核酸外切酶消化带有磷酸化修饰的反义链，即获得单链的核酸适配体；

Seq ID No.7：5’-CGTCCTATCCTGAACTACTC-3’。

优选的，所述式二中，N’为40nt的随机序列。

本申请的有益效果在于：

本申请的用于鲤春病毒血症病毒检测的核酸适配体，能够特异而灵敏的检测出鲤春病毒血症病毒，为鲤春病毒血症病毒的检测提供了一种新的途径和方案。本申请的核酸适配体具有更强的实用性，与酶联免疫检测相比，成本低、稳定性好，使用更加简单方便。

附图说明

图1是本申请实施例中核酸适配体每轮筛选的回收率；

图2是本申请实施例中筛选获得的两个核酸适配体的二级结构图，其中A为核酸适配体A2的二级结构，B为核酸适配体A15的二级结构；

图3是本申请实施例中荧光PCR测定筛选获得的核酸适配体的结合回收率结果图；

图4是本申请实施例中两个核酸适配体结合SVCV后的凝胶阻滞实验结果图，其中，A为核酸适配体A2的结果图，B为核酸适配体A15的结果图；

图5是本申请实施例中两个核酸适配体病毒中和实验结果图，其中，A为核酸适配体A2与SVCV、B为仅核酸适配体A2、C为核酸适配体A15与SVCV、D为仅适配体A15、E为阳性对照、F为阴性对照。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料和方法

1.1毒株和细胞系

本例采用的SVCV A-1株由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心分离并保存。鲤鱼上皮瘤细胞(缩写EPC)细胞系由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心保存。

1.2适配体库的设计和合成

本例的适配体库具有式二所示通式，

式二：5’-P₁-N’-P₂-3’

其中，P₁和P₂分别为Seq>1和P₂是特异结合鲤春病毒血症病毒的序列，N’为随机序列由合成公司随机生成，本例具体的合成了N’为40nt的适配体库。

Seq ID No.1：5’-GGACACTCAAGGTTCATCAG-3’

Seq ID No.2：5’-GAGTAGTTCAGGATAGGACG-3’

式二：

5’-GGACACTCAAGGTTCATCAG-N’-GAGTAGTTCAGGATAGGACG-3’

与此同时，本例还设计了用于核酸适配体PCR扩增富集的富集引物对，富集引物的上游引物为Seq ID No.1所示序列，富集引物的下游引物为Seq ID No.7所示序列，并且下游引物的5’端具有磷酸化修饰。

Seq ID No.7：5’-CGTCCTATCCTGAACTACTC-3’。

本例的适配体库和富集引物对，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 SVCV的纯化

于25℃培养EPC细胞系，传代24h后接种SVCV。当细胞产生90％病变后，冻融3次，12000g 4℃离心30min，收集上清病毒悬液；对收集的上清病毒悬液进行140000g 4℃超速离心4h，去上清，沉淀用少量PBS重悬，即PBS病毒重悬液。配制30％、45％、60％的蔗糖梯度，将PBS病毒重悬液加于30％蔗糖界面上，100000g 4℃超速离心3h，收集30％与45％浓度分界处的沉淀，用适量PBS溶解，140000g 4℃超速离心4h，去上清，沉淀用适量PBS重悬，即获得纯化的SVCV。

1.4纯化SVCV量的测定

纯化SVCV的蛋白质含量测定使用改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，病毒滴度TCID50的测定使用Reed-Muench法。

1.5核酸适配体的SELEX筛选

将500ng纯化SVCV和EPC细胞碎片分别包被酶标板Corning，4℃过夜后，PBS与PBST各洗2次。将5OD约5.5nmole的适配体库溶于PBS，95℃加热10min，立即置于冰上10min。将适配体库加至EPC细胞碎片包被的孔，室温结合1h进行负筛选，去除与EPC碎片结合的核酸适配体。将负筛选的上清加至SVCV包被的孔，室温结合1h。用PBS洗涤5次后，加入蛋白酶K消化，释放出结合的核酸适配体。消化液上清使用QIAquick Nucleotide Removal Kit(QIAGEN)对核酸适配体进行回收。

对回收的核酸适配体进行10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍稀释，以各个稀释的核酸适配体为模板，使用富集引物对，对筛选的核酸适配体进行荧光PCR检测，测定其结合回收率。其中，富集引物对的下游引物为Seq>

荧光PCR反应总体系为25μL，包括：水8μL，SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ROXⅡ0.5μL，模板2μL。

反应条件为：95℃30s,然后进入40个循环95℃5s、60℃34s。并在60℃是收集荧光。

本例中，回收率按照荧光PCR的Ct值进行计算，具体的，将筛选前已知浓度的库进行10倍梯度稀释，进行荧光PCR，获得筛选前的样品的Ct值与浓度或稀释度的拟合曲线；然后对筛选回收后的样品进行荧光PCR，根据其Ct值获得其浓度或稀释度值，该值即表征本例的回收率。

1.6核酸适配体的富集

对回收的核酸适配体，使用富集引物对，进行常规PCR扩增，富集引物的下游引物为Seq ID No.7所示序列，并且下游引物的5’端具有磷酸化修饰。本例的常规PCR采用的Takara的Ex Taq及缓冲液。

反应体系为50μL，包括：水18μL，Ex Taq Mix 25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板5μL。

反应条件为：95℃2min；然后进入15个循环95℃30s、52℃30s、72℃20s；循环结束后，72℃3min。

PCR反应结束后，采用Lambda核酸外切酶，购自New England Biolabs，对PCR扩增产物进行酶切消化。

酶切消化体系为50μL包括：外切酶0.5μL，BUFFER 5μL，PCR产物25μL，水19.5μL。

在37℃30min酶切去除磷酸化修饰的反向链，即获得单链的核酸适配体。

将单链化后的核酸适配体再次用于“1.5核酸适配体的SELEX筛选”。重复筛选过程数次，逐步增加蛋白酶K消化前采用PBS洗涤的次数，直至回收率不再提高。本例具体重复进行了9次SELEX筛选。

1.7核酸适配体的单克隆与测序

对最后一轮结合后回收的核酸适配体，使用富集引物对进行常规PCR扩增，其中富集引物的下游引物为Seq ID No.7所示序列，并且下游引物的5’端没有磷酸化修饰。

反应体系为50μL包括：水18μL，Ex Taq Mix 25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板5μL。反应条件为：95℃2min；然后进入15个循环95℃30s、52℃30s、72℃20s；循环结束后，72℃3min。

将常规PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化到感受态大肠杆菌DH5α，涂布于氨苄青霉素抗性平板。挑取单克隆，按方法1.5进行结合力确认后，送华大基因进行测序。

回收的方法用的是QIAquick Nucleotide Removal Kit(QIAGEN)的。载体用的是Takara的，10μL体系，其中水3μL，Buffer 5μL，载体1μL，PCR产物1μL，16℃连接3h。转化就是与载体混匀后，42℃45s，立即置于冰上。

本例中，结合力的确认就是通过测定回收率的方法，因为回收之前是经过PBS洗涤的，所以可以认为回收回来的，就是结合在SVCV上面的。因为筛选时，到第8轮左右，结合力就上不去了，维持在一个稳定水平，可以认为库里的序列，平均结合力大致就是12×10^-4。而后来确认的序列，是克隆得来的。经过回收率的计算，发现大概也是12×10^-4，这就说明其结合力也与原先库的相当。

1.8二级结构分析

根据核酸适配体的测序结果，使用Mfold软件分析其二级结构，选取自由能ΔG最低，即结构最稳定的构象。

1.9结合力分析

根据测序结果，获得的核酸适配体由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。为验证其结合力，使用10ng合成的核酸适配体，按照“1.5核酸适配体的SELEX筛选”中记载的方法与SVCV结合、洗涤、酶消化和回收，并采用其中记载的荧光PCR测定其结合回收率。

在与SVCV结合的过程中，设置EPC细胞碎片包被孔作为阴性对照，设置BSA包被孔作为空白对照。

1.10凝胶阻滞实验

将1μg合成的核酸适配体95℃加热10min，立即置于冰上10min。分别与12μg、2.4μg、0.48μg质量梯度的SVCV室温结合1h。同时设置阴性对照12μg、2.4μg的EPC细胞碎片，和12μg BSA空白对照，与核酸适配体在室温结合1h。

室温结合1h后，采用2％琼脂糖凝胶电泳，并用SYBR Gold Nucleic Acid GelStain,Life Technology染料染色，凝胶成像仪进行观察拍照。

1.11病毒中和试验

将15μg核酸适配体95℃加热10min，立即置于冰上10min。与6.3×10³TCID50/mLSVCV室温结合1h，然后接种到传代24h的EPC细胞系。同时设置仅核酸适配体室温1h后接种传代24h的EPC细胞系的孔，设置SVCV室温1h后接种传代24h的EPC细胞系的孔作为阳性对照，设置PBS室温1h后接种传代24h的EPC细胞系的孔作为阴性对照。接种EPC细胞系后，20℃培养5天后观察病变情况。

二、结果

2.1 SVCV量的测定

采用BCA蛋白浓度测定试剂盒对纯化后的SVCV进行测定，结果显示，测得蛋白质含量为1.28mg/mL，滴度为6.3×10⁹TCID50/mL。

2.2核酸适配体的富集

核酸适配体按照“1.5核酸适配体的SELEX筛选”第一次测定的结合回收率，即第一轮回收率，经过“1.6核酸适配体的富集”后再次用于“1.5核酸适配体的SELEX筛选”测定的结合回收率即第二轮回收率，以此类推，本例具体进行了九轮回收率测定。

结果如图1所示，可见前四轮回收率增加不明显，从第五轮开始显著增加，至第八轮趋于稳定，因此选取第九轮的筛选产物进行后续的克隆测序。

2.3克隆测序和二级结构分析

本例挑取了30个单克隆，按方法1.5进行结合力确认后，选取结合力最佳的2个克隆进行测序，编号分别为A2和A15。测序结果见表1。对A2和A15两个核酸适配体的二级结构分析结果见图2，均具有多个茎环结构。

表1核酸适配体序列

名称序列(5’-3’)Seq ID No.A2GGACACTCAAGGTTCATCAGGCTCCCATGTTTTTTCCCCCTCCTCTCCCCCTGGTTCCTAGAGTAGTTCAGGATAGGACG5A15GGACACTCAAGGTTCATCAGTTACTGTTTTGGTCTTCATTGGTGCTTGGTTCGCTCTCTAGAGTAGTTCAGGATAGGACG6

表1中“GCTCCCATGTTTTTTCCCCCTCCTCTCCCCCTGGTTCCTA”即Seq ID No.3，和“TTACTGTTTTGGTCTTCATTGGTGCTTGGTTCGCTCTCTA”即Seq ID No.4是核酸适配体序列中插入的随机序列。

2.4结合力验证

本例合成了A2和A15两个核酸适配体，用于SVCV检测。对合成的A2和A15核酸适配体进行结合力验证。

结果如图3所示，图中曲线1-10依序为，浓度梯度10^-2、A2、A15、浓度梯度10^-3、浓度梯度10^-4、A15阴性对照、A2阴性对照、浓度梯度10^-5、浓度梯度10^-6、空白对照。其中浓度梯度10^-2、浓度梯度10^-3、浓度梯度10^-4、浓度梯度10^-5、浓度梯度10^-6，是指经过最后一轮筛选回收获得的核酸适配体的梯度稀释样品；A15阴性对照、A2阴性对照是指直接将A15和A2核酸适配体加入到EPC细胞碎片包被孔的样品；A2、A15是指合成的核酸适配体样品。

可见，A2和A15具有相近的结合回收率，分别为1.43×10^-3和1.11×10^-3。而阴性对照的回收率分别为2.28×10^-5和2.96×10^-5。

2.5凝胶阻滞实验

本例分别对核酸适配体A2和A15进行了凝胶阻滞实验。结果如图4所示，图中，A为核酸适配体A2的结果图，B为核酸适配体A15的结果图，A和B两个图中，泳道1、2、3分别为各自的核酸适配体与12μg、2.4μg、0.48μg质量梯度的SVCV的结果，泳道4和5为阴性对照12μg、2.4μg的EPC细胞碎片的结果，泳道6为BSA空白对照的结果；M为DL500 Marker。

结果显示，核酸适配体与SVCV结合的凝胶孔内，即泳道1和2可见亮带，且随着SVCV量的减少而减弱，而SVCV量再减少则没有亮带，即泳道3；阴性对照，即泳道4和5，以及和空白对照即泳道6，均未见发生阻滞。这说明本例的核酸适配体A2和A15能与SVCV特异结合。

2.6病毒中和实验

将本例的核酸适配体A2和A15分别进行病毒中和试验。结果如图5所示，图中A为核酸适配体A2与SVCV的观察结果图、B为仅接种核酸适配体A2到EPC细胞系的观察结果图、C为核酸适配体A15与SVCV接种到EPC细胞系的观察结果图、D为仅适配体A15接种到EPC细胞系的观察结果图、E为SVCV接种到EPC细胞系的阳性对照观察结果图、F为阴性对照。

结果显示，仅接毒SVCV的阳性对照孔，即E图，出现明显的致细胞病变效应(缩写CPE)；SVCV与核酸适配体A2孵育后再接种，未出现明显CPE，即A图；SVCV与A15孵育的孔出现微弱CPE，即C图。而仅加入核酸适配体A2和A15的孔均未见对EPC细胞产生毒性，即B图和D图；说明A2和A15对SVCV具有中和以及抑制作用，并且，本例的A2和A15两个核酸适配体对细胞均无毒性。

核酸适配体由于其具有一定的空间构象，具有和靶物质结合的能力。本例运用SELEX筛选方法，首次筛选出针对SVCV的两个核酸适配体A2和A15，并且，都具备理想的结合能力。核酸适配体的筛选重要的一步是靶物质的固定化，目前许多文献主要采取标签化磁珠结合表达蛋白的方法；而本例采取酶标板包被的方法，靶物质是纯化后的全病毒，全病毒相比表达的蛋白，抗原空间构象更准确，提高了筛选的成功率；而酶标板具有对核酸吸附低、能吸附无标签蛋白、以及便于洗涤等优点。当然，这也可能导致杂蛋白的吸附，因此本例每一轮筛选都加入了负筛选，以保证及时去除非特异性的核酸适配体。

本例采用了三种不同原理的试验方法，对筛选出的核酸适配体进行验证。荧光PCR的方法通过测定回收率来验证其结合力，这与SELEX筛选过程方法一致，而测定的回收率也与SELEX最后3轮相近，说明本例筛选获得的核酸适配体的结合能力与预期相符。凝胶阻滞是测试核酸蛋白质相互作用的方法，也可用于验证适配体结合力，本例的凝胶阻滞结果说明，筛选获得的A2和A15两种核酸适配体均能与SVCV相结合，引起一定量核酸在凝胶孔中阻滞，而且随着SVCV量的梯度减少而减弱，存在一定比例关系。本例的病毒中和实验结果说明，本例筛选获得的两个核酸适配体能对SVCV产生抑制，而不对正常细胞产生毒性，佐证了核酸适配体能和SVCV相结合。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。