STED超分辨显微技术中损耗光斑的高质量重建方法

摘要

本发明公开了一种STED超分辨显微技术中损耗光斑的高质量重建方法。不加载样品光束经过均一相位空间光调制后被物镜聚焦，在焦平面得理想损耗光斑；加载样品光束经过均一相位空间光调制后被物镜聚焦，在位于样品内部的焦平面得畸变损耗光斑；将空间光调制器的像素点分区，各分区加载不同的相位值，得到一系列需校正损耗光斑，接着与理想损耗光斑进行互相关计算和处理，得到各分区的相位加载最佳值；各分区经过多次迭代处理后完成样品内部损耗光斑的高质量重建。本发明能重建有损耗空心光斑，能在大深度下得到完整而良好的损耗光斑，扩展了受激辐射淬灭显微技术的应用范围，提高了系统成像深度，提升了系统分辨率与信噪比并优化成像质量。

说明书

技术领域

本发明属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种STED超分辨显微技术中损耗光斑的高质量光学重建方法，以实现厚生物组织样本或者其他散射介质条件下的超分辨显微成像。

背景技术

超分辨显微技术的诞生从原理上打破了原有光学远场衍射极限对光学系统极限分辨率的限制，能够观察到分子尺度的细节，实现了分辨率达几十纳米的细胞成像。

受激发射损耗显微成像技术STED由Stefan Hell教授发明的，一种通过焦点调制从而获得超分辨成像的方法，因而获得2014年诺贝尔化学奖。根据受激辐射淬灭消光能力、损耗光光强存在着非线性关系，利用受激福射选择性消耗边缘区域内的激发态焚光分子，抑制其发光，从而压缩的大小。

光学显微成像技术为生物医学带来了里程碑式的进步。然而生物组织不是成像的理想结构，因为它们光学性质的不均匀性严重地影响了成像质量。当光线经过光学系统和样本时，理想的平面波前或球面波前将会引入扭曲的畸变，理想路径的任何偏离都会导致光学畸变。光在传播过程中发生的畸变，会降低信噪比与分辨率，使成像质量降低。而且随着成像深度的增加，分辨率迅速恶化。这些问题一直困扰着光学工作者。

深层的高分辨率成像技术已经成为21世纪发展的最迅速和热门的科学技术。

自适应光学技术最早被用于天体物理。当用望远镜观察遥远的天体时，大气湍流会造成光学畸变，影响成像质量。应用自适应光学技术的望远镜可以很好地解决这个问题。利用波前传感器可以实时对畸变的波前进行探测，然后通过变形镜、空间光调制器等光学校正系统对畸变进行补偿。最终能够很好地对天体进行观测。

现在自适应光学技术逐步应用于超分辨显微成像，以校正生物样品深层成像时的光学畸变。

受到像差和散射的影响，传统STED显微技术中，如何对样品内部深层成像时保持超分辨已经成为一个难题。利用自适应光学技术来纠正较厚生物组织样品成像时出现的光学畸变现象可以极大改善组织成像质量。

因此研究将自适应方法运用于受激辐射淬灭(STED)显微技术中损耗光斑由散射带来的形状变化及位置变化，并在此基础上验证该技术的可行性与可靠性就显得尤为重要。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种STED超分辨显微技术中损耗光斑的高质量重建方法，以实现厚生物组织样本或者散射介质条件下的超分辨光学显微成像。本发明应用于有一定尺寸大小的损耗空心光斑，在大深度条件下得到完整而良好的损耗光斑，可用于在活体、大深度条件下实现对损耗光斑由散射带来的形状变化及位置变化的校正。

本发明采用的技术方案包括以下步骤：

1)不加载样品时，光束先经过均一相位的空间光调制器透射，再经过2π涡旋相位板透射，然后经过物镜聚焦，在焦平面位置得到理想损耗光斑；

2)加载样品时，光束先经过均一相位的空间光调制器透射，再经过2π涡旋相位板透射，然后经过物镜聚焦，在位于散射介质内部的焦平面位置处得到畸变损耗光斑；

3)光束经过加载相位的空间光调制器透射，再经过2π涡旋相位板透射，然后经过物镜聚焦，在位于散射介质内部的焦平面位置处得到需校正损耗光斑，将需校正损耗光斑与步骤1)的理想损耗光斑进行互相关计算和处理；

4)重复步骤3)将光束经过不同加载相位的空间光调制器进行多次处理，完成校正重建。

所述步骤4)具体是指：

4.1)将空间光调制器的像素点以n×n方式均匀分区，如12×12，每个分区包含i×i个像素点。光束经过针对分区相位调制后的空间光调制器透射，再经过2π涡旋相位板透射，然后经过物镜聚焦，在位于散射介质内部的焦平面位置处得到需校正损耗光斑；

4.2)将得到的需校正损耗光斑与理想损耗光斑进行互相关计算，得到m个相关系数，如m＝100；

4.3)记录相关系数最大时分区的相位值，并以该相位值固定赋予到所对应分区上；

4.4)空间光调制器从第一个分区开始到最后一个分区重复上述步骤，每个分区依次进行相位变化，完成多次，获得最终校正后的光斑，实现高质量重建。

所述步骤4.1)中空间光调制器是采用以下方式调制：将一分区内所有像素点从2π/m到2π进行相位值的依次间隔变化，变化间隔为2π/m，其他分区的相位保持不变，每个相位值下进行一次，从而获得一组需校正损耗光斑。

所述的散射介质采用活体生物组织、离体生物组织、毛玻璃和带非荧光小球的琼脂。

本发明的工作原理如下：

本发明对STED超分辨显微技术中损耗光斑进行高质量重建，通过理想损耗光斑与需校正损耗光斑进行互相关计算，利用两幅图互相关系数最大作为调制信号，调整空间光调制器相位，使得需校正损耗光斑与理想损耗光斑拟合。并进行多次迭代优化，达到损耗光斑的最佳高质量重建效果。

本发明的有益效果是：

本发明能重建有一定尺寸大小的损耗空心光斑，能够在大深度下得到完整而良好的损耗光斑，扩展了受激辐射淬灭(STED)显微技术的应用范围，提高系统的分辨率与信噪比，优化成像质量。

本发明高质量的成像指的是经过校正的空心光斑与理想空心光斑的互相关系数和畸变空心光斑与理想空心光斑的互相关系数相比得到了提升，从而提高了系统的分辨率与信噪比，优化了成像质量。

附图说明

图1为本发明方法的示意图；

图2为理想损耗光斑图；

图3为经过散射介质的畸变损耗光斑图；

图4为空间光调制器n×n均匀分区方式示意图；

图5为经过第一次校正的损耗光斑图；

图6为经过第二次校正的损耗光斑图；

图7为经过第三次校正的损耗光斑图；

表1为n＝12，m＝100情况下第一次校正第66个分区加载不同相位时得到的互相关系数；

表2为未进行矫正与第1.2.3次校正完成后的空心光斑与理想空心光斑的互相关系数。

图中：空间光调制器1、2π涡旋相位板2、物镜3、散射介质4和物镜焦平面5。

具体实施方式

下面结合附图来详细说明本发明。

本发明的实施例如下：

如图1所示，本发明实施采用的光路系统包括空间光调制器1、2π涡旋相位板2、物镜3、散射介质4和物镜焦平面5，空间光调制器1、2π涡旋相位板2和物镜3同轴依次布置，物镜焦平面5位于散射介质4内部，散射介质为鼠脑。

具体步骤如下：

(1)不加载样品时，光束先经过均一相位的空间光调制器1透射，再经过2π涡旋相位板2透射，然后经过物镜3聚焦，在焦平面位置5得到理想损耗光斑，如图2所示；

(2)加载样品时，光束先经过均一相位的空间光调制器1透射，再经过2π涡旋相位板2透射，然后经过物镜3聚焦，在位于散射介质鼠脑4内部的焦平面位置5处得到畸变损耗光斑，如图3所示；

(3)将空间光调制器1进行分区，如图4所示，第一个分区的变化范围为2π/m～2π，变化间隔为2π/m，其他分区相位保持不变；

光束先经过加载相位的空间光调制器1透射，再经过2π涡旋相位板2透射，然后经过物镜3聚焦，在位于散射介质4内部的焦平面位置5处得到需校正损耗光斑；

(4)将理想损耗光斑与需校正损耗光斑进行互相关计算，得到m个相关系数；

(5)记录相关系数最大时第一个分区的相位值，并将该相位值固定；

(6)第一个分区固定相位值后，剩余每个分区依次按照步骤(3)的方式进行相位变化，每次处理时其他固定的相位值保持不变，然后重复步骤(4)和(5)完成一次校正；n＝12，m＝100情况下第一次校正第66个分区加载不同相位时得到的互相关系数如表1所示；第一次校正结果如图5所示，图中可见损耗光斑开始重建；

表1实施例第一次校正第66个分区加载不同相位时得到的互相关系数

相位值互相关系数相位值互相关系数相位值互相关系数1*2π/1000.762041*2π/1000.761881*2π/1000.76142*2π/1000.762042*2π/1000.761882*2π/1000.76143*2π/1000.762043*2π/1000.761883*2π/1000.76144*2π/1000.762044*2π/1000.761884*2π/1000.76145*2π/1000.762045*2π/1000.761885*2π/1000.76146*2π/1000.762046*2π/1000.761886*2π/1000.76137*2π/1000.762047*2π/1000.761887*2π/1000.76138*2π/1000.762048*2π/1000.761888*2π/1000.76139*2π/1000.761949*2π/1000.761889*2π/1000.761310*2π/1000.761950*2π/1000.761890*2π/1000.761411*2π/1000.761951*2π/1000.761891*2π/1000.761412*2π/1000.761952*2π/1000.761892*2π/1000.761513*2π/1000.761953*2π/1000.761893*2π/1000.761714*2π/1000.761954*2π/1000.761894*2π/1000.761915*2π/1000.761955*2π/1000.761895*2π/1000.762416*2π/1000.761956*2π/1000.761896*2π/1000.763317*2π/1000.761957*2π/1000.761797*2π/1000.765018*2π/1000.761958*2π/1000.761798*2π/1000.768419*2π/1000.761959*2π/1000.761799*2π/1000.775320*2π/1000.761960*2π/1000.76172π0.762221*2π/1000.761961*2π/1000.761722*2π/1000.761962*2π/1000.761723*2π/1000.761963*2π/1000.761724*2π/1000.761964*2π/1000.761725*2π/1000.761965*2π/1000.761726*2π/1000.761966*2π/1000.761727*2π/1000.761967*2π/1000.761628*2π/1000.761968*2π/1000.761629*2π/1000.761969*2π/1000.761630*2π/1000.761970*2π/1000.761631*2π/1000.761971*2π/1000.761632*2π/1000.761972*2π/1000.761633*2π/1000.761973*2π/1000.761634*2π/1000.761974*2π/1000.761635*2π/1000.761975*2π/1000.761536*2π/1000.761976*2π/1000.761537*2π/1000.761977*2π/1000.761538*2π/1000.761978*2π/1000.761539*2π/1000.761979*2π/1000.761540*2π/1000.761880*2π/1000.7615

(8)重复步骤(3)-(7)，进行第二次校正，结果如图6所示，图中可见损耗光斑形状位置大致复原，呈圆环状；

再重复步骤(3)-(7)，进行第三次校正，结果如图7所示，图中可见损耗光斑进一步复原，中心圆环形状位置进一步优化。

随着校正次数的增加，需校正损耗光斑与理想损耗光斑的拟合程度越来越高，使系统达到最佳高质量的重建，具体互相关系数可见表2。

表2实施例空心光斑与理想空心光斑的互相关系数

互相关系数畸变空心光斑与理想空心光斑0.6277第一次校正空心光斑与理想空心光斑0.8661第二次校正空心光斑与理想空心光斑0.9324第三次校正空心光斑与理想空心光斑0.9482

由此可见，本发明能重建有一定尺寸大小的损耗空心光斑，能够在大深度下得到完整而良好的损耗光斑，扩展了受激辐射淬灭(STED)显微技术的应用范围，提高系统的分辨率与信噪比，具有高质量的成像。