一种改良的人体液显色法真菌1,3‑β‑D‑葡聚糖检测试剂盒及其应用方法

摘要

本发明涉及一种改良的人体液显色法真菌1，3‑β‑D‑葡聚糖检测试剂盒，包括反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、无菌水、标准品及质控品。反应主剂以东方鲎或美洲鲎血细胞裂解液为主要原料，含有G因子、B因子、C因子、凝固蛋白及多肽显色基质。所述反应主剂采用新的制备工艺，具有稳定性高和批间、批内差异小的特性；主剂复溶液采用新的配方，与反应主剂混合后，可有效的屏蔽鲎试剂内毒素反应支路。试剂盒使用酶标仪进行速率法酶动力学检测法，检测速度快，而且抗干扰性强，此外制备工艺简单、产品稳定性更强、特异性及灵敏度更高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒及其应用。

背景技术

深部真菌感染又称侵袭性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)。在过去的二十年里，随着大量广谱抗生素的应用、骨髓器官移植的开展、抗肿瘤药物和糖皮质激素及免疫抑制剂的应用，导管介入治疗，特别是艾滋病的流行，象念珠菌血症和系统性曲霉菌病等深部真菌感染的发病率逐渐增多，而且深部真菌感染患者的病理特征不明显，其传统诊断方法假阴性率高、诊断周期长，现有快诊试剂的稳定性和重复性无法满足临床需求，不能及时的为临床提供准确的诊断依据，这些因素都造成了系统性真菌感染的诊断、预防和治疗非常困难，相对应的与这些感染相关的死亡率也非常高，这种状况日益引起医学界的重视。因此必须对深部真菌感染的诊治有了一定的认识，了解现有诊断方法的不足，开发出一种新的快速、准确、灵敏诊断方法或试剂，才能增加早期诊断的及时性和正确性，从而减少误诊率、漏诊率、死亡率。

研究表明，1，3-β-D葡聚糖是除接合菌外，几乎所有的酵母和丝状真菌细胞壁中的组成成分。当真菌侵入人体血液或组织后，引起免疫应答反应，通过中性粒细胞和吞噬细胞的作用，人体体液中的1，3-β-D葡聚糖含量升高，在人体的定植真菌或浅部真菌感染中，均无此现象。因此，1，3-β-D-葡聚糖在血液及无菌体液中的含量成为国际公认的侵袭性真菌感染诊断标准。

申请号为201210338802.4的中国发明专利“一种人体液真菌(1，3)-β-D 葡聚糖检测试剂盒及其应用方法”中，公开了一种浊度法检测真菌(1，3)-β-D葡聚糖的试剂盒。然而，浊度法检测1，3-β-D葡聚糖在侵袭性真菌检测发展的二十年来被广泛应用，属于传统检测方法，此方法检测灵敏度较低，易受样本及药物引起的非特异性浊度干扰，引起假阳性或假阴性，检测准确度很难满足临床要求。

公开日为2015年11月4日，申请号为105021817A的中国发明专利申请“一种人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒”公开了一种检测真菌1，3-β-D-葡聚糖的试剂盒。然而，其反应主剂制备方法为传统制备方法，无法消除由鲎血细胞内含物质的活性差异导致的试剂批间差异；其反应主剂中添加的B、C因子抑制剂可抑制G因子外的旁路反应，但与主剂复溶液混合后，在Mg²⁺参与下，其反应体系中主剂会失去对内毒素反应的抑制作用，影响试剂的稳定性和检测的准确性，很难满足临床要求。

申请号为201420382343.4的中国实用新型专利“一种偶氮化终点显色法真菌葡聚糖检测试剂盒”中，公开了一种偶氮化终点显色法真菌葡聚糖检测试剂盒。在其使用时需样本处理、添加三种偶氮化试剂、添加终止剂，反应线路长，易受到人为操作干扰，影响检测的准确度，不易于未来的自动化应用。

申请号为201420382432.9的中国实用新型专利“一种动态显色法真菌葡聚糖检测鲎试剂盒”中，公开了一种动态显色法真菌葡聚糖检测鲎试剂盒。其样本处理方式使用传统的加热稀释法，无法完全去除样本中的干扰因素，无法完全释放样本中的1，3-β-D-葡聚糖，并且使用加热稀释法处理后的样本与反应试剂混合后，使反应体系的液体粘度增加，易发生局部反应，影响检测结果。另外，其检测方法使用多肽显色基质作为反应指示物，增加了检测的灵敏度，但也同时放大了由于样本处理不彻底而产生的干扰信号，影响检测的准确度，很难满足临床要求。

WO2001/052905A1公开了用于检测极小量β-1，3-葡聚糖的组合物，其制 备方法以及检测β-1，3-葡聚糖的诊断试剂盒。本发明的组合物在钙离子存在下通过β-1，3-葡聚糖显示酚氧化酶活性，使用该组合物时，从样本收集样品，将该组合物和钙离子加入样品中，通过测定酚氧化酶而检测β-1，3-葡聚糖。然而，该方法精度不令人满意。

“(1，3)-β-D-葡聚糖检测对深部真菌感染的诊断意义”，蒋伟等，实用预防医学，2014年1期，探讨血浆(1，3)-β-D-葡聚糖[(1，3)-β-D-Glucan，BDG]检测对深部真菌感染的诊断价值和方法，回顾性分析430例疑似病例的BDG结果及其临床特征，应用MB-80微生物动态快速检测系统及GKT25M Set动态真菌检测试剂盒定量检测血浆中BDG的含量，结合患者血液、痰或中段尿标本的真菌培养，用统计学方法计算BDG试验在真菌感染早期诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，同时连续检测血清BDG浓度变化，观察其与疾病进展和预后间的关系。然而，该方法操作比较复杂且检测准确度低。

由上述现有技术可知，本领域需要一种兼具有工艺简单、稳定性高、灵敏度高、准确度高等多项优点的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒。

发明内容

本发明为提供一种生产工艺简单、设计合理、稳定性高、灵敏度高、准确度高，可匹配半自动、全自动检测分析仪开发和应用的一种改良的人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，包括：反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、无菌水、标准品及质控品，反应主剂以东方鲎或美洲鲎血细胞裂解液为主要原料制得。

优选地，所述反应主剂含有G因子、B因子、C因子、凝固蛋白及多肽显色基质。

进一步的，所述反应主剂通过包括以下步骤的方法制得：

(1)鲎细胞裂解物混批：将鲎细胞裂解液置于4℃环境，解冻8～14小时，将鲎细胞裂解物(例如至少2.5kg)混合，并在4℃环境下，充分搅拌5～30分钟；

(2)鲎细胞裂解物乳化：将(1)中充分搅拌后的鲎细胞裂解物，在4℃环境下，使用匀浆机匀浆，匀浆机转速为5000rpm～18000rpm，匀浆时间控制在20分钟之内，使鲎细胞裂解物充分乳化，即得鲎细胞裂解物乳化液；

(3)鲎细胞裂解液分装：将(2)中所得乳化液，在4℃温度下，以8000～12000rpm的速度离心15-30分钟，取上清液，分装备用，即为鲎细胞裂解液；

(4)鲎细胞裂解液提纯：向(3)中鲎细胞裂解液中迅速加入20％-50％的氯仿(体积比，基于鲎细胞裂解液体积计)，在4℃环境下，充分搅拌1～5分钟，再在4℃温度下，以8000～12000rpm的速度离心15-30分钟，取上清液；

(5)制剂：向步骤(4)所得上清液中添加多肽显色基质，每毫升上清液中含有0.3～1.0mg多肽显色基质；4℃环境下，充分搅拌5～15分钟，冷冻真空干燥，即得反应主剂。

进一步的，所述主剂复溶液可以为0.05～1M的Tris-HCl缓冲液，其pH为7.0～8.0。

进一步的，所述样本处理液可以为0.05～1.5M的KOH溶液和0.2～2.5M的KCl溶液的等体积混合溶液。

进一步的，所述无菌水可以为注射用水或超纯水。

进一步的，所述标准品制备方法可以为：将1，3-β-D-葡聚糖纯品添加至含2-10％(质量比)赋型剂的溶液中，其赋型剂为甘氨酸与异丙醇比例1∶3～9∶1(质量比)的混合物，充分搅拌5～30分钟，冷冻真空干燥。

进一步的，所述质控品制备方法可以为：将1，3-β-D-葡聚糖纯品和牛血清添加至含2-10％(质量比)赋型剂的溶液中，其赋型剂为甘氨酸与异丙醇 比例1∶3～9∶1(质量比)的混合物，充分搅拌5～30分钟，冷冻真空干燥。

进一步的，提供了所述一种改良的人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒使用酶标仪进行速率法酶动力学检测法，可在40分钟内完成96个检测反应，适用于的半自动、全自动检测分析仪的开发及应用。

进一步的，本发明还提供了所述一种改良的人体液的显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的用途，其主要应用在人血液及其他人体液样本的1，3-β-D-葡聚糖检测。

与现有技术相比，本发明具有(不限于)以下突出的技术效果：

(1)针对鲎细胞原料活性差异性较大，生产工艺复杂的公知问题，在发明的真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂的反应主剂及其制备方法，采用混批制备工艺，无需另外添加促活剂和B、C因子抑制剂，产品生产工艺简单，稳定性强，批内、批间差异极小。

(2)针对应用鲎试剂检测原理对1，3-β-D-葡聚糖检测时，内毒素旁路反应干扰的公知问题，本发明提供了一种特别适合真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂的有效主剂复溶液，其与(1)中所述的反应主剂混合，可有效屏蔽旁路反应干扰。换言之，所述反应主剂与主剂复溶液之间具有良好的匹配性和协同性，通过发挥协同作用而取得良好的效果。

(3)本发明人还发现，应用鲎试剂检测原理对人体液样本检测时，样本处理无法完全去除样本中的干扰因素，无法完全释放样本中的1，3-β-D-葡聚糖，影响检测准确度的公知技术问题，针对本领域普遍存在的该问题，本发明创造性地采用碱处理方法，使得可有效处理人体液样本，大幅度提高检测的重复性及准确性。

(4)针对1，3-β-D-葡聚糖标准品溶解后效价易降低的本领域公知的技术问题，本发明人经过深入研究和大量实验，发明了一种与所述真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂体系匹配的1，3-β-D-葡聚糖标准品及其制备方法，采用特定比例的混合赋型剂，标准品效价极稳定，这样的效果是先前所未预料到的。

(5)针对1，3-β-D-葡聚糖质控品溶解后效价易降低，而且检测效价结果变动范围较大的本领域公知技术问题，本发明人发明了一种与所述真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂体系匹配的1，3-β-D-葡聚糖质控品及其制备方法，采用特定比例的混合赋型剂，质控品效价极稳定。

(6)本发明人还发现，真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂应用时，检测易受非特异性浊度影响，检测通量小，操作路线长，易受到由人为及环境因素影响而导致检测结果不准确，检测体系发展空间有限，针对发现的技术问题，经过大量实验和筛选，在本发明中所述真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒采用酶切多肽显色基质显色，使用酶标仪进行速率法酶动力学检测的方法，使得可在40分钟内完成96个检测反应，适用于的半自动、全自动检测分析仪的开发及应用。

附图说明

图1为根据本发明的改良的1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒标准曲线；

具体实施方式

为进一步说明本发明内容、优点和有益效果，列举以下实施例，并结合附图说明：

实施例1：改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒的生产制造。

所述改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒，包括：反应主剂、主剂复溶液、样本处理液、无菌水、标准品及质控品。

所述反应主剂的制备方法包括以下步骤：

(1)鲎细胞裂解物混批：将鲎细胞裂解液置于4℃环境，解冻10小时，将至少2.5kg的鲎细胞裂解物混合，并在4℃环境下，充分搅拌20分钟；

(2)鲎细胞裂解物乳化：将(1)中充分搅拌后的鲎细胞裂解物，在4 ℃环境下，使用匀浆机匀浆，匀浆机转速为10000rpm，匀浆时间控制在20分钟之内，使鲎细胞裂解物充分乳化，即得鲎细胞裂解物乳化液；

(3)鲎细胞裂解液分装：将(2)中所得乳化液，4℃，10000rpm离心20分钟，取上清液，分装备用，即为鲎细胞裂解液；

(4)鲎细胞裂解液提纯：向(3)中鲎细胞裂解液中迅速加入30％的氯仿(体积占比)，4℃环境下，充分搅拌3分钟，4℃，10000rpm下离心20分钟，取上清液；

(5)制剂：向步骤(4)所得上清液中添加多肽显色基质，每毫升上清液中含有0.5mg多肽显色基质；4℃环境下，充分搅拌10分钟，冷冻真空干燥，即得反应主剂。

所述主剂复溶液的制备方法为：按配方用量称取Tris盐，置于配液容器内，加无菌水至Tris盐浓度为0.5M，充分搅拌，用浓盐酸调节pH值至pH7.5，滤菌分装。

所述样本处理液的制备方法为：按配方用量称取KOH，置于配液容器内，加无菌水至KOH浓度为0.5M，充分搅拌，滤菌分装；按配方用量称取KCl，置于配液容器内，加无菌水至KCl浓度为1.0M，充分搅拌，滤菌分装。

所述无菌水的制备方法为：将注射用水或超纯水滤菌分装为20mL每瓶。

所述标准品制备方法为：将1，3-β-D-葡聚糖纯品添加至含8％(质量比)赋型剂的溶液中，其赋型剂为甘氨酸与异丙醇比例1∶1(质量比)的混合物，充分搅拌520分钟，滤菌分装，冷冻真空干燥。

所述质控品制备方法为：将1，3-β-D-葡聚糖纯品和牛血清添加至含5％(质量比)赋型剂的溶液中，其赋型剂为甘氨酸与异丙醇比例1∶1(质量比)的混合物，充分搅拌20分钟，滤菌分装，冷冻真空干燥。

实施例2：一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒检测人血液样本中1，3-β-D-葡聚糖含量的应用。

所述试剂盒得自实施例1。所述试剂盒应用的实现步骤包括：标准曲线制作、阳性血清样本的制备、样本处理、添加反应主剂、上机检测，具体步骤如下：

1.标准曲线的制作：

(1)标准溶液的准备

取1支试剂盒标准品，加入无菌水溶解，配制成200pg/mL 1，3-β-D-葡聚糖标准品溶液，漩涡混合不少于30秒，将其用无菌水梯度稀释至100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.25pg/mL、3.125pg/mL，使用无菌水为空白对照。

试剂盒对样本处理时进行了5倍稀释，所以制备标准曲线时，标准溶液对应的样本浓度值需乘以5，分别为1000pg/mL、500pg/mL、250pg/rmL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.625pg/mL。

(2)复溶反应主剂

取1支试剂盒反应主剂，以反应主剂规格为3.2mL为例，先加入1.6mL无菌水，轻微震荡，待其完全溶解后，加入1.6mL主剂复溶液，震荡混匀，备用。

(3)添加

向微孔板中每孔加入50μL标准品溶液，阴性对照孔加入50μL无菌水，再加入100μL复溶后反应主剂。

(4)上机检测

使用酶标仪进行速率法酶动力学检测，反应时间为40min。

反应结束后，将所测得的反应浓度值(x)与反应速率(y)进行线性回归分析(表1)，计算标准曲线的线性系数(r)：

表1：糖标准品测试数据

根据上述数据拟合标准曲线：y＝0.0155x-0.0447，r＝0.999，符合实验标准要求，标准曲线制作有效(图1)。

2.检测样本的制备

(1)阳性血清样本的制备

用健康人血清溶解1，3-β-D-葡聚糖标准品，配制成浓度为150pg/mL的血清样本，备用。

(2)质控样本的制备

取1支试剂盒质控品，以试剂盒质控品规格为1.5mL为例，加入1.5mL无菌水复溶质控，备用。

3.样本处理

向微孔板中加入血液阳性血清样本、健康人血清样本和质控样本，每孔加样量为10μL，然后加入40μL样本处理液，振荡混匀10s，37℃温浴10min。

4.添加反应主剂

取1支试剂盒反应主剂，以反应主剂规格为3.2mL为例，先加入1.6mL无菌水，轻微震荡，待其完全溶解后，加入1.6mL主剂复溶液，震荡混匀， 每检测孔中加入100μL反应主剂。

5.上机检测

使用酶标仪进行速率法酶动力学检测，反应时间为40min。

6.实验结果分析

将血清样本及质控样本的反应速率值代入1中的标准曲线，检测结果(如表2所示)与试验预期相符，试剂盒质控品参考范围为125～141pg/mL，试剂受控，本次检测结果有效。

表2：样本检测结果

实施例3：一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒检测准确度的验证。

所述试剂盒的检测准确度验证的实现步骤包括：制备试验血清样本、上机检测、统计分析结果。

1.制备试验血清样本

(1)高值血清样本

用健康人血清溶解1，3-β-D-葡聚糖标准品，配制成浓度为500pg/mL的血清样本，备用，即为样本A。

(2)低值血清样本

用健康人血清溶解1，3-β-D-葡聚糖标准品，配制成浓度为50pg/mL的血清样本，备用，即为样本B。

(3)混合样本

将样本A和样本B按体积比例为1∶9混合，备用，即为样本C。

2.上机检测

使用所述试剂盒对样本A、B、C进行检测，检测方法同实施例二中所述样本方法，重复检测三次得样本A、B、C浓度的平均值，按公式(1)计算回收率

式中：

v：样品A的体积；

v₀：样品B的体积；

C：样品B加入样本A后的检测浓度；

C₀：样品B的浓度；

C_s：样品A的浓度。

3.统计分析结果

表3：试剂盒检测准确度的验证检测结果

将表3检测结果代入公式(1)，得

可见，所述试剂盒检测人血清样本时，回收率为105.9％，检测准确度高。

实施例4：一种改良的人体液显色法真菌1，3-β-D-葡聚糖检测试剂盒批间差的验证。

所述试剂盒的准确度批间差验证的实现步骤包括：制备试验血清样本、上机检测、统计分析结果。

1.制备试验血清样本

用健康人血清溶解1，3-β-D-葡聚糖标准品，配制成浓度为200pg/mL的血清样本，备用。

2.上机检测

分别使用3个不同生产批号的所述试剂盒检测1中的血清样品，每个批次重复检测10次，按公式(2)计算30次检测的变异系数。

$>\mathrm{CV}=s/\stackrel{-}{x}\times 100\%...\left(2\right)$>

式中：

CV：变异系数；

S：标准差；

：测量值的均值。

3.统计分析结果

表4：试剂盒批间差的验证检测结果

由表4结果可得，所述三个不同批次试剂盒检测结果均值标准差S＝0.63，代入公式(2)，得：

CV＝0.63/201.32×100％＝0.31％

由上述数据可以清楚地看出，所述试剂盒批间检测差异为0.31％，批间差极小，并且具有非常高的检测重复性及准确性。

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