白藜芦醇评价抗氧自由基代谢的方法及其检测

摘要

本发明涉及白藜芦醇评价抗氧自由基代谢的方法及其检测。具体地说，本发明涉及白藜芦醇在制备评价抗氧自由基代谢的试剂中的用途；本发明还涉及白藜芦醇评价抗氧自由基代谢的方法；本发明还涉及对白藜芦醇进行质量控制的方法，该方法包括使用高效液相色谱法测定白藜芦醇供试品中白藜芦醇的含量，以及对供试品中作为杂质的白藜芦醇苷进行含量测定。本发明各个方面呈现本发明说明书所述有益的技术效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种可用于白藜芦醇抗氧化机制作用的评价方法。

背景技术

衰老的自由基理论认为物质在人体内代谢和产生能量都需要氧参与，但是氧气在代谢过程中会产生各种自由基。

氧自由基是由氧气分子衍生的一系列自由基。自由基是含有一个不成对电子的分子或原子团，如一氧化氮自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和脂类自由基。由于自由基外层有一个不成对的电子，能量高，非常活跃，容易与其他物质发生反应。低浓度的氧自由基在体内具有重要的生物功能，但伴随氧自由基逐步积累，细胞膜则容易受到其攻击，甚至可能损伤细胞成分导致疾病的发生。由此，无论从心脑血管疾病到癌症，自由基和几种主要疾病特别是衰老和老年退行性疾病(如老年痴呆症和帕金森氏症等)都有密切关系。

白藜芦醇，其英文名：Resveratrol，化学名：E-3,5,4’-三羟基二苯乙烯，其化学结构式是：

白藜芦醇是一种非黄酮类的多酚化合物，其化学结构存在顺式和反式两种异构体，自然界中白藜芦醇主要以反式形式存在，研究表明反式异构体的生理活性强于顺式异构体。白藜芦醇含有三个酚羟基，特别是其中的4-对位羟基是其抗氧化能力的主要来源，其邻二羟基和乙烯基的存在则有助于形成共轭体系，稳定自由基。这样的分子结构使得其具有很强的还原性。白藜芦醇可以通过与自由基反应，来降低自由基活性，阻止自由基进一步链式反应，达到清除自由基的效果；同时，白藜芦醇能够保持谷胱甘肽的还原状态，从而抑制氧化自由基的生产，最终达到抗氧化的功能。

因此，白藜芦醇能保护细胞和器官免受氧化侵害，阻止胆固醇在血管内的沉淀，免于斑点、皱纹、肌肤松弛的困扰，具有预防肿瘤，心血管疾病，抗衰老和抗菌的生理活性。

尽管白藜芦醇具有抗氧自由基代谢的功能，然而本领域仍然期待有新的有效的抗氧自由基代谢的评价方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的有效的抗氧自由基代谢的评价方法。本发明的另一目的是提供一种对白藜芦醇进行质量检测的方法。已经出人意料地发现，通过本发明，可以使用白藜芦醇有效地评价抗氧自由基代谢。本发明基于此发现而得以完成。

本发明第一方面提供了白藜芦醇在制备评价抗氧自由基代谢的试剂中的用途。

本发明第二方面提供了白藜芦醇评价抗氧自由基代谢的方法。

根据本发明第二方面的方法，该方法包括以下试验项目以评价白藜芦醇抗氧自由基代谢的效果：过氧化氢对大肠杆菌生长的影响、白藜芦醇对大肠杆菌生长的保护作用、发酵罐中的规范实验、氧自由基对大肠杆菌代谢流的影响、高浓度白藜芦醇对大肠杆菌生长的抑制。

进一步的，本发明第三方面提供了一种对白藜芦醇进行质量控制的方法，该方法包括使用高效液相色谱法测定白藜芦醇供试品中白藜芦醇的含量，该方法包括如下操作：

(1)中国药典2015年版四部第59所第0512节所载的高效液相色谱法中的规范进行测定；

(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.05％酒石酸水溶液以体积比30：70为流动相，检测波长为306nm；

取系统适用性试验溶液测定，理论板数按白藜芦醇峰计应不低于3000，白藜芦醇与其最接近的杂质峰之间的分离度应大于1.5，白藜芦醇与白藜芦醇苷峰之间的分离度应大于3.0；

(3)溶液制备：

取白藜芦醇供试品适量，加流动相溶解并稀释，制成每1ml溶液中含有白藜芦醇0.2mg的溶液，过滤，作为供试品溶液(即，200μg/ml)；

精密量取供试品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流动相稀释刻度，摇匀，制成含白藜芦醇浓度为2μg/ml的溶液，作为对照溶液(即，2μg/ml)；

精密称取白藜芦醇对照品、白藜芦醇苷对照品适量，用流动相溶解并制成两种物质浓度均为分别为200μg/ml和2μg/ml的溶液，作为系统适用性试验溶液(即，200μg/ml+2μg/ml)；

精密称取白藜芦醇对照品适量，用流动相溶解并制成每1ml溶液中含有白藜芦醇0.2mg的溶液，过滤，作为对照品溶液；

(4)测定：

精密量取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，确定白藜芦醇主成分的保留时间，并读取白藜芦醇峰的峰面积；

精密量取系统适用性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算理论板数和各峰之间的分离度；

精密量取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；

精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至白藜芦醇苷保留时间的2倍，读取供试品溶液色谱图中主成峰峰面积和各杂质的峰面积；

(5)结果计算：

根据供试品溶液色谱图中主成分峰面积以及对照品溶液色谱图中主成分峰面积和对照品溶液主成分浓度，计算供试品中白藜芦醇的百分含量。

根据本发明第三方面的方法，其中还包括使用所述高效液相色谱法测定白藜芦醇供试品中杂质白藜芦醇苷的含量。具体地说，根据记录的各色谱图，当供试品中检测到存在白藜芦醇苷时，以对照溶液色谱图中主成份峰面积为1.0％，计算供试品溶液色谱图中白藜芦醇苷相对于白藜芦醇的百分含量，即得到供试品中的白藜芦醇苷的含量(即，如果对照溶液主峰面积为100，供试品溶液色谱图中杂质白藜芦醇苷的峰面积为115％，则白藜芦醇苷相对于白藜芦醇的百分含量，简称白藜芦醇苷含量为1.15％；供试品溶液色谱图中杂质白藜芦醇苷的峰面积为87％，则白藜芦醇苷含量为0.87％)。

根据本发明第三方面的方法，其中所述色谱柱的规格是：柱长15～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。

根据本发明第三方面的方法，其中所述色谱柱的规格是：柱长20～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。

根据本发明第三方面的方法，其中所述色谱柱的规格是：柱长25cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。

在本发明上述方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的实例例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

红葡萄酒含有多种活性生物分子，具有抗衰老，抗氧化，防肿瘤和抑菌的生理作用。这些分子中，白黎芦醇由于具有最为显著的抗氧化作用而受到人们的关注。已有美国部分厂家将其作为保健品进行销售。然而要想白黎芦醇真正有效，安全地，广泛地在药品，食品领域发挥作用，必须清楚地了解其抗氧化的体内过程和分子机制。

为此，我们查阅相关资料，了解衰老的氧自由基理论，认识了白藜芦醇的分子结构与抗氧化能力。然后设计实验重现了氧自由基对大肠杆菌的生长抑制，以及白藜芦醇对这种抑制的缓解与保护。通过一种崭新的实验检测方法，我们观察到大肠杆菌的生长抑制与恢复都是由其碳中心代谢系统状态改变导致的。表明白藜芦醇对大肠杆菌的保护作用是通过维持代谢系统流量稳定这一机制来实现的。然后我们证明大肠杆菌碳中心代谢系统状态改变主要是由催化相应反应的酶活变化导致的。进一步地，我们发现白藜芦醇浓度过高时，会导致保护作用的减弱。我们根据白藜芦醇浓度讨论了红酒饮用的上限。我们的实验既帮助人们认识了白藜芦醇，又为饮用红酒提供了一定的指导意义。

有一个有名的法国悖论，法国人酷好美食，特别是高脂含量的食物，然而其心脏血管疾病的比例却不高。这个悖论的解释是因为法国人喜欢以红酒来搭配美食，而红酒富含各类活性生物成分，具有抗衰老，抗氧化功能，能预防肿瘤与心血管疾病。其中白藜芦醇功能很大。

衰老的自由基理论认为，物质在人体内代谢和产生能量都需要氧参与，但是氧气在代谢过程中会产生各种自由基。自由基是含有一个不成对电子的分子或原子团，例如一氧化氮自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和脂类自由基。由氧气分子衍生的一系列自由基叫做氧自由基。由于自由基外层有一个不成对的电子，能量高，非常活跃，容易与其他物质发生反应。低浓度的氧自由基在体内具有重要的生物功能。但如果氧自由基积累过多，就很容易攻击细胞膜，还可能损伤细胞成分甚至导致疾病的发生。从心脑血管疾病到癌症，自由基和几种主要疾病特别是衰老和老年退行性疾病(老年痴呆症和帕金森氏症等)都有密切关系。

白藜芦醇(化学名称为E-3，5，4’-三羟基二苯乙烯)英文名为Resveratrol。它是非黄酮类的多酚化合物，分子式为C14H12O3，相对分子质量为228.25，为白色针状晶体。白藜芦醇的化学结构，还分别存在顺式和反式两种异构体，植物中白藜芦醇主要以反式形式存在，研究表明反式异构体的生理活性强于顺式异构体。白藜芦醇含有三个酚羟基，特别是其中的4-对位羟基是其抗氧化能力的主要来源，其邻二羟基和乙烯基的存在则有助于形成共轭体系，稳定自由基。这样的分子结构使得其具有很强的还原性达到抗氧化的功能。

因此白藜芦醇能保护细胞和器官免受氧化侵害，阻止胆固醇在血管内的沉淀，免于斑点、皱纹、肌肤松弛的困扰，还具有预防肿瘤，心血管疾病，抗衰老和抗菌的生理活性。很多科学家都认为白藜芦醇未来可能作为保健品，或者食品，乃至药品，在预防和辅助治疗疾病中发挥重要作用，产生广泛的价值。现在网络上甚至已经有一些厂家在出售所谓的美国产的白黎芦醇保健品，如美国美安等品牌的。

然而严谨地看，这些行为还是比较倡促的。要想真正将白黎芦醇有效，安全地，广泛地应用于药品，食品领域，必须了解白黎芦醇抗氧化过程的机制。自由基对生物损害的有哪些靶标，白藜芦醇对机体保护的又是哪些分子靶标？同时，白黎芦醇保护作用有着什么样的剂量关系等等。

本发明人经过严格的科学研究，获得的研究结果能够有效地解决现有技术迫切需要解决的问题，体现在：

(1)提供白藜芦醇在制备评价抗氧自由基代谢的试剂中的用途。

(2)提供白藜芦醇评价抗氧自由基代谢的方法。示例性的，该方法包括以下试验项目以评价白藜芦醇抗氧自由基代谢的效果：过氧化氢对大肠杆菌生长的影响、白藜芦醇对大肠杆菌生长的保护作用、发酵罐中的规范实验、氧自由基对大肠杆菌代谢流的影响、高浓度白藜芦醇对大肠杆菌生长的抑制。

(3)提供一种对白藜芦醇进行质量控制的方法，该方法包括使用高效液相色谱法测定白藜芦醇供试品中白藜芦醇的含量。进一步的，该质量控制的方法还包括使用所述高效液相色谱法测定白藜芦醇供试品中杂质白藜芦醇苷的含量。

附图说明

图1：M9培养基中大肠杆菌在加入不同浓度双氧水后的生长曲线

图2：M9培养基中大肠杆菌在加入0.015％双氧水和不同浓度白藜芦醇后的生长曲线

图3：13C同位素示踪确定代谢流量的基本原理

图4：大肠杆菌三种实验条件下部分碳中心代谢流量分布值和酶活变化情况

图5：M9培养基中大肠杆菌在加入0.015％双氧水和不同浓度白藜芦醇后的生长曲线

图6：高浓度情况时，白藜芦醇的浓度和保护效果的回归关系图

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

实施例1：白藜芦醇的含量测定及其中杂质的含量测定

目前市售的白藜芦醇多是从虎杖中提取得到的，尽管进行了分离纯化使产物白藜芦醇含量达90％以上，然而其中通常还会存在少量杂质例如白藜芦醇苷。而白藜芦醇苷需要经过一系列的生物化学反应才能形成白藜芦醇，白藜芦醇苷的存在对于白藜芦醇的生物学效应以及白藜芦醇应用于评价抗氧自由基代谢的方法都会有不良影响。因此，检测白藜芦醇产品中的杂质白藜芦醇苷含量是非常重要的。

邢琪昌等(邢琪昌，等，高效液相色谱法测定虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量，湖北中医药大学学报，2013，15(3):33)的文献中介绍了一种使用高效液相色谱法同时测定虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量，其中使用的HPLC的色谱条件是：色谱柱为Lichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈-0.03％磷酸水溶液(30：70)，梯度洗脱，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，检测波长：306nm，进样量：20μL，理论塔板数以白藜芦醇计不低于3000，分离度大于1.5。

本发明人发现，上述方法只适用于中药材虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量测定，该中药材虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷二者的含量相差不大甚至白藜芦醇苷更高；然而，本发明目前需要测定的是一种白藜芦醇产品，其中含有90％以上的白藜芦醇以及少量的白藜芦醇苷和其它杂质。目标成分是白藜芦醇，而白藜芦醇苷为杂质，然而根据上述文献的方法，其中白藜芦醇的保留时间大约为6分钟，而白藜芦醇苷保留时间大约在18分钟，相对保留时间大约为3.0。因此使白藜芦醇苷保留时间提前并且尽量不会造成白藜芦醇保留时间提前以便获得足够的理论塔板数和其它令人满意的色谱分析指标，是非常必要的。为此，本发明提供以下方法以测定白藜芦醇含量：

使用高效液相色谱法测定白藜芦醇中白藜芦醇的含量，其包括如下操作：

(1)中国药典2015年版四部第59所第0512节所载的高效液相色谱法中的规范进行测定；

(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.03％磷酸水溶液以体积比30：70为流动相，检测波长为306nm；

取系统适用性试验溶液测定，理论板数按白藜芦醇峰计应不低于3000，白藜芦醇与其最接近的杂质峰之间的分离度应大于1.5，白藜芦醇与白藜芦醇苷峰之间的分离度应大于3.0；

(3)溶液制备：

取白藜芦醇供试品适量，加流动相溶解并稀释，制成每1ml溶液中含有白藜芦醇0.2mg的溶液，过滤，作为供试品溶液(即，200μg/ml)；

精密量取供试品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流动相稀释刻度，摇匀，制成含白藜芦醇浓度为2μg/ml的溶液，作为对照溶液(即，2μg/ml)；

精密称取白藜芦醇对照品、白藜芦醇苷对照品适量，用流动相溶解并制成两种物质浓度均为分别为200μg/ml和2μg/ml的溶液，作为系统适用性试验溶液(即，200μg/ml+2μg/ml)；

精密称取白藜芦醇对照品适量，用流动相溶解并制成每1ml溶液中含有白藜芦醇0.2mg的溶液，过滤，作为对照品溶液；

(4)测定：

精密量取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，确定白藜芦醇主成分的保留时间，并读取白藜芦醇峰的峰面积；

精密量取系统适用性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算理论板数和各峰之间的分离度；

精密量取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；

精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至白藜芦醇苷保留时间的2倍，读取供试品溶液色谱图中主成峰峰面积和各杂质的峰面积；

(5)结果计算：

根据供试品溶液色谱图中主成分峰面积以及对照品溶液色谱图中主成分峰面积和对照品溶液主成分浓度，计算供试品中白藜芦醇的百分含量；

当供试品中检测到存在白藜芦醇苷时，以对照溶液色谱图中主成份峰面积为1.0％，计算供试品溶液色谱图中白藜芦醇苷相对于白藜芦醇的百分含量，即得到供试品中的白藜芦醇苷的含量(即，如果对照溶液主峰面积为100，供试品溶液色谱图中杂质白藜芦醇苷的峰面积为115％，则白藜芦醇苷相对于白藜芦醇的百分含量，简称白藜芦醇苷含量为1.15％；供试品溶液色谱图中杂质白藜芦醇苷的峰面积为87％，则白藜芦醇苷含量为0.87％)。

以上HPLC方法，所述色谱柱的规格是：柱长15～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。特别地，所述色谱柱的规格是：柱长20～30cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。特别地，所述色谱柱的规格是：柱长25cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。

实施例1a：使用上述以乙腈-0.03％磷酸水溶液为流动相的色谱方法，色谱柱的规格是：柱长25cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm，结果：白藜芦醇保留时间为6.23min，白藜芦醇苷保留时间为18.37min，其相对于白藜芦醇的相对保留时间为2.95。可见，作为杂质的白藜芦醇苷杂质峰的出峰时间较晚，这是不利于色谱测定的。还发现，使用乙腈-0.03％磷酸水溶液为流动相，在进行精密度试验时，取同一批白藜芦醇样品溶液(浓度为0.2mg/mL)，按上述色谱条件，连续进样测定5次，按白藜芦醇峰面积计算，RSD通常在0.35～0.38％范围内，显示白藜芦醇具有优良的精密度；但是，同样地如果针对系统适用性试验溶液色谱图中的各杂质峰面积计算时，白藜芦醇苷的RSD均在1.82～1.96％范围内，显示这种杂质的精密度不能满足要求。在补充试验中，使用以上以乙腈-0.03％磷酸水溶液为流动相的色谱方法，测定白藜芦醇/白藜芦醇苷二者以1：1的混合物时，白藜芦醇RSD在0.35～0.37％范围内，白藜芦醇苷RSD在0.37～0.41％范围内，显示二者均具有优良的精密度。申请人推测这种差异可能是由于供试品中两种物质比例偏差造成的。总之，现有技术无法满足本发明供试品测试要求。

实施例1b：根据上述HPLC法，但是流动相中使用的0.03％磷酸水溶液改为等体积的0.05％酒石酸水溶液，其它测定条件不变，色谱柱的规格是：柱长25cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm，结果：白藜芦醇保留时间为6.11min，白藜芦醇苷保留时间为13.62min，其相对于白藜芦醇的相对保留时间为2.23。可见，作为杂质的白藜芦醇苷杂质峰的出峰时间显示提前，这可以大大提高分析方法的效率。还发现，使用乙腈-0.03％酒石酸水溶液为流动相，在进行精密度试验时，取同一批白藜芦醇样品溶液(浓度为0.2mg/mL)，按上述色谱条件，连续进样测定5次，按白藜芦醇峰面积计算，RSD通常在0.33～0.37％范围内，显示白藜芦醇具有优良的精密度；还出人意料地发现，针对系统适用性试验溶液色谱图中的各杂质峰面积计算时，白藜芦醇苷的RSD均在0.41～0.54％范围内，显示这种杂质白藜芦醇苷的精密度完全能够满足要求。在补充试验中，使用以上以乙腈-0.05％酒石酸水溶液为流动相的色谱方法，测定白藜芦醇/白藜芦醇苷二者以1：1的混合物时，白藜芦醇RSD在0.36～0.38％范围内，白藜芦醇苷RSD在0.35～0.38％范围内，显示二者均具有优良的精密度。这表明，使用乙腈-0.05％酒石酸水溶液为流动相的色谱方法，不论供试品中两种物质的比例如何，它们均具有优良的色谱测定性能。

以上实施例1a和实施例1b中，白藜芦醇与其最接近的杂质峰之间的分离度大于1.5，白藜芦醇与白藜芦醇苷峰之间的分离度应大于4.0，理论板数按白藜芦醇峰计大于5000。以上实施例1a和实施例1b中，使用的色谱柱的规格是：柱长25cm、柱内径4.6mm、填料粒径5μm。本发明人在补充试验中发现，当改用柱长15cm、20cm、或30cm，但柱内径和填料粒径仍分别为4.6mm和5μm，都能获得与上述实施例1a和实施例1b类似的结果，这表明柱长不影响测定。

实施例2：氧自由基对生物体的影响

1、过氧化氢对大肠杆菌生长的影响

为了检验氧自由基对生物的影响，我们选取了大肠杆菌作为实验的“被试”，双氧水作为氧自由基的代表。大肠杆菌是一种很常见的微生物，由于被科学家研究得比较多，以它作为实验是有很好的代表性。

我们先是在4个500mL的三角摇瓶，利用250mL无机M9培养基对大肠杆菌JM101菌株进行培养。当培养基OD600值达到0.3后，分别加入终浓度为0.005％，0.01％，0.015％的双氧水(H2O2，下文正文使用双氧水，图表使用H2O2)，然后记录其OD值变化情况。这里OD600指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值。这样的实验重复三次，实验数据用Excel画成了图1。从图中，可见加入双氧水的摇瓶里的大肠杆菌的生长，在最开始的30分钟里明显受到遏制；之后大肠杆菌的生长也变慢了许多。这充分说明了，大肠杆菌的正常生长在受到双氧水胁迫后受到很大的抑制。图1是M9培养基中大肠杆菌在加入不同浓度双氧水后的生长曲线。

2、白藜芦醇对大肠杆菌生长的保护

接下来需要检验白藜芦醇是否能够对双氧水抑制大肠杆菌生长起到一定的影响。这一次的实验设置和之前一样，但是所有培养基中都添加0.015％的双氧水。我们又在其中分别加入了25uM、50uM、100uM的白藜芦醇。这样可以比较不同浓度的白藜芦醇对大肠杆菌的保护作用。将得到的结果画为图2，可以发现当白藜芦醇的浓度在一定范围内变化时，双氧水对大肠杆菌正常生长的阻遏作用明显变小了，说明白藜芦醇效果优异。图2是M9培养基中大肠杆菌在加入0.015％双氧水和不同浓度白藜芦醇后的生长曲线。

3、发酵罐中的实验结果

之前的实验是在摇瓶中进行的，而摇瓶培养里的各种物质的浓度是在发生变化的，所以不是一个稳定的条件，如果以后要说明深入问题可能存在困难。所以，想到用发酵罐进行实验。在发酵罐中进行培养，可以使得体系内的各种参数都恒定。

在发酵罐上进行了与摇瓶中类似的实验。在发酵罐上为了便于比较，我们将不同实验的洗脱速率都设置为恒定值，这也就决定了发酵罐中细菌的生长速率是恒定的。在发酵罐中，反映大肠杆菌的生长特性的值变成生物质比合成速率，也就是培养基中每克葡萄糖能够生成多少克的生物质。我们测量了大肠杆菌JM101菌株，在正常培养基和含双氧水培养基中的生长特性。在双氧水培养实验中，双氧水的浓度被精细地选择在0.2％(V/V)，在此浓度下，细胞内环境受到足够的扰动而同时细胞可以维持其生长速度大于等于替换速率(0.2h-1)。用于抗氧化的白藜芦醇的浓度则选择为20uM。我们的结果表明，在发酵罐中生物质合成量在加入双氧水后明显下降，大肠杆菌的生长同样受到双氧水很大的抑制。白藜芦醇则可以保护大肠杆菌，使得其所受氧化剂的影响变小了。具体结果见下表：

表：发酵罐中胁迫实验的基本参数

4、氧自由基对大肠杆菌代谢流的影响

以上实验让人们对氧自由基和白藜芦醇对大肠杆菌的影响都有了非常直观的感受。当然，我们更想了解氧自由基为什么会对大肠杆菌的生长产生影响，也就是这些参数变化的更深层次的原因。细胞摄取诸如葡萄糖等糖类，将这些糖类分解成更小的分子，利用它们来构建DNA、蛋白质、细胞膜和驱动细胞运行的能量分子。整个的过程称作为代谢，它使得细胞能够执行各种功能以及生长和增殖，由此创造了整个生物体。

在代谢系统中，三羧酸循环是机体将糖或其他物质氧化而获得能量的最有效方式；同时，三羧酸循环是糖、脂和蛋白质三大类物质代谢与转化的枢纽。它的活性大小，直接决定了细胞的生长状态。其具体生物化学反应如图3所示，这些生物化学反应组合起来，形成一个开放的循环。三羧酸循环的运行就是各个生化反应的一个接力赛，各个反应将相应的产物传递给下一步反应。图3是13C同位素示踪确定代谢流量的基本原理。

氧化剂对大肠杆菌生长的影响，应该会和对大肠杆菌三羧酸循环代谢流量的影响有关。于是，之前的问题就变成了在胁迫与保护情况下，三羧酸循环各个反应的流量是否受到影响。然而，通过某个反应的流量本身是一个很动态的概念，不像物质的量，浓度等比较容易测定。真要测量这个东西，感觉还是个问题。通过13-C同位素示踪来检测代谢流量大小的方法。这种方法在原理上有些巧妙，它是利用混合了不同比例稳定同位素(13C，12C)的葡萄糖来喂养大肠杆菌，当这种葡萄糖进入大肠杆菌后，同位素分子会随着各个生化反应而生产各种生物分子，由于不同的化学反应对分子的碳骨架的处理不同，导致不同的流量对应不同的同位素标记状态，通过测定这些分子碳骨架的稳定同位素标记状态，我们可以反推出这些流量来。

比如图3中一个含有3个碳的分子m，有50％全为13C标记，50％则全为12C。这种分子会有两种下游的反应，一是经过A反应生成a，这个反应中分子碳骨架没有改变，然后由a再生产下游的n；另一个是经过B反应，从一个3碳的分子被拆成一个2碳分子b和一个一碳分子c。而a可以通过反应C生成分子n，而b和c则可以通过反应D结合生产分子n。但是，反应C和反应D来的n内部的同位素标记状态却有很大区别。单纯从反应C来的，其同位素分布状态就如图3x所示，单纯从反应D来的，其同位素分布状态就如图3z所示。而一半来自反应C，一半来自反应D的n，则如图3y所示。因此，我们如果测定了分子n的同位素标记状态，我们就可以反推出反应C和D的值。这就是利用13C同位素示踪方法检测代谢流得基本原理。而检测分子的同位素标记状态则可以使用质谱，因为13C与12C的原子质量不一样，相同分子如果含有的13C数量不一样，在质谱上会形成不同的质谱峰。

借助实验室的一系列的技术和仪器。我们又开始了我们的实验。这一次我们一开始就使用了发酵罐来进行培养，使得整个培养体系处于一个恒定状态。接下来，我们就开始测量之前四种条件下大肠杆菌三羧酸循环各反应的流量值。

首先收集发酵罐里面所有的培养基，通过离心的方式使大肠杆菌菌体与培养基分离。菌体再用Tris-HCl洗一到两次，然后用6M的HCl重悬，并高温进行水解，使细菌菌体内的蛋白质分解成游离的氨基酸。

标准水解方法是在110℃下水解12-24h，我们的产物放在105℃水解时，有不少的沉淀最后没有能够溶解，而且时间稍长后变黑。但一般存度稍高的蛋白质水解并不会出现黑褐色，因此估计是细胞内其他物质被碳化造成的，尤其是细胞所含的多糖不易溶解，而产生黑色。当然其中肯定有不少氨基酸被氧化，至于氧化的程度则不能完全确定。为此，将水解的温度先降低到90℃，先水解4-5个小时(并且将菌液浓度降低)，等大部分可见沉淀溶解后，调到105℃水解18个小时。

将水解后的大肠杆菌样品用专门的衍生化试剂处理后，将样品交送入气相色谱-质谱联用仪进行分析，得到三羧酸循环所生成的各个氨基酸分子的同位素标记状态。然后，将这些分子的同位素标记状态输入到，实验室自己开发的优化软件中，通过对13C标记状态进行拟合，软件给出了代谢流量的最优估计值。

结果如图4所示。从图4的结果可以看到，暴露在双氧水之下后三羧酸循环的主要限速酶代谢流量值发生了明显的变化，异柠檬酸脱氢酶在正常的时候值为0.23，加入双氧水后，降低为0.16，在有白藜芦醇保护时回升至0.1。a-酮戊二酸脱氢酶在正常的时候值为0.11，加入双氧水后，降低为0.02，在有白藜芦醇保护时回升至0.06。这两个酶流量的变化和大肠杆菌生长状态的变化非常一致。图4是大肠杆菌三种实验条件下部分碳中心代谢流量分布值和酶活变化情况。红色小方框中为代谢流量或者酶活在3种情况下的对比。1代表对照组，2代表双氧水胁迫组，3代表加入白藜芦醇的保护组。其中BIOMASS表示生物质。

从结果中可以看到，加入双氧水后，三羧酸循环流量降低，大肠杆菌生长效率受到抑制；当加入白藜芦醇后，三羧酸循环流量有所回升，而相应地大肠杆菌生长抑制也得到缓解。因此，这充分说明白藜芦醇对大肠杆菌生长的影响是通过对中心碳代谢流量的影响来达到得。

5、大肠杆菌代谢流变化的原因探究

这些代谢系统的改变又是由什么导致的呢？代谢反应都是由生物酶来催化的，而大部分的酶就是蛋白质的一种。代谢反应的速率的变化，会不会与酶的活力变化有关呢？

受这个思路启发，我们想测试几种条件下的酶活。由于之前代谢流的测定围绕着三羧酸循环进行，我们选定了异柠檬酸脱氢酶和□-酮戊二酸脱氢酶。酶活的测量原理相对比较简单，首先要将代测反应耦联一个能产生发色基团的反应。然后就是在单位时间内，测定酶所催化生成的发色基团的多少来代表酶活。酶活检测的结果和流量结果一样画在图5。

我们把酶活检测的结果与代谢流量的变化情况作了一个对比，如图5。这个图很能说明问题，可以看到酶活变化和代谢流量值变化的方向是一致的，同时变化幅度也很相关，酶活的变化大的时候，代谢流量的变化也很大。因此，酶活变化和代谢流量值变化具有非常强的相关性。这也表明，代谢反应的速率的变化有很大程度来自酶的活力变化。图5是M9培养基中大肠杆菌在加入0.015％双氧水和不同浓度白藜芦醇后的生长曲线。

6、白藜芦醇对大肠杆菌生长的抑制

白藜芦醇虽然能有效地抗氧化，但是如果它本身浓度过高，会不会有相反的效果呢？我们又重复了之前的实验，但是换成了500uM，2.5mM，10mM，50mM的白藜芦醇。结果当白藜芦醇浓度过大时，在浓度超过10mM时，大肠杆菌生长抑制反而开始加重，继续增大时，抑制也很明显。表明当浓度过大时，白藜芦醇本身也是对大肠杆菌生长有抑制作用。我们将这些数据500uM，2.5mM，10mM，50mM浓度的数据画成了图5。这表明白藜芦醇对生长的保护是有一定的限度，任何事物都有限度，这就是所谓“过犹不及”的道理。

7、从白藜芦醇讨论红酒饮用上限

我们知道了白藜芦醇的抗氧化性可以保护细胞在生长时免受氧化剂的威胁，但是白藜芦醇浓度过高后，这种效果就明显减弱了。这是不是说，红酒喝太多了也没有效果了呢？我们觉得可以从我们的实验中做一些推导。我们觉得首先要计算出白藜芦醇失效的最大浓度，这可以通过之前所进行的500uM，2.5mM，10mM，50mM的白藜芦醇数据进行推导。我们将在图5中0.015％双氧水刺激时，加入白藜芦醇后，大肠杆菌OD值的回升均值作为白藜芦醇对细胞的保护作用的指标。这样我们手里，有了两组数据，一个组是白藜芦醇的浓度，一组是这些浓度对应的保护指标。我们将白藜芦醇的浓度取了底为10的对数后，根据两组数据进行了线性回归，得到了线性拟合方程Y＝0.633-0.119*X。拟合图如图6，Y轴是白藜芦醇浓度的对数值，X轴是这些浓度对应的保护指标。将这个方程外推到保护指标为零，得到白藜芦醇失效的浓度为0.2M。图6是高浓度情况时，白藜芦醇的浓度和保护效果的回归关系图。

但这只是针对体外培养的细菌，而对真实的吸收到人体的情况又不一样。为了用一个较为准确的人体模型模拟来估计上限，我们查阅了好多资料，找到了一些有用的参数，

1)在刊登于《中外葡萄与葡萄酒》杂志上的“干红葡萄酒中白藜芦醇的含量与分布”(《中外葡萄与葡萄酒》，2004(2):8-10)一文中，可以找到红酒中白藜芦醇的含量，一般在5-30uM之间。我们取15uM作为代表值X。

2)在第四军医大梁力的硕士学位论文“乙酰化白藜芦醇和白藜芦醇在SD大鼠体内药代动力学研究”中，可以找到大鼠以438um/kg的量口服白藜芦醇后的血药最高峰值为12uM，吸收效率为0.0273/kg我们以此代替人的吸收效率。那么，一个质量为Y kg个人的效率为0.0273/Y。

3)我们以刚刚推定的白藜芦醇失效的浓度为0.2M为基准，那么要想使得白藜芦醇的血药浓度达到这一标准，需要饮用的红葡萄酒体积为

V＝(0.2*Y/0.0273)/X

假设一个人体60KG，那么可以得到白藜芦醇失效的所需红酒量322344.25L,显然这个浓度远远高于正常人能够饮用的量。同时，在这个计算中还未考虑到白藜芦醇吸收后，经过首关效应被代谢为其他衍生物；真核细胞存在线粒体保护大三羧酸循环等作用。故而，日常生活中，除开红酒中的其他物质如酒精，单就白藜芦醇而言，我们可以放心大胆饮用红酒，而不必担心白藜芦醇的作用减弱。当然，因为由于以下一些原因，如我们的对象是大肠杆菌；白藜芦醇在人体内可能会被代谢成其他成分；血液浓度还和细胞外浓度不完全相同等，真实情况和我们的模型很有差距。

8、实验总结：

大肠杆菌在遭受一定浓度的氧自由基(本文中为过氧化氢)胁迫时，其生长会受到明显抑制。这种现象无论是在摇瓶中，还是在发酵罐中都很明显，所以氧自由基对生物是有害的；

白藜芦醇能缓解，减轻氧自由基对大肠杆菌的生长抑制和影响。而且，这些保护作用存在一定的剂量依赖现象。也就是说在我们的实验浓度范围内，氧自由基浓度越大，则抑制现象就越严重；而白藜芦醇浓度越高，则其表现出来的保护作用也就越强；

大肠杆菌在胁迫与保护时所产生的生长的抑制与恢复现象都与大肠杆菌的代谢状态紧密相关，大肠杆菌中心碳代谢系统三羧酸循环中通过异柠檬酸脱氢酶和a-酮戊二酸酶的流量在加入氧自由基或者白藜芦醇后都有明显变化。中心碳代谢系统的变化可能是大肠杆菌生长抑制与恢复的主要原因；

在上述实验中，大肠杆菌的中心碳代谢酶催化流量的变化与该酶的酶活变化在方向上完全一致，在数值上存在很大的相关性。酶的变化可以解释代谢流量的变化；

当白藜芦醇浓度超过一定限度，数量级发生变化后，浓度越高，起保护作用反而越弱，达到极限后，其保护作用明显减弱到不明显。我们对白藜芦醇浓度增长与保护作用变化之间的定量关系进行了拟合，得到了回归曲线，并将该曲线外推到零点，得到了白藜芦醇完全失活的浓度值。通过假定的模型，计算出了，白藜芦醇完全失活时对应的红酒的量，远高于日常红酒饮用量。结果说明，我们无需担心红酒喝多了白藜芦醇没有效果。

研究意义：通过对白黎芦醇的实验探究，发现了白黎芦醇抗氧化的机理，也意识到白黎芦醇的药用价值。特别是，我们对白藜芦醇浓度增长与保护作用变化之间的定量关系进行了拟合，得到了回归曲线，并将该曲线外推到零点，从而得到了白藜芦醇完全失活的浓度值。通过文献挖掘假定的人体吸收和稀释模型，计算出了白藜芦醇完全失活时对应的红酒的量，远高于日常红酒饮用量，说明，我们无需担心红酒喝多了白藜芦醇没有效果。这对我们饮用红酒具有参考价值。

当然，由于所做实验有一定的局限性，我们只针对大肠杆菌进行研究；白藜芦醇在人体内可能会被代谢成其他成分；血液浓度还和细胞外浓度不完全相同等。真实情况和我们的模型很有差距。但是在进一步的研究中，用该课题所提供的研究方法，可对不同的自由基，不同动物细胞，不同的酶的代谢过程等多方面进行研究是否同样能达到防止代谢过程被破坏的作用。另外，一般事物具有两面性，对于白黎芦醇是否有毒性，其毒害作用也将纳入今后的研究方向。明确白黎芦醇的作用机理，为我们今后更加全面，更加深刻认识这一物质奠定了基础，也为实现生产药用白黎芦醇提供理论指导。