基于增强氯化血红素催化活性的水胺硫磷比色检测方法

摘要

本发明公开了一种NaH

说明书

技术领域

本发明属于农产品中有机磷农药残留检测领域，尤其涉及在水相缓冲液体系中，通过比色测定Hemin催化氧化TMB在450 nm处的特征吸收峰变化，进行检测水胺硫磷的方法。

背景技术

水胺硫磷属于一种重要的有机磷类农药，其对生物体内胆碱酯酶有很强的抑制作用，使得胆碱酯酶失去分解乙酰胆碱的能力，导致乙酰胆碱大量蓄积，从而阻断了神经传导，引起中枢神经系统中毒。作为一种高毒有机磷农药，虽然我国政府已经禁止其用于蔬菜、水果、茶叶和中草药种植，但是目前其在蔬菜种植等方面经常被非法使用，引发一系列安全问题，已经引起公众广泛关注。因此，研究一种快速检测水胺硫磷的方法很重要。

目前检测有机磷农药的方法有色谱法，酶抑制法，免疫学方法等。应用于检测有机磷的色谱法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)和液相色谱-质谱法(LC-MS)。色谱法检出限较高，不能满足痕量农药残留和出口贸易检测的实际需要。酶抑制法灵敏度较差，并且对各类不同有机磷农药检测的灵敏度不同，重复性、回收率还有待提高。免疫学方法常用的检测手法主要有荧光免疫法、酶免疫法、放射免疫法及流动注射免疫法。免疫学分析法的缺陷在于易产生假阳/阴性现象。近年来也产生了一些其他检测有机磷农药的方法，如噬菌体展示技术，分子印迹技术。噬菌体展示技术缺陷在于噬菌体展示系统依赖细胞内基因表达，一些对细胞有毒性的分子很难得到表达。因此需要开发更可靠快速检测有机磷农药的方法。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种基于增强氯化血红素催化活性的水胺硫磷比色检测方法，其具有肉眼可辨、灵敏度高、特异性强、操作便捷，检测快速等优势，可广泛应用于农产品中水胺硫磷残留的快速检测。

本发明的技术方案为：一种基于增强氯化血红素催化活性的水胺硫磷比色检测方法，包括以下步骤：

(1) 将Hemin与含有水胺硫磷的样品混匀孵育，制备出待测样液；

(2) 将待测样液与NaH₂PO₄缓冲液混匀，之后加入H₂O₂和TMB混合液混匀，通过测定混合溶液在450>

上述步骤(1)中，Hemin的终浓度为14 μM。

上述步骤(2)中，H₂O₂的终浓度为40>

基于增强氯化血红素催化活性的水胺硫磷比色检测方法，具体检测步骤为：

(1) 制备已知水胺硫磷浓度的检测体系：取11支刻度离心管，分别加入 Hemin母液和水胺硫磷标准液，使得整个检测体系中的水胺硫磷含量维持在2-100 ppb，充分混匀后置于30℃条件下孵育，之后加入一定体积NaH₂PO₄缓冲液，最后再加入H₂O₂和TMB混合液至500>

(2) 另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入2.5 μL三蒸水替代水胺硫磷标准液，处理后作为空白对照体系溶液；

(3) 分别取200 μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪进行扫描测定450 nm处吸收峰；全波长扫描范围为300-800 nm，获得其吸收光谱；

(4) 以不同浓度的水胺硫磷与测定的⊿A作图，绘制标准曲线；

(5) 制备样品检测体系：取2.5 μL实际样液，按步骤(1)方法制备的检测溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其吸收峰值；

(6) 根据样品在NaH₂PO₄缓冲液体系中测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中水胺硫磷的含量。

⊿A为待测样品的吸光值-空白样品的吸光值。

本发明的基本原理是：NaH₂PO₄缓冲液中Hemin在H₂O₂作用下催化氧化TMB，使其分子中的N原子失去一个电子，导致体系颜色发生显著变化，由原先的无色变成蓝色或蓝绿色，此时产物的特征吸收峰为370>2O₂和TMB的亲和力提高，催化活性得到增强，使得底物TMB失去二个电子，变成二亚胺结构，此时体系由蓝绿色变成黄色，在450>

本发明提供的检测方法不需要依赖大型仪器设备，检测灵敏度高，选择性好，且操作简单快速，肉眼可辨，可以广泛应用于农产品等中有机磷农药残留的快速检测。

本方法对水胺硫磷最低检测限为1.2 ppb，具有检测特异性好、肉眼可辨、操作简便等优点，不需要依赖大型仪器就可以实现水胺硫磷农药残留的快速检测，因而可广泛应用于农产品中有机磷农药检测。

附图说明

图1. 水胺硫磷引起的颜色变化和吸光度变化；1:Hemin+H₂O₂+TMB；>2O₂+TMB；3:>2O₂+TMB；4:>2O₂+TMB；

图2. 加入不同浓度水胺硫磷后的吸收光谱；

图3. 不同浓度水胺硫磷与吸光值变化(⊿A)对应关系；

图4. 其它有机磷农药对检测水胺硫磷的影响；

图5. 应用于实际样品中水胺硫磷的检测。

具体实施方式

实施方式一：

(1) 在NaH₂PO₄缓冲液体系制备已知水胺硫磷浓度的检测体系：取11支1.5>2PO₄缓冲液(pH为3.0)，最后再加入10 μL的2 M>2O₂和10>

(2) 另取1支按步骤(1)方法制备的检测溶液，加入2.5 μL三蒸水替代水胺硫磷标准液，处理后作为空白对照体系溶液。

(3) 分别取200 μL步骤(1)和步骤(2)制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用酶标仪进行扫描测定450 nm处吸收峰。全波长扫描范围为300-800 nm，获得其吸收光谱。

(4) 以不同浓度的水胺硫磷与测定的⊿A(450 nm)作图，绘制标准曲线，得到线性范围2-30 ppb，其对应的回归方程为y=0.16091+0.01824 C，其中C指水胺硫磷浓度(ppb)。

(5) 制备样品检测体系：取2.5 μL实际样液(分别命名为废水-1、废水-2和西红柿汁)，按步骤(1)方法制备的检测溶液，充分混匀后按步骤(3)方法测定其吸光度变化。

(6) 根据样品在NaH₂PO₄缓冲液体系中测得的吸光度值，查标准曲线，可以求得不同样品中水胺硫磷的含量。

(7) 实际样本检测效果验证：用本发明方法测定3份不同地点取得的废水-1、废水-2和西红柿汁，往样品中加入50 ppb的水胺硫磷，得到的回收率为85.4%-99%，证明本方法可靠性。

(8) 本发明方法可以测定浓度范围为2-100 ppb的水胺硫磷，其最低检测限为1.2 ppb。