由组织snoRNA组成的肝癌复发风险预测标志物及试剂盒

摘要

由组织snoRNA组成的肝癌复发风险预测标志物及试剂盒，本发明公开了一种肝癌患者接受切除术后复发风险的预测标志物，由分别编码以下snoRNA的核酸分子中的一种或几种组成：U15a、U19、ACA21、ACA31、U42b、U52和或ACA61。本发明还公开了一种评估肝癌患者接受切除术后复发风险的多基因试剂盒，其包含用于检测以下snoRNA分子在肝癌患者肿瘤组织中水平的试剂：U15a、U19、ACA21、ACA31、U42b、U52和ACA61。本发明的试剂盒能及时反映肝癌患者术后复发风险，避免低风险患者的过度治疗并对高风险患者进行预警，便于临床医生及时采取个性化的预防复发的方案。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一个用于评估肝细胞肝癌患者接受切除术后复发风险的检测试剂盒。

背景技术

原发性肝细胞肝癌(简称肝癌)是一种恶性程度很高的肿瘤，占原发性肝癌的90％以上。世界卫生组织发表的《全球癌症报告2014》指出，2012年肝癌的发病率和死亡率分居恶性肿瘤的第五和第二位。中国是肝癌高发区，新发及死亡病例均约占全球病例的一半左右。手术切除是目前治疗肝癌最有效的手段之一，然而即使接受手术切除的病人，其术后复发率仍较高，总体预后并不理想。已有研究表明，对具高转移潜能的HCC病人进行术后辅助治疗能在一定程度上抑制肿瘤复发、延长患者生存。但目前临床上尚缺乏可有效的甄别复发高危人群的指标，因而无法对高危患者进行及时的术后辅助治疗，导致肝癌术后复发率居高不下。鉴于传统临床病理诊断或单一的分子标记物对患者术后预后判断的效力较低，多基因标记物联合使用的试剂盒将是新的研发方向。

临床研究认为HCC病人在切除术后的复发主要有早期复发和晚期复发两种模式。晚期复发多在术后3-5年内发生，与肝脏整体状态相关；而早期复发主要是由于肿瘤本身的特性造成，多在术后1-2年内复发。同时肝癌组织之间具有很大程度的异质性，且这一差异可能与HCC患者的疾病进展如术后复发情况密切相关。根据多基因的表达水平不仅可反应肿瘤组织之间的差异性，还能进行建模并筛选优秀的分类器，用于预测癌症患者的预后。

snoRNA是一类长约60-300nt、定位于核仁的小分子非编码RNA，其主要功能是介导rRNA特定位点的甲基化或假尿嘧啶化修饰，部分snoRNA还可指导rRNA前体的加工、tRNA或snRNA的甲基化修饰或影响mRNA的可变剪切。近年的研究发现，部分snoRNA在不同肿瘤组织中突变或表达异常，并与肿瘤细胞的恶性表型密切相关。如在前列腺癌和乳腺癌中发现U50突变或表达下调，过表达U50则可抑制肿瘤细胞的增殖；而U44在乳腺癌患者肿瘤组织中表达显著降低，且U44的低表达与患者更差的预后相关；U76和U78在非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤组织中表达上调，且这两个snoRNA在NSCLC患者血浆中含量高于健康人，提示U76与U78的表达上调与肿瘤发生相关。

利用肿瘤组织中多基因表达水平反应癌症患者预后的研究中，最为著名的是2002年Veer团队构建的一个由70个基因组成的分类器，可用于预测淋巴结阴性乳腺癌患者术后5年内的复发风险；随后Van和Buyse等分别在2002和2006年对该模型进行验证，均可重复Veer团队的结果，目前该模型已进入临床实验阶段。然而近年来各类预测预后的模型虽层出不穷，但可应用于临床的仍凤毛麟角。主要存在以下问题：(1)研究结果不可重复；Michiels重新分析了7篇已发表、关于肿瘤预后分类器的研究数据，发现其中5项研究的结果不可重复，并提出用于分类器构建的训练组标本量应足够大，且应进行独立、多次地验证，以保证结果的可重复性。(2)分类器中包含过多冗余信息，可用性差；指标数的增加可提高分类器预测准确性，如Hoshida团队构建的分类器包含了186个基因，但这也会造成检测执行困难、费用过高的问题，为临床应用带来困难。因此,目前仍然有必要发现具有临床应用价值的肝癌预后预测标记物,用于预测患者术后复发，从而帮助选择合适的治疗人群和方式，为HCC患者及时接受有效诊治提供有力的支持。

发明内容

本发明目的在于，提供一种用于评估肝癌患者接受切除术后复发风险的预测标志物及多基因组合试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供了一种一种肝癌患者接受切除术后复发风险的预测标志物，由分别编码以下snoRNA的核酸分子中的一种或几种组成：U15a、U19、ACA21、ACA31、U42b、U52或ACA61。。

在一个优选的实施方案中，所述snoRNA在肝癌患者的肿瘤组织中水平高于或低于相应的癌旁组织：U15a、U19、ACA21、U42b、U52和ACA61在肿瘤组织中水平高于相应的癌旁组织，ACA31在肿瘤组织中水平低于相应的癌旁组织。优选地，所述肝癌为原发性肝细胞肝癌。

另一方面，本发明还提供了一种评估肝细胞肝癌患者接受切除术后复发风险的snoRNA分子组合，其U15a、U19、ACA21、ACA31、U42b、U52和ACA61组成。

在一个优选的实施方案中，所述snoRNA在肝癌患者的肿瘤组织中水平高于或低于相应的癌旁组织：U15a、U19、ACA21、U42b、U52和ACA61在肿瘤组织中水平高于相应的癌旁组织，ACA31在肿瘤组织中水平低于相应的癌旁组织。优选地，所述肝癌为原发性肝细胞肝癌。

具体而言，本发明通过以下步骤得到了上述由7个组织snoRNAs组成的肝癌诊断组合：

1.基因芯片技术筛选在HCC组织中差异表达的snoRNA

2.实时荧光定量PCR验证候选snoRNAs在HCC组织中的表达差异；

3.在由174例肝癌患者组成的训练组中确立可区分发生术后肝癌患者是否发生早期复发的组织snoRNA组合；

4.在由109例肝癌患者组成的独立验证组验证步骤3确立的组织snoRNA组合预测肝癌患者术后复发情况的效果；

5.比较步骤3确立的组织snoRNA组合与肿瘤大小、肿瘤数目、血管侵犯及TNM分期对肝癌患者复发情况的预测效果；

6.分析步骤3确立的组织snoRNA组合在小肝癌、单个肿瘤、无血管侵犯及TNM早期的肝癌患者中的预测效果

7.分析步骤3确立的组织snoRNA组合是否可以独立预测肝癌复发。

对实验结果进行分析及相关统计显示：上述步骤1中，发明人通过基因芯片筛选确定了53个候选snoRNAs，并在步骤2中验证了28个候选snoRNAs在肝癌患者肿瘤组织中的表达差异。由于肝癌患者的预后均较差，切除术后复发主要集中在术后第一、第二年，所以本发明将2年复发，即早期复发作为预测目标。进一步检测候选snoRNAs在训练组标本中的水平，并确立了可区分肝癌患者是否发生术后早期复发的、由7个snoRNA构成最优组合：U15a、U19、ACA21、ACA31、U42b、U52和ACA61。进一步在独立的验证组中验证了该组织snoRNA组合可以区分发生早期复发的肝癌患者与对照。与此同时，发明人发现相较临床常用的预后手段，如肿瘤大小、肿瘤数目、血管侵犯及TNM分期等，该组织snoRNA组合具有更好的预测预后的效果。在小肝癌、单个肿瘤、无血管侵犯及TNM早期的肝癌患者中，该组织snoRNA组合预测出的高复发风险患者更可能发生术后早期复发。多因素分析中，该组织snoRNA组合作为独立预测肝癌患者术后早期复发的因素

在另一个方面，本发明还公开了一种评估肝细胞肝癌患者接受切除术后复发风险的多基因试剂盒，其包含用于检测以下snoRNA分子在肝癌患者肿瘤组织中水平的试剂：U15a、U19、ACA21、ACA31、U42b、U52和ACA61。

在一个实施方案中，所述用于检测snoRNA分子在肿瘤组织中水平的试剂为实时荧光定量PCR相关试剂。

在再一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括组织RNA提取系统和反转录系统。

在另一个优选的实施方案中，该试剂盒还包括用于评估是否发生术后早期复发的分析方法。

在一个优选的实施方案中，所述检测snoRNA分子表达水平的试剂包括以下PCR引物对：检测U15a的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、检测U19的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、检测ACA21的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、检测ACA31的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、检测U42b的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、检测U52的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12以及检测ACA61的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。。更优选的，所述的试剂盒还包括检测内源参照U6的引物。通过内源参照U6校准，得到上述7个目标基因在待检组织标本中的水平2-ΔCt(ΔCt＝Cttaget-Ctreference)。根据snoRNA阈值将检测标本snoRNAs水平分别赋值为1或0，实现离散化。

进一步，为了简化试剂盒的使用，利用上述7个分子指标进行患者术后早期复发的COX比例风险模型分析，并获得用于计算患者复发风险值的计算式：即患者复发风险值＝0.178*U15a-0.496*U19+0.588*ACA21+0.402*ACA31-0.198*U42b+0.271*U52+0.321*ACA61，其中U15a、U19、ACA21、ACA31、U42b、U52和ACA61为相应组织snoRNA检测水平离散化后的数值，风险值以0.49为预测阈值，高于0.49则预测为高复发风险，低于0.49则预测为低复发风险。由此，所述的预测试剂盒可应用于肝癌术后复发预警。

进一步，本发明的内容还包括上述多基因试剂盒在预测肝癌切除术后复发中的应用，所述的肝癌为原发性肝细胞肝癌。

本发明的组织snoRNA组合用于肝癌患者术后复发风险预测的优越性在于：第一，肿瘤组织标本易于获得，且RT-qPCR检测手段所需组织量极少，少量组织标本可用于多次检测。第二，snoRNA表达丰度较高且稳定性好，检测便利。第三，实验方法非常成熟，检测过程简便、易于重复，由普通的技术员均可以完成。第四，本发明运用基因芯片技术筛选目标基因，并在独立验证组验证，对组织snoRNA组合以及诊断试剂盒的预测效果进行了全面评估，以上方法和策略的应用保证了本发明在肝癌临床预后预测中的潜在应用价值，并为其他疾病生物标志物的研制提供可借鉴的方法策略。第五，组织snoRNA预测肝癌复发试剂盒能及时反映肝癌患者术后复发风险，避免低风险患者的过度治疗并对高风险患者进行预警，便于临床医生及时采取个性化的预防复发的方案。

附图说明

附图1为本发明实施例4、5中的ROC曲线图。训练组(A)、验证组(B)中组织snoRNA组合预测肝癌患者术后2年内复发的ROC曲线；

附图2为本发明实施例6在训练组、验证组中的ROC曲线图。训练组(A)、验证组(B)中组织snoRNA组合、肿瘤大小、肿瘤数目、血管侵犯及TNM分期预测肝癌患者术后2年内复发的ROC曲线；

具体实施例

为使本发明更加容易理解，下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围；所描述的附图也仅是示意性的，被认为是非限制性的。

实施例1：肿瘤组织标本的采集及制备

发明人采集了于2006年1月至2011年11月间接受肝癌切除术的肝癌患者(HCC)的肿瘤组织标本，这些人群满足以下入组标准，并根据性别、年龄匹配的原则，设定肝癌及其对照组标本。入组标准：(1)原发性肝癌，初治且行根治性手术切除；(2)年龄在18—80岁之间；(3)确诊时无伴随肝外转移；(4)术前未患其他恶性疾病，且或术后复发前无抗癌治疗；(5)术后未出现任何器官严重失调症状。

训练组：2006年1月至2009年12月间接受肝癌切除术的HCC肿瘤组织标本174例。

验证组：2010年1月至2011年11月间接受肝癌切除术的HCC肿瘤组织标本109例。上述参与人群的临床特征见表1。

切除术后获得HCC肿瘤组织，立即冻存于液氮或使用RNALater处理，保存于超低温冰箱(-80℃)。

表1 训练组及验证组参与者的临床病理特征

实施例2：基因芯片及其数据分析

发明人选取5例肝癌组织和3例正常的肝组织(肝血管瘤的瘤旁肝组织)标本用于基因芯片筛选。这些标本来自2005-2006年进行HCC根治性切除术或血管瘤切除术的患者，均经病理学确诊，并于切除术后立即冻存于液氮。

芯片由博奥公司(CapitalBio Corp)制作完成，共检测281个snoRNA的水平。得到的原始数据经校准后，发明人采用Significant Analysis of Microarray(SAM)分析方法挑选差异snoRNAs，最终筛选得到28个用于后续验证的候选snoRNAs：ACA3，U15a，U19，ACA21，ACA31，U31，U35B，ACA38，U35b，snR38c，U42B，U44，ACA52，U52，U53，U54，U58b，U60，ACA61，U70，U75，U78，U81，U106，HBII-142，HBII-296，HBII-202，HBII-420。

实施例3：实时荧光定量PCR检测训练组标本snoRNAs水平

1.组织RNA提取

本发明采用Trizol试剂提取，具体步骤如下：(1)对于RNALater或液氮中保存的组织，按每50mg组织加入1ml Trizol的比例裂解细胞；(2)转移Trizol裂解液到1.5ml的Rnase free EP管中振荡混匀，室温放置5min后加入1/5裂解液体积的氯仿，振荡混匀，4℃、12000g离心15min；吸上清，加入等体积异丙醇，室温放置10min，于4℃、12000g离心30min；(3)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀两次，小心倾倒上清，待酒精挥发尽后加入适量DEPC水溶解RNA，-80℃保存备用。

表2 本发明采用的候选snoRNA及内源参照的引物序列

2.实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)

本发明优选地采用MMLV反转录试剂盒(Promega)对等量的组织RNA进行逆转录。进一步优选地采用SYBR Green qPCR master mix试剂盒(life)，以上述cDNA为模板，DNA寡核苷酸引物(由英骏公司合成，引物信息见表2)进行RT-qPCR检测。

通过内源参照U6校准，得到目标snoRNA的表达值2^-ΔCt(ΔCt＝Ct_taget-Ct_reference)。结果显示，28个候选snoRNAs在肝癌患者肿瘤组织中差异性表达。

实施例4：训练组中确定最优组织snoRNA组合

将训练组标本按照28个snoRNAs各自检测水平从大到小排列，并依次取值(如有重复值则只取一次)，根据取值将标本判定为阳性或阴性类群，结合标本的既定类别分析获得每次取值的敏感性和特异性，进一步绘制ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve)。寻找使(敏感性+特异性)/2值达到最大的点，该点对应的表达数值即为snoRNA离散化的阈值。进一步将高或低于阈值的标本分别赋值为1或0，实现离散化，用于下一步的模型构建。本发明采用的snoRNAs离散化阈值(表3)将用于训练组、验证组中相应snoRNA数据的离散化，从而将连续变量转变为二分类变量。利用支持向量机和交叉验证的方法对获得的28个snoRNA进行分类器的建立，最终获得一个由7个snoRNA分子组成的组合，可有效地预测肝癌病人术后2年内复发的风险。为了简化试剂盒的使用，利用上述7个snoRNA进行患者术后复发的COX比例风险模型分析，并获得用于计算患者复发风险值的计算式：患者复发风险值＝0.178*U15a-0.496*U19+0.588*ACA21+0.402*ACA31-0.198*U42b+0.271*U52+0.321*ACA61，其中U15a、U19、ACA21、ACA31、U42b、U52和ACA61为相应组织snoRNA检测水平离散化后的数值，风险值以0.49为预测阈值，高于0.49则预测为高复发风险，低于0.49则预测为低复发风险。

表3 本发明采用的snoRNAs的引物信息及离散化阈值

该snoRNA组合在训练组中可区分发生和未发生术后2年内复发的肝癌患者，能有效地预测肝癌患者是否发生2年内复发(AUC为0.67，附图1A)，且相较肿瘤大小、肿瘤数目、血管侵犯及TNM分期，对肝癌患者发生2年内复发的预测效果更优，表现在该snoRNA组合的AUC大于其他指标(附图2A)。

实施例5：验证组中验证组织snoRNA组合诊断肝癌的效果

在训练组中确立的组织snoRNA组合被用于验证组预测肝癌患者复发情况。同样地，采用Trizol提取以及实时荧光定量PCR检测方法进行实验。所述组合在验证组中仍可区分发生和未发生2年内术后复发的肝癌患者，能有效地预测肝癌患者是否发生2年内复发(AUC为0.66，附图1B)，且相较肿瘤大小、肿瘤数目、血管侵犯及TNM分期，对肝癌患者发生2年内复发的预测效果更优，表现在该snoRNA组合的AUC大于其他指标(附图2B)。

实施例6：组织snoRNA组合在肿瘤大小、肿瘤数目、血管侵犯及TNM分期不同的肝癌患者中的预测效果

本发明进一步证明了组织snoRNA组合，在肿瘤直径小于5cm、肿瘤数目为单个、无血管侵犯及TNM分期为I期的肝癌患者中预测患者术后2年内复发可能(训练组：表4，验证组：表5)。具体表现为被该snoRNA组合预测为高风险的患者，发生术后2年内复发的可能性显著高于低风险的患者。

表4 训练组中组织snoRNA组合评估小肝癌、单个肿瘤、无血管侵犯及TNM分期为I期的肝癌患者术后复发风险

表5验证组中组织snoRNA组合评估小肝癌、单个肿瘤、无血管侵犯及TNM分期为I期的肝癌患者术后复发风险

实施例7：多因素分析与复发相关的因素：组织snoRNA组合、肿瘤大小、肿瘤数目、血管侵犯及TNM分期

本发明分析了组织snoRNA组合是否为预测肝癌早期复发的独立预后预测因素。多因素COX分析中，组织snoRNA组合可以作为独立预测早期复发(训练组：P<0.001，表6；验证组：P＝0.016，表7)的因素。具体表现为，将单因素分析中具有显著差异的指标纳入多因素分析，组织snoRNA组合对肝癌患者2年内复发风险的预测仍具有显著意义(P<0.05)。

表6 训练组中单因素及多因素分析与复发相关的指标

表7 验证组中单因素及多因素分析与复发相关的指标

实施例8：组织snoRNA试剂盒的制作

本发明试剂盒用于评估肝细胞肝癌患者接受切除术后复发风险，由组织snoRNA提取系统、反转录系统、实时荧光定量PCR系统、引物系统以及用于评估是否罹患肝癌的COX回归分析方法组成。

所述试剂盒的组织RNA提取系统中，发明人优选地采用Trizol试剂提取获得组织RNA。发明人采用MMLV反转录试剂盒(Promega)进行逆转录，进一步优选地采用SYBR Green qPCRmaster mix(life)试剂盒，运用RT-qPCR技术检测以下分子：U15a、U19、ACA21、ACA31、U42b、U52、及ACA61，引物由英俊公司合成，内源参照为U6。具体引物序列见表3。而用于评估肝癌患者接受切除术后复发风险的公式为：患者复发风险值＝0.178*U15a-0.496*U19+0.588*ACA21+0.402*ACA31-0.198*U42b+0.271*U52+0.321*ACA61，其中U15a、U19、ACA21、ACA31、U42b、U52和ACA61为相应组织snoRNA检测水平离散化后的数值，风险值以0.49为预测阈值，高于0.49则预测为高复发风险患者，低于0.49则预测为低复发风险患者。