粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法及应用

摘要

本发明提供了粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法，包括针对小鼠IDS基因设计靶点，合成寡核苷酸链，合成的寡核苷酸链经退火与pUC57‑T7‑sgRNA质粒进行连接，获得sgRNA表达载体；获得小鼠受精卵；将转录好的Cas9mRNA和sgRNA混合均匀得到RNA混合物，将RNA混合物显微注射至小鼠受精卵的细胞质，随后将存活的受精卵植入雌性小鼠体内，繁殖获得F0代小鼠；提取F0代小鼠的基因组DNA，作为模板，进行PCR反应，产物经酶切，选择突变小鼠，从而确定Founder小鼠；Founder小鼠与野生型雄性小鼠交配获得F1代小鼠。本发明还提供了由该方法构建的动物模型以及该模型在研究粘多糖贮积症II型中的用途。

说明书

技术领域

本发明属于医学生物学技术领域，具体地，本发明涉及一种动物模型的构建方法。

背景技术

小鼠疾病模型在研究人类疾病致病机理和药物筛选中起到了关键作用，特别是在评价药物治疗效果及治疗方式的选择上具有重要价值。

基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。这是一项复杂的分子生物学技术，又称为“基因打靶”技术，到目前为止，利用该技术已构建了数千种基因突变小鼠模型。然而这项传统的基因敲除方法因流程复杂、耗时长、费用大，近些年来，大家都在寻找一种更快速、更经济且适用性强的新方法。

粘多糖贮积症II型(Mucopolysaccharidosis type II，MPS II，MIM309900)，又称Hunter综合征，是一种X连锁隐性遗传病，由于基因突变导致溶酶体酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)缺乏，以致粘多糖(mucop01ysaccharides，MPS)在体内大量沉积，尿中大量排出硫酸皮肤素(dermatin sulfate B，DS)、硫酸已酰肝素(heparitinsulfate，HS)。患者出生时表现一般正常，但随着越来越多的粘多糖贮积在体内，MPS II病程进行性加重，症状典型，预后甚差。IDS基因定位于Xq27.3-Xq28，MPS II与IDS基因发生突变高度相关。由于发病率极低，又被称为“孤儿病”。目前，世界上该疾病的研究及治疗仍比较困难。

发明内容

针对当前动物模型构建时存在的过程复杂、条件苛刻、费用巨大，以及当前粘多糖贮积症II型研究中缺少可研究的动物模型的问题，本发明提供了一种粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法，由该方法获得的动物模型，以及该动物模型在研究粘多糖贮积症II型中的用途。

第一方面，本发明提供了一种粘多糖贮积症II型动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)针对小鼠IDS基因设计靶点，合成寡核苷酸链，合成的寡核苷酸链经退火与pUC57-T7-sgRNA质粒进行连接，获得sgRNA表达载体；

(2)获得小鼠受精卵；

(3)将转录好的Cas9mRNA和sgRNA混合均匀得到RNA混合物，将RNA混合物显微注射至小鼠受精卵的细胞质，随后将存活的受精卵植入雌性小鼠体内，繁殖获得F0代小鼠；

(4)提取F0代小鼠的基因组DNA，作为模板，采用包含sgRNA作用靶点的引物，进行PCR反应，产物经酶切，选择突变小鼠，从而确定Founder小鼠；

(5)Founder小鼠与野生型雄性小鼠交配获得F1代小鼠。

前述的构建方法，步骤(1)中合成如下两对寡核苷酸链：

ms Ids E5-1-sgRNA1：TAGGACAAAGCAGATTGGCG和AAACCGCCAATCTGCTTTGT；

ms Ids E5-2-sgRNA2：TAGGATGTGGCAGATGTGCCTGA和AAACTCAGGCACATCTGCCACAT。

前述的构建方法，在步骤(2)中，以4-5周龄的雌性小鼠为供体，腹腔注射PMSG和hCG进行超数排卵，随后与雄性小鼠交配，次日获得小鼠受精卵。

前述的构建方法，步骤(4)中，包含sgRNA作用靶点的引物是：

ms Ids E5C9正向引物：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT；

ms Ids E5C9反向引物：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT。

前述的构建方法，步骤(4)中，PCR反应的体系是50μL，PCR反应的条件是：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，随后72℃延伸10min。

前述的构建方法，步骤(4)中，采用T7核酸内切酶进行酶切。

前述的构建方法，步骤(4)中，选择突变小鼠之后，先通过TA克隆、测序进一步检测确定突变，之后再确定Founder小鼠。

前述的构建方法，还包括粘多糖贮积症II型动物模型的基因型鉴定，包括步骤：提取F1代小鼠的基因组DNA；设计包含sgRNA作用靶点的引物，并以提取的F1代小鼠的基因组DNA为模板，进行PCR反应，对PCR反应的产物进行测序。

前述的构建方法，所述包含sgRNA作用靶点的引物是：

ms Ids E5C9正向引物：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT；

ms Ids E5C9反向引物：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT。

前述的构建方法，所述PCR反应的反应体系是50μL，反应条件是：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，随后72℃延伸10min。

前述的构建方法，还包括粘多糖贮积症II型动物模型的表型分析，包括步骤：分别提取F1代小鼠和雄性野生型小鼠的心脏、肝脏、脾脏和肾脏四种组织，制作成组织切片，对组织切片阿尔新蓝染色，并将F1代小鼠的组织切片与雄性野生型小鼠的组织切片进行比较。

第二方面，本发明提供了第一方面的构建方法构建的粘多糖贮积症II型动物模型。

前述的粘多糖贮积症II型动物模型，X染色体的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因的核苷酸18956-18975bp缺失，其序列是AACTCCACGCCAATCTGCTT。

第三方面，本发明提供了第一方面的构建方法构建的粘多糖贮积症II型动物模型或者第二方面的粘多糖贮积症II型动物模型在研究粘多糖贮积症II型中的用途。

本发明的技术方案至少具有如下有益效果：

(1)本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立的粘多糖贮积症II型小鼠动物模型为进一步深入研究粘多糖贮积症II型的致病机理及治疗效果评价提供了极其重要的动物模型。

(2)采用本发明的方法获得粘多糖贮积症II型小鼠动物模型的周期短，仅需2个月。

(3)采用本发明获得的IDS基因敲除模型鼠，其基因型标记为X^-idsX^ids，为表现型正常的小鼠，可在实验室中正常培养，通过与野生型C57BL/6雄性小鼠(基因型为X^idsY)交配，其基因可稳定遗传，发明人成功建立了一种基因可稳定遗传的IDS基因敲除模型鼠品系。其与野生型C57BL/6雄性小鼠(基因型为X^idsY)交配获得F1代小鼠，F1代小鼠中理论上有25％的小鼠其基因型为X^-idsY，即粘多糖贮积症II型小鼠动物模型(基因型为X^-idsY)，同时理论上有25％的小鼠的基因型为X^-idsX^ids，即IDS基因敲除模型鼠(基因型为X^-idsX^ids)。这种情况下，一旦获得IDS基因敲除模型鼠(基因型为X^-idsX^ids)，就只需在实验室中进行简单的自然交配过程就会获得粘多糖贮积症II型小鼠动物模型(基因型为X^-idsY)，而不需要再重新进行复杂的基因敲除实验。因此，本发明的方法获得了一种可同时生产IDS基因敲除模型鼠和粘多糖贮积症II型小鼠动物模型的IDS基因敲除模型鼠，这是本发明技术方案中的最巧妙之所在。

附图说明

图1为RNA介导的Cas9系统定向基因组修饰作用机制示意图；

图2为CRISPR/Cas9介导的IDS基因修饰情况分析；

图3为靶点处DNA序列结构示意图；

图4(A)和图4(B)为粘多糖贮积症II型小鼠动物模型的基因型鉴定测序结果；

图5为粘多糖贮积症II型小鼠动物模型组织切片阿尔新蓝染色结果。

具体实施方式

为充分了解本发明之目的、特征及功效，借由下述具体的实施方式，对本发明做详细说明，但本发明并不仅仅限于此。下述具体实施方式中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述具体实施方式中所涉及的物质均为常规市购得到。

本发明所涉及的CRISPR/Cas9基因敲除技术，是继锌指核酸酶、TALEN等技术后可用于定点构建基因敲除鼠的最新一代方法，在定向对基因进行修饰上展现出巨大的潜力。本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术提供一种粘多糖贮积症II型小鼠动物模型及其构建方法，为进一步深入研究粘多糖贮积症II型的致病机理及治疗效果评价提供了极其重要的动物模型。

I.粘多糖贮积症II型小鼠模型的构建

1.CRISPR靶向修饰基因载体的构建

针对IDS基因发明人设计了两个靶点(针对Mouse BAC-146N21Chromosome Xcontains iduronate-2-sulfatase gene(小鼠BAC-146N21X染色体含有的艾杜糖-2-硫酸酯酶基因)(Accession：AC002315)的5号外显子(核苷酸18934-19134bp)的18963-18981bp核苷酸区域和18985-19005bp核苷酸区域，其中ms Ids E5-1-sgRNA1针对18963-18981bp核苷酸区域，ms Ids E5-2-sgRNA2针对18985-19005bp核苷酸区域)，合成两对寡聚核苷酸链(ms Ids E5-1-sgRNA1：TAGGACAAAGCAGATTGGCG和AAACCGCCAATCTGCTTTGT；ms Ids E5-2-sgRNA2：TAGGATGTGGCAGATGTGCCTGA和AAACTCAGGCACATCTGCCACAT)用于制备sgRNA(smallguide RNA，小向导RNA)，其作用机理如图1所示。合成的寡聚核苷酸经退火(95℃5min后自然降至室温)，连入经BsaI酶切回收的pUC57-T7-sgRNA表达载体(Addgene，NO.51132)，构建sgRNA表达载体。通过测序验证连入片段是否正确，选择正确的克隆，扩大培养后提取质粒用于准备体外转录模板。

Cas9(D10A)表达质粒(Pst1374-NLS-Cas9-ZF)，经AgeI酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板，用于体外转录。Cas9mRNA的合成由试剂盒T7UltraKit(Ambion，AM1345)在体外利用T7RNA聚合酶完成。sgRNA表达载体DraI酶切线性化后，经酚氯仿抽提纯化，溶于无核酸酶的水中作为模板，用于体外转录。sgRNA的体外合成由试剂盒MEGAshortscript Kit(Ambion，AM1354)在体外利用T7RNA聚合酶完成。

2.胚胎供体小鼠超排卵

PMSG(血清促性腺激素)处理供体雌性小鼠，46小时后注射hCG(人绒毛膜促性腺激素)，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射。

3.显微注射及胚胎移植

转录好的Cas9mRNA和sgRNA混合并调整浓度至20ng/μl和12.5ng/μl每种sgRNA，显微注射法将RNA混合物注射到小鼠受精卵的细胞质，将存活的143枚受精卵移植至5只假孕C57BL/6雌性小鼠，每个假孕雌性小鼠体内移植28枚受精卵。约3周后小鼠出生，共获得19只F0小鼠，存活17只。

4.Founder小鼠鉴定

胚胎移植的小鼠将在手术后19天左右出生，待小鼠出生20天后剪尾提取DNA并进行PCR鉴定。设计一对引物包含sgRNA作用靶点(ms Ids E5C9For：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT和ms Ids E5C9Rev：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系50μL(PCR反应相关试剂购自天根生化科技(北京)有限公司)。反应条件：95℃5min；(95℃30s，55℃30s，72℃30s)，30个循环；72℃10min；保存4℃。扩增片段大小466bp。用PCR纯化试剂盒(北京天根)纯化PCR产物。取100ng纯化后的PCR产物在NEB Buffer 2中变性、复性后，用T7核酸内切酶(NEB，M0302L)37℃孵育40min，然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分离。T7核酸内切酶能够识别不完全配对的双链DNA，并进行切割，如果CRISPR/Cas9对靶点造成了突变，将能够被该酶识别，并造成双链DNA断裂。因此，在琼脂糖凝胶电泳中存在除PCR产物带之外的条带，说明退火产物能够被T7核酸内切酶识别并切割，表明靶点DNA序列可能存在突变(图2)。为进一步验证突变存在，以及突变的具体情况，通过TA克隆、测序进一步检测确定突变(图3)。

5.Founder小鼠与野生型小鼠交配得到F1

待雌性Founder小鼠到4周龄，可与野生型雄性小鼠交配，小鼠出生20天后PCR鉴定。若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞，标志品系建立成功。获得IDS基因敲除模型鼠，其基因型标记为X^-idsX^ids。选用F0代23-1号雌性小鼠(基因型为X^-idsX^ids)与野生型C57BL/6雄性小鼠(基因型为X^idsY)交配获得F1代小鼠。

II.粘多糖贮积症II型小鼠动物模型的基因型鉴定

待F1代小鼠出生20天后，剪取F1代雄性小鼠和野生型C57BL/6雄性小鼠尾尖，提取小鼠基因组DNA，扩增目的基因。设计一对引物包含sgRNA作用靶点(ms Ids E5C9For：AGTTCTGGTCTGGAGACACAATT和ms Ids E5C9Rev：AGGCATCCTGGTAGGTAGGTTAT)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系50μL(PCR反应相关试剂购自天根生化科技(北京)有限公司)。反应条件：95℃5min；(95℃30s，55℃30s，72℃30s)，30个循环；72℃10min；保存4℃。扩增片段大小466bp。用PCR纯化试剂盒(北京天根)纯化PCR产物，纯化后的PCR产物直接送测序，测序结果如图4(A)和图4(B)所示，获得了粘多糖贮积症II型小鼠动物模型，其基因型为X^-idsY，测序结果显示其缺失Mouse>-idsY)。

III.粘多糖贮积症II型小鼠动物模型的表型分析

颈椎脱臼法牺牲小鼠，提取粘多糖贮积症II型小鼠动物模型(基因型为X^-idsY)和雄性野生小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏四种组织，并制作以上四种组织的石蜡组织切片，切片制作好后，可对切片进行阿尔新蓝染色。阿尔新蓝属于阳离子染料，是显示酸性黏液物质最特异的染料。通过与野生型鼠组织切片的阿尔新蓝染色比对(图5)可发现，粘多糖贮积症II型小鼠动物模型(基因型为X^-idsY)的心脏、肝脏、脾脏、肾脏组织中有明显的粘多糖聚集现象，由此证明，粘多糖贮积症II型小鼠动物模型构建成功。

最后，需要注意的是：以上列举的仅是本发明的具体实施例子，当然本领域的技术人员可以对本发明进行改动和变型，倘若这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，均应认为是本发明的保护范围。