一种基于腺病毒载体表达全长西妥昔单抗治疗肿瘤的方法

摘要

本发明涉及一种基于腺病毒载体表达全长西妥昔单抗治疗肿瘤的方法。首次采用腺病毒载体成功、高效地表达了西妥昔单克隆抗体，所获得的单克隆抗体生物活性良好，用于动物可达到有效的治疗作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和病毒学领域，更具体地，本发明涉及一种基于腺病毒载体表达全长西妥昔单抗治疗肿瘤的方法。

背景技术

西妥昔单抗(cetuximab)是第一个在全球多个国家获准上市，是靶向作用于表皮生长因子受体(EGFR)的人鼠嵌合型lgG1单克隆抗体(Iressa:firstangiogenesis inhibitor approved for the treatment of advanced NSCLC.ExpertRev Anticancer Ther，2003.3(3):p.257)。西妥昔单抗可与EGFR特异性结合，竞争性阻断表皮生长因子和其配体的结合，并且，与EGFR结合的亲和性是天然配体EGF的10倍。结合后可抑制EGFR的异源二聚体化，并下调其下游基因，阻断PI3K-AKT，RAS-RAF-MAPK等信号传导途径，这些途径在肿瘤细胞的增殖、浸润和抑制细胞凋亡中发挥重要作用。西妥昔单抗还能使EGFR被内吞，从而降低EGFR的表达。此外，还可能通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀死目标细胞。西妥昔单抗通过以上这些途径阻断肿瘤细胞增殖、转移、侵袭以及血管生成，达到治疗肿瘤的目的。

研究发现，许多直肠结肠癌、头颈部癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、肾癌等患者的癌细胞都存在EGFR过表达，这就预示着西妥昔单抗可能成为这些癌症的候选药。目前，西妥昔单抗已经作为一线治疗药物联合相关的化疗药，用于转移性直肠结肠癌和头颈部鳞状细胞癌的治疗。同时，西妥昔单抗联合其他化疗药治疗非小细胞肺癌、转移性胰腺癌、晚期胃癌等也进入Ⅲ期临床试验。

目前，临床上使用的西妥昔单抗是在哺乳动物细胞(鼠类骨髓瘤细胞)中培养生产的。此方法存在制备周期长，工艺复杂，杂交瘤细胞不稳定和抗性易丢失等缺陷，使得西妥昔单抗的制备成本较高，使用西妥昔单抗治疗一个疗程的费用大概为2.4万人民币，一年则需要115万人民币，昂贵的费用使受益于西妥昔单抗的病人难以承担。

因此，本领域迫切需要开发降低成本的制备西妥昔单抗的方法，以显著性地降低临床病人的治疗成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于腺病毒载体表达全长西妥昔单抗治疗肿瘤的方法。

在本发明的第一方面，提供一种表达全长西妥昔单克隆抗体的方法，所述方法包括：应用腺病毒表达全长西妥昔单克隆抗体。

在一个优选例中，所述方法中，由腺病毒载体来形成所述的腺病毒，所述的腺病毒载体中包含表达西妥昔单克隆抗体的元件。

在另一优选例中，所述方法中，形成所述腺病毒的腺病毒载体以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68载体或E1和E3缺失的人Hu5载体作为骨架载体。

在另一优选例中，所述方法中，所述的表达西妥昔单克隆抗体的元件依次(按照5’→3’顺序)包括：启动子，信号肽1编码序列，西妥昔单克隆抗体重链编码序列，连接序列，信号肽2编码序列，西妥昔单克隆抗体轻链编码序列，终止子。

在另一优选例中，所述方法中，所述的启动子包括：CASI启动子，CMV启动子；较佳地为CASI启动子；或所述的终止子包括(但不限于)：SV40PloyA，BGH PloyA；较佳地为BGH PloyA。

在另一优选例中，所述方法中，所述的信号肽1或信号肽2是分泌信号肽；较佳地包括：HLA-A*0201信号肽；较佳地，所述的信号肽1和信号肽2相同或不同。

在另一优选例中，所述方法中，所述的连接序列包括：F2A，2A，IRES；较佳地为F2A。

在另一优选例中，所述方法中，所述的西妥昔单克隆抗体重链编码序列如SEQ ID NO:1中第1-1356位所示，或所述的西妥昔单克隆抗体轻链编码序列如SEQ ID NO:1第1357-1998位所示。

在另一优选例中，所述方法中，形成所述的腺病毒载体以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68载体或人AdHu5载体作为骨架载体，所述的表达西妥昔单克隆抗体的元件被插入到该载体中被删除的E1区域。

在另一优选例中，所述方法中，所述的表达全长西妥昔单克隆抗体的方法是非诊断或治疗性的方法。

在本发明的另一方面，提供一种腺病毒表达载体，该载体以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68载体或人AdHu5载体作为骨架载体；且依次(按照5’→3’顺序)包括以下表达西妥昔单克隆抗体的元件：启动子，信号肽1编码序列，西妥昔单克隆抗体重链编码序列，连接序列，信号肽2编码序列，西妥昔单克隆抗体轻链编码序列，终止子。

在一个优选例中，所述的腺病毒表达载体中，所述表达西妥昔单克隆抗体的元件被插入到该载体中被删除的E1区域。

在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体中，所述的启动子包括：CASI启动子，CMV启动子；较佳地为CASI启动子；或所述的终止子包括(但不限于)：SV40PloyA。

在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体中，所述的信号肽1或信号肽2是分泌信号肽；较佳地包括：HLA-A*0201信号肽；较佳地，所述的信号肽1和信号肽2相同或不同。

在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体中，所述的连接序列包括：F2A，2A，IRES；较佳地为F2A。

在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体中，所述的西妥昔单克隆抗体重链编码序列如SEQ ID NO:1中第1-1356位所示，或所述的西妥昔单克隆抗体轻链编码序列如SEQ ID NO:1第1357-1998位所示。

在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体中，以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68载体作为骨架载体时，所述腺病毒表达西妥昔单抗的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；或以E1和E3缺失的人pHu5载体作为骨架载体时，所述腺病毒表达西妥昔单抗的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的另一方面，提供所述的腺病毒表达载体的用途，用于制备腺病毒，所述的腺病毒能表达全长西妥昔单克隆抗体。

在本发明的另一方面，提供一种腺病毒，所述腺病毒由所述的腺病毒表达载体制备而成。

在一个优选例中，将所述的腺病毒表达载体线性化后，转入病毒生产细胞如HEK 293细胞，从而制备腺病毒。

在本发明的另一方面，提供所述的腺病毒的用途，用于制备抗肿瘤药物。

在本发明的另一方面，提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括所述的腺病毒，以及药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于表达全长西妥昔单克隆抗体的试剂盒，所述的试剂盒中包括：所述的腺病毒表达载体，或所述的腺病毒；或所述的抗肿瘤药物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、全长Cetuximab表达框示意图。单抗基因插入腺病毒载体被删除的E1区域，由CASI启动子启动表达，单抗重链lgG HC、轻链lgG LC前面分别带有分泌信号肽HLA-A*0201，中间由F2A连接，后面带有SV40 PloyA。

图2、重组腺病毒质粒酶切鉴定。A：重组腺病毒质粒pAdC 68-CTB经Bgl Ⅱ、Xho Ⅰ、Mfe Ⅰ酶切鉴定；B：重组腺病毒质粒pHu 5-CTB经Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ酶切鉴定。

图3、重组腺病毒基因组酶切鉴定。A：重组腺病毒AdC 68-CTB基因组经Bgl Ⅱ、Xho Ⅰ、Mfe Ⅰ酶切鉴定；B：重组腺病毒Hu 5-CTB基因组经BglⅡ、Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ酶切鉴定。

图4、Western Bolt检测重组腺病毒体外表达全长Cetuximab。10¹⁰vp/孔重组腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB感染HEK>10vp/孔AdC68-empty、Hu5-empty为阴性对照，24h后收取细胞上清。以商业化Cetuximab为阳性对照。A为非还原条件下，全长单抗的表达；B为还原条件下，重链和轻链的分别表达。

图5、ELISA检测Cetuximab在体外的表达量。以10¹⁰vp、10⁹vp/孔重组腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB感染MRC>8vp、10⁷vp/孔重组腺病毒感染HEK>10vp、10⁹vp、10⁸vp、10⁷vp/孔空载腺病毒AdC68-empty、Hu5-empty为阴性对照。

图6、间接免疫荧光检测重组腺病毒所表达Cetuximab结合特异性。选取EGFR⁺的HCEpi>-的CHO细胞，以注射AdC68-CTB、Hu5-CTB小鼠血清为实验组，AdC68-empty、Hu5-empty小鼠血清为阴性对照组，商业化Erbitux为阳性对照组。

图7、间接ELISA检测重组腺病毒所表达Cetuximab的亲和力。以注射AdC68-CTB、Hu5-CTB小鼠血清为实验组，商业化Erbitux为阳性对照，Cetuximab单抗的亲和性通过检测EC₅₀值进行比较。

图8、MTT检测重组腺病毒对结肠癌细胞的增殖的影响。结直肠癌细胞系DiFi和NCI-H508经10⁷、10⁸和10⁹vp重组腺病毒处理72h后，MTT检测细胞增殖活性。

图9、裸鼠肿瘤模型评估重组腺病毒对结肠癌的抑制作用。A为早期治疗组；B为晚期治疗组。

图10、NCI-H508肿瘤中增殖特异性蛋白Ki-67的免疫组化检测。Ki-67阳性信号呈棕黄色，定位于肿瘤细胞胞核。A：晚期治疗组Ki-67的检测；B：早期治疗组Ki-67的检测。

图11、pAdC68-△E1E3构建示意图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现采用腺病毒载体、特别是E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68载体或人Hu5载体表达西妥昔单克隆抗体，可获得高表达，并且获得的单克隆抗体生物活性良好，所生成的可重组表达西妥昔单克隆抗体的腺病毒能够直接用于动物并达到有效的治疗作用。在此基础上完成了本发明。

现有技术中，西妥昔单克隆抗体的制备一般采用杂交瘤细胞表达的方法，生产过程复杂难以控制，产量有限，规模有限，抗体还易于失去活性或受到污染，采用真核表达系统成本高且表达困难。因此，本发明人对多种表达系统进行了研究，以寻找适合表达西妥昔单克隆抗体的系统，经过大量研究筛选，意外地发现采用优化的腺病毒表达系统来表达西妥昔单克隆抗体，表达效率高，表达稳定，成本低廉，并且获得的妥昔单克隆抗体的生物活性非常好，所生成的可重组表达西妥昔单克隆抗体的腺病毒能够直接用于动物并达到有效的治疗作用。本发明为临床相关的肿瘤治疗提供一种新方法。

腺病毒载体

由于腺病毒的基因组比较大，大约有36kb，使直接克隆重组腺病毒载体成为技术瓶颈。因此，本发明人开发了能通过酶切连接的快速方法直接构建基于黑猩猩型腺病毒AdC68作为表达载体。此外，黑猩猩型腺病毒AdC6、AdC7和人腺病毒AdHu26、AdHu36等也是可用的。作为本发明的优选方式，以E1和E3缺失的黑猩猩型AdC68载体或E1和E3缺失的人Hu5载体作为骨架载体。

单克隆抗体存在重链和轻链，如何高效地实现表达且能够保留活性，本发明人进行了反复的设计研究，针对大量的表达元件进行筛选，最终优化了适合的表达元件，包括启动子、连接序列、信号肽等。因此作为本发明的优选方式，所述的表达西妥昔单克隆抗体的元件依次(按照5’→3’顺序)包括：启动子，信号肽1编码序列，西妥昔单克隆抗体重链编码序列，连接序列，信号肽2编码序列，西妥昔单克隆抗体轻链编码序列，终止子。

作为本发明的优选方式，采用来自口蹄疫病毒(food-and-mouth diseasevirus，FMDV)的核糖体跳跃序列(ribosomal skipping sequence 2A)实现抗体重链与抗体轻链的共表达。2A连接子具有自剪切效率高，上下游两个基因表达平衡性好，结构短小等优点。在2A前面加入Furin蛋白酶酶切位点RAKR后，可以除去2A自剪切后残留在前端蛋白C端的序列，提高连接子的剪切效率，同时避免了2A残留序列对前端蛋白表达的影响。RAKR与2A连接子构成的序列简称F2A。

作为本发明的优选方式，采用CASI作为启动子，其是由CMV、chicken-β-actin、ubiquitin C组成的，其能够维持外源基因西妥昔单抗在肌肉中的持续表达。经过本发明人大量的筛选，认为CASI启动子非常适用于进行西妥昔单抗的表达，其能够极其有效地提高外源基因西妥昔单抗的表达量，并维持其在肌肉中的持续表达。

作为本发明的优选方式，采用HLA-A*0201作为信号肽，本发明人发现，其能够引导新生的多肽通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。较佳地采用经GC优化的HLA-A*0201信号肽，可以提高抗体的分泌水平。

所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。根据本发明的提示，本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子(如CMV)上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

本发明中，所述的西妥昔单克隆抗体是本领域已知的抗体，其重链编码序列可以如SEQ ID NO:1中第1-1356位所示；轻链编码序列可以如SEQ ID NO:1第1357-1998位所示。在单抗的轻链或重链上，经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、但抗原结合能力与西妥昔单克隆抗体相同或近似的单克隆抗体也包括在本发明中。本发明也可采用经修饰或改良的单克隆抗体，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良而形成的单克隆抗体。也就是说，任何不影响单克隆抗体的生物活性的轻链和重链序列变化形式都可用于本发明中。

本发明的上述各元件是可操作性连接的，从而有利于单抗的有效表达。如本文所用，所述的“可操作性相连(或连接)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列，这些序列的可操作性相连可产生功能性产物，如蛋白或RNA分子。

腺病毒

获得所述腺病毒表达载体后，将之转染病毒生产细胞，进行病毒的繁殖。转染后的一段时间后，可以收获病毒。所述的病毒生产细胞可以是本领域公知的各种能够繁殖腺病毒的细胞，例如293细胞等。

作为本发明的优选方式，收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度(TCID₅₀)的测定可以根据本领域常规方法进行。所获得的重组腺病毒也包含在本发明中。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的腺病毒，以及药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

通常，可将所述腺病毒配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。活性成分(腺病毒)的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

在用于抑制哺乳动物肿瘤时，所述的腺病毒可全身性施用，或者局部施用，具体可视肿瘤的种类、生长部位、进展程度等因素决定。

试剂盒或药盒

基于本发明的新发现，本发明还提供了一种用于表达全长西妥昔单克隆抗体的试剂盒/药盒，所述的试剂盒/药盒中包括所述的腺病毒表达载体或所述的腺病毒。所述的试剂盒/药盒还可包括病毒生产细胞(如293细胞)，培养基等。此外，所述的试剂盒/药盒中还可包括说明表达方法后腺病毒使用方法的使用说明书。

本发明人检测了利用本发明的系统表达获得的西妥昔单抗的生物学活性，并在细胞水平与动物模型中检测到其具有良好的抗肿瘤效果，为肿瘤的抗体治疗提供一种新策略。

本发明的重组腺病毒载体生成的重组腺病毒能高效转染哺乳动物细胞、易于扩增及纯化、毒性低，其表达效率高且长久。本发明的腺病毒载体表达重组西妥昔单抗生产工艺简单、价格低廉、疗效持久，优于目前市场上其它方法的表达。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料与方法

1、主要试剂、菌株及实验动物

所有的工具酶均购自New England Biolabs；LipofectatimeTM 2000、氨卞青霉素等均购自Invitrogen；引物合成于金斯瑞生物科技有限公司；质粒小量提取纯化试剂盒、DNA纯化试剂盒、DNA凝胶回收和纯化试剂盒均购自天根生化科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、0.25％胰酶、二抗购自Hyclone。羊抗人lgG-Kappa购自SouthernBiotech，兔抗人lgG Fc(HRP)、lgG H&L(HRP)购自Abcom，羊抗人lgG-FITC购自Santa Cruz，抗兔lgG(HRP)、抗羊lgG(HRP)购自Sigma。

大肠杆菌菌株Stbl 2购自Invitrogen；腺病毒包装细胞系HEK 293细胞、人结直肠癌细胞DiFi和NCI-H508(EGFR⁺)均购自ATCC；CHO中国仓鼠卵巢细胞(EGFR^-)、人胚肺细胞MRC>

2、质粒pAdC68-△E1E3和E1和E3删除的pHu5的构建

(i)质粒pNEB193-KE的构建

根据pNEB193载体(New England Biolabs)上的多克隆位点和腺病毒AdC68基因组的序列，设计扩增KE片段的引物(表1)，PCR扩增目的产物KE片段。EcoR I和Kpn I双酶切PCR扩增的KE片段，琼脂糖凝胶纯化KE片段，连接至经相同酶切的pNEB193载体，转化入DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，经酶切和测序鉴定得到pNEB193-KE。

表1、PCR引物序列

(ii)质粒pNEB193-KE-AK的构建

Asc I和Kpn I双酶切AdC68基因组(GenBank登录号AC_000011)，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收AK片段，连接至经相同酶切的pNEB193-KE载体，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，经酶切鉴定得到pNEB193-KE-AK。

(iii)质粒pNEB193-KE-AK-XA的构建

Xba I和Asc I双酶切AdC68基因组，由于Asc I在腺病毒AdC68存在三个酶切位点，对Asc I进行部分酶切，置于37℃酶切AdC68基因组10s，低熔点凝胶回收酶切的最大的XA片段，连接至经相同酶切的pNEB193-KE-AK载体，酶切鉴定得到pNEB193-KE-AK-XA。

(iv)质粒pNEB193-PX的构建

根据pNEB193载体上的多克隆位点和腺病毒基因组的序列，设计扩增PX片段的引物(表1)，PCR扩增目的产物PX片段。Pme I和Xba I双酶切PCR扩增回收的PX片段，琼脂糖凝胶回收目的产物PX片段，连接至经相同酶切的pNEB193载体，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，其中靠近腺病毒AdC68左端ITR的区域经测序鉴定。Xba I酶切腺病毒AdC68基因组，低熔点琼脂糖凝胶回收获得AdC68中的Xba I-Xba I部分，并替换连接至经Xba I酶切的pNEB193-PX载体中，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，酶切鉴定得到pNEB193-PX。

(v)删除pNEB193-PX质粒中AdC68基因组中E1部分

EcoR I和Mfe I双酶切pShuttle-CMV质粒(Clontech Laboratories，Inc)，依据同尾酶的性质将空载体连接，转化入DH5a感受态细胞中得到pShuttle-EM的质粒。根据pShuttle-EM质粒的序列设计扩增Linker的引物(表1)，PCR扩增Linker产物。SnaB I和Nde I双酶切PCR扩增的Linker片段，琼脂糖凝胶回收Linker产物，连接至经相同酶切的pNEB193-PX载体(通过对AdC68基因组序列分析，利用SnaB I和Nde I两个酶切位点能将其E1部分序列删除)，转化入DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，经酶切鉴定得到pNEB193-PX-Linker。

Linker的序列插入在AdC68基因组第459-3011位之间，替换E1的大部份序列。Linker的序列如下(SEQ ID NO:11)：

cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagacc cataataccc ataatgccat ttcattacct 60

ctttctccgc acccgacata gatgaattgt cggtcaagcc ttgccttgtt gtagcttaaa 120

ttttgctcgc gcactactca gcgacctcca acacacaagc agggagcaga tactggctta 180

actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca taggggatcg ggagatctga 240

gctttcgcta ccttaggacc gttatagtta cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 300

gcggaac 307

(vi)pAdC68-△E1质粒构建

Xba I和Pme I双酶切pNEB193-PX-Linker质粒DNA，并利用琼脂糖凝胶回收PX-Linker片段，连接至经相同酶切的低熔点琼脂糖凝胶回收的pNEB193-KE-AK-XA载体，转化入Stbl2感受态细胞中，挑取阳性克隆，经酶切鉴定得到pAdC68-E1-deleted(pAdC68-△E1)。

(vii)pAdC68-△E1E3构建

以质粒pAdC68-△E1为模板，根据上游引物F：tctcctagggaggaacaacaagca(SEQ ID NO:12)和下游引物R：tggcctaggatttaaataGTCGTTGTCGCAGTGGTTG(SEQ ID NO:13)，PCR得到片段AA，同时，用Avr Ⅱ酶切质粒pAdC68-△E1和片段AA产生相同的粘性末端，用低熔点连接的方法得到重组腺病毒质粒pAdC68-△E1E3，示意图如图11。

E3区被域删除的部分是24679-28414位序列。

(viii)E1和E3删除的pHu5(pHu5-△E1/E3)构建

E1和E3删除的pHu5的构建方法与pAdC68相同。

3、重组腺病毒穿梭载体的构建

全长Cetuximab(重、轻链序列参见GenBank登录号GM685459.1和GM685461.1。重、轻链前端各携带一HLA-A*0201信号肽(其序列为atggccgtgatggcgccgcggaccctggtcctcctgctgagcggcgccctcgccctgacgcagacctgggccggg(SEQ ID NO:14))，并由F2A连接，其编码序列其插入PU57质粒中，成为PUC57-CTB质粒，其全长序列如SEQ ID NO:2。

将合成载体PUC57-CTB质粒经Avr Ⅱ和Cla Ⅰ双酶切，同时将PUC-Promoter(启动子CASI序列见GenBank登录号JB974538.1，SV40ployA序列见JB974550.1，将其插入PU57质粒中，成为PUC-Promoter)经Avr Ⅱ和Cla Ⅰ双酶切得到具有相同粘性末端、线性化的载体，使用T4DNA连接酶对上述两产物的粘端进行连接。按常规方法将连接产物转化，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，在含卡那抗性的LB培养基中37℃过夜培养，提取质粒。采用PCR、酶切等方法进行鉴定，得到阳性重组质粒，命名为pShuttle-CTB。

4、重组腺病毒质粒的制备

将pShuttle-CTB质粒经PI-Sce I和I-Ceu I双酶切，同时将腺病毒载体pAdC68-△E1/E3经PI-Sce I和I-Ceu I双酶切得到具有相同粘性末端、线性化的载体。利用琼脂糖凝胶分离并回收目的片段，同时，利用低熔点琼脂糖凝胶分离腺病毒载体，将含腺病毒载体的凝胶65℃孵育5分钟，待完全溶解后用T4DNA连接酶对上述两产物进行粘端连接。在感受态菌Stbl 2中按常规方法将连接产物转化，随后将转化产物涂至含氨苄抗性的琼脂糖平板上，于30℃培养24h，挑选克隆于含氨苄抗性的LB培养基中30℃过夜培养，提取质粒，用1％琼脂糖凝胶进行电泳迁移率分析，并进行Bgl Ⅱ、Xho I、Mfe I酶切图谱分析。将所得的阳性重组腺病毒质粒菌液扩大培养(1：1000)获得大量高质量的质粒DNA，命名为pAdC68-CTB，其全长序列如SEQ ID NO:3。

克隆重组腺病毒pHu5-CTB方法同上，即将pShuttle-CTB质粒经PI-Sce I和I-Ceu I双酶切，同时将腺病毒载体pHu5-△E1/E3经PI-Sce I和I-Ceu I双酶切、连接获得，并进行Bgl Ⅱ、HindⅢ、Kpn Ⅰ酶切图谱分析。pHu5-CTB的全长序列如SEQ ID NO:4。

5、重组腺病毒的制备

用限制性内切酶Pac I线性化重组腺病毒质粒pAdC68-CTB，按LipofectatimeTM 2000说明书上的方法将质粒转染HEK 293细胞，37℃、5％CO₂培养8-12天，出现明显噬斑。待细胞变圆、悬浮后收集细胞，反复冻融三次后取病毒上清感染HEK>2细胞培养瓶)。然后重复以上步骤，收毒后1：3扩增病毒(感染一个75cm²细胞培养瓶)，之后收毒后按1：6扩增病毒(感染三个150cm²细胞培养瓶)，最后收毒后按约1：9扩增病毒(约25-30个150cm²细胞培养瓶)，利用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒[16]，测OD值，加入终浓度为10％的甘油存于-80℃。重组腺病毒Hu5-CTB制备方法同上。

提取病毒基因组AdC68-CTB，并进行Bgl Ⅱ、Xho I、Mfe I酶切图谱分析。提取病毒基因组Hu5-CTB，并进行Bgl Ⅱ、HindⅢ、Kpn Ⅰ酶切图谱分析。

6、Western blot检测重组腺病毒表达Cetuximab单抗

将重组腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB稀释至浓度10¹¹vp/ml，然后用100ul重组腺病毒感染六孔板HEK>10vp腺病毒，以每孔10¹⁰vpAdC68-empty(空质粒对照)、Hu5-empty(空质粒对照)为阴性对照，24h后收获细胞上清，通过非还原型Western>

7、检测Cetuximab体内外表达量

将处于对数生长期的MRC 5、HEK 293细胞铺于6孔板内，37℃、5％CO₂培育24h，待细胞密度长至80％时，分别以10¹⁰vp、10⁹vp/孔重组腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB感染MRC>8vp、10⁷vp/孔重组腺病毒感染HEK293细胞，分别在3天、5天收取细胞上清。以10¹⁰vp、10⁹vp、10⁸vp、10⁷vp/孔空载腺病毒AdC68-empty、Hu5-empty为阴性对照。

采用5-6周龄的Balb/c裸鼠，将小鼠随机分为4组：AdC68-CTB、Hu5-CTB、AdC68-empty和Hu5-empty，每组6只小鼠。每组以5×10¹⁰vp/100ul重组腺病毒单次肌肉注射，定期采血检测体内抗体表达。

间接ELISA检测蛋白的表达量：用50ng羊抗人lgG Kappa 50ul/孔，4℃过夜包ELISA板，50ul/孔5％脱脂牛奶37℃封闭2h，将细胞上清稀释10倍，血清稀释400倍，以50ul/孔，4℃孵育2h。HRP标记的鼠抗人lgG Fc二抗1：10000稀释50ul/孔，37℃孵育1h。其中，以商业化的Cetuximab以每孔10ng为起始量，2倍梯度稀释绘制标准曲线。

8、检测重组腺病毒所表达Cetuximab结合特异性

HCEpi C、NCI-H 508(EGFR⁺)和CHO(EGFR^-)细胞铺于24孔板内，37℃、5％CO₂培育24h后，将细胞用PBS清洗3次后，用4％多聚甲醛固定5分钟。细胞先经5％脱脂奶粉37℃封闭2h，然后分别用经重组腺病毒免疫的小鼠血清和商业化Cetuximab>

9、检测重组腺病毒所表达Cetuximab的亲和力

用60ng EGFR 50ul/孔包ELISA板4℃过夜，5％脱脂牛奶封闭2h后，将重组腺病毒表达单抗和商业化Cetuximab以每孔80ng为起始量，2倍梯度稀释11个梯度，即每孔稀释至0.078125ng，50ul/孔，4℃孵育2h。将HRP标记的鼠抗人二抗1：10000稀释，50ul/孔，37℃孵育1h后，每孔加入TMB显色液50μl，避光显色5min，注意颜色变化，避免显色过度，及时加入50μl终止液。酶标仪检测OD450数值。

10、检测重组腺病毒对结肠癌细胞的增殖的影响

用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)检测细胞的增殖能力：收集对数生长期的DiFi和NCI-H508细胞，按1×10⁴/孔，铺于96孔板中，每组6个复孔，24h后感染10⁹、10⁸、10⁷vp/孔的重组腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB，以相同剂量的AdC68-empty、Hu5-empty做阴性对照，37℃、5％CO₂培育72h后加入20ul、孔的MTT，常规培养4h后弃上清，每孔加入150ulDMSO，振摇10min，酶标仪检测OD490数值，以时间为横坐标，OD490值为纵坐标，绘制细胞增殖柱状图。

11、裸鼠肿瘤模型评估重组腺病毒对结肠癌的抑制作用

取对数生长期的DiFi、NCI-H508细胞，用Martixgel重悬，计数后按1×10⁷个细胞/100ul注射于裸鼠后肢右侧皮下，恒温、通风、无菌条件下饲养。当移植瘤长到一定大小时(NCI-H508细胞肿瘤模型的早期治疗组大小达到150cm³，晚期治疗组达到600cm³；DiFi细胞肿瘤模型的早期治疗组大小达到80cm³，晚期治疗组达到300cm³)，将小鼠随机分为5组：AdC68-CTB、Hu5-CTB、Erbitux(商业化产品，购自Merck)、AdC68-empty、Hu5-empty，其中，阴性对照组每组6只小鼠，剩余每组10只小鼠。每组以5×10¹⁰vp/100ul重组腺病毒单次肌肉注射，Erbitux组以每只20mg/kg的Erbitux一周两次腹腔注射。开始治疗后，每3天测量一次肿瘤大小和体重，以“最大径×最小径²×0.5”公式计算肿瘤体积。

观察至21天，安乐死小鼠，取瘤体标本，以4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，免疫组化检测Ki-67、p-EGFR的表达。

II.实施例

实施例1、重组腺病毒质粒的构建及鉴定

Cetuximab是一个人鼠嵌合抗EGFR抗体，用于治疗结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌等癌症的单克隆抗体。本发明构建AdC68-△E1/E3、Hu5-△E1/E3表达全长Cetuximab基因，以结直肠癌动物模型为例，考核重组腺病毒表达Cetuximab单抗治疗肿瘤的效果。

如图1所示，携带信号肽(HLA-A*0201信号肽)的重、轻链间用F2A连接，全长单抗经Avr Ⅱ和Cla Ⅰ双酶切后，连接到携带CASI启动子和SV40polyA的穿梭载体pUC57上，构建获得穿梭质粒pUC57-CASI-CTB。pUC57-CASI-CTB、pAdC68-△E1/E3或pHu5-△E1/E3经PI-Sce I和I-Ceu I双酶切以及连接后，得到pAdC68-CTB或pHu5-CTB。

得到的重组腺病毒质粒pAdC68-CTB用Bgl Ⅱ、Xho I、Mfe I酶切鉴定分析，pHu5-CTB用Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ酶切鉴定分析，见图2，与酶切图谱片段大小分析相同，证明重组腺病毒质粒构建正确。

实施例2、重组腺病毒的获得及鉴定

重组腺病毒质粒pAdC68-CTB、pHu5-CTB经Pac I线性化后，用LipofectatimeTM 2000转入HEK 293细胞中，待培养8-12天，出现噬斑，待细胞变圆、悬浮后收集细胞，反复冻融三次后取病毒上清感染HEK>2细胞培养瓶)。重复以上步骤至收集适量病毒(约27-30个150cm²细胞培养瓶)，利用氯化铯密度梯度离心法纯化腺病毒AdC68-CTB，重组腺病毒Hu5-CTB制备方法同上。最终，本发明人获得重组腺病毒AdC68-CTB浓度为8.5×10¹²vp/ml，Hu5-CTB浓度为4.2×10¹²vp/ml。

提取腺病毒基因组AdC68-CTB，并进行Bgl Ⅱ、Xho I、Mfe I酶切图谱分析，见图3A。提取病毒基因组Hu5-CTB，并进行Bgl Ⅱ、HindⅢ、Kpn Ⅰ酶切图谱分析，见图3B，与图谱比较显示酶切片段正确。

实施例3、Western blot检测重组腺病毒表达Cetuximab单抗

10¹⁰vp/孔重组腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB感染HEK>10vp/孔AdC68-empty、Hu5-empty为阴性对照，24h后收取细胞上清。通过非还原型Western>

通过还原型Western blot方法检测Cetuximab重链、轻链的表达，以商业化的Erbitux为阳性对照，见图4B，可以看到在55kd附近和25kd附近各有一特异条带，即目的蛋白的重链和轻链，证明本发明人成功获得了正确的目的蛋白。

实施例4、ELISA检测Cetuximab在体内外的表达

以10¹⁰vp、10⁹vp/孔重组腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB感染MRC>8vp、10⁷vp/孔重组腺病毒感染HEK>10vp、10⁹vp、10⁸vp、10⁷vp/孔空载腺病毒AdC68-empty、Hu5-empty为阴性对照。

通过间接ELISA检测各细胞系中单抗的表达量，以商业化Erbitux绘制标准曲线。体外表达见图5。如图5上图，在非复制型细胞系MRC 5中，第3天时，低剂量AdC68-CTB表达量达到368.8ng/ml，高剂量为598.9ng/ml；低剂量Hu5-CTB几乎不表达，高剂量为648.1ng/ml；在第5天时，AdC68-CTB高剂量组与低剂量组表达量几乎相当，分别为792.9ng/ml、784.5ng/ml，Hu5-CTB高剂量与低剂量组分别为382.4ng/ml、760.1ng/ml。

如图5下图，在复制型细胞系HEK 293中，第3天时，低剂量AdC68-CTB表达量达到945.3ng/ml，高剂量为1803.9ng/ml；低剂量Hu5-CTB为121.58，高剂量为1925.2ng/ml；在第5天时，AdC68-CTB高剂量组与低剂量组表达量几乎相当，分别为2448.5ng/ml、2378.3ng/ml，Hu5-CTB高剂量与低剂量组分别为2334.1ng/ml、2715.4ng/ml。

实施例5、间接免疫荧光检测重组腺病毒所表达Cetuximab结合特异性

AdC68-CTB、Hu5-CTB表达的Cetuximab是一种抗EGFR的单抗，能够特异性识别细胞表面表达的EGFR。

如图6所示，在EGFR⁺的HCEpi>-的CHO细胞表面没有观察到荧光信号，这说明由于缺少EGFR的表达，Cetuximab不能与CHO细胞结合。而商业化的Erbitux在EGFR⁺的细胞表面具有相同的FITC荧光信号强度，这说明，重组腺病毒表达的单抗与商业化的单抗具有相同的活性。

实施例6、间接ELISA检测重组腺病毒所表达Cetuximab的亲和力

通过Binding ELISA计算重组腺病毒与商业化Erbitux的EC₅₀值，从而比较其亲和力。

如图7所示，AdC68-CTB、Hu5-CTB表达的单抗EC50值分别为0.250和0.272，而商业化Erbitux的EC₅₀值为0.264，并没有显著性差异，显示重组腺病毒表达的单抗与商业化单抗的结合EGFR的亲和性并没有差异。

实施例7、MTT检测重组腺病毒对结肠癌细胞的增殖的影响

为了评估重组腺病毒AdC68-CTB、Hu5-CTB能否抑制结直肠癌细胞的生长，本发明人通过MTT实验评估了其对结直肠癌细胞增殖的影响。

结果显示，10⁹、10⁸、10⁷的AdC68-CTB、Hu5-CTB都能显著性抑制DiFi、NCI-H>

实施例8、裸鼠肿瘤模型评估重组腺病毒对结肠癌的抑制作用

重组腺病毒在细胞水平对肿瘤细胞增殖的抑制作用得到验证，本发明人通过裸鼠肿瘤模型进行肿瘤的早期和晚期治疗，进一步探讨重组腺病毒在体内对结直肠癌的抑制作用。在早期治疗组中，DiFi肿瘤模型和NCI-H508肿瘤模型中AdC68-CTB、Hu5-CTB和Erbitux组都能显著性抑制肿瘤的生长，见图9A。

其中，在DiFi肿瘤模型中，AdC68-CTB组经治疗后15天，10只小鼠中已有6只肿瘤完全消失；Hu5-CTB组经9天治疗后，10只小鼠中已有5只肿瘤完全消失。在NCI-H508肿瘤模型晚期治疗组中，治疗21天后，AdC68-CTB、Hu5-CTB和Erbitux组都能显著性抑制肿瘤的生长，见图9B。同时，小鼠体重并无显著性下降，小鼠体征正常，说明腺病毒和Cetuximab单抗并不会对小鼠产生不良影响。对比早期治疗组和晚期治疗组，早期治疗组的效果明显优于晚期治疗组，所以早治疗容易获得较好的疗效。

取肿瘤组织做免疫组化，检测增殖特异性蛋白Ki-67的表达，如图10所示，治疗组AdC68-CTB、Hu5-CTB和Erbitux与对照组相比，Ki-67蛋白表达都有显著降低。

讨论

Cetuximab作为第一个在全球多个国家获准上市，广泛应用于结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌等癌症的单抗，已经被证明有很好的疗效。本发明人进一步成功证明了用重组腺病毒表达全长Cetuximab通过单次肌肉注射给药后，在裸鼠的结直肠癌模型中具有良好抑癌效果。

一般认为通过基因工程的方法表达生物大分子时，很难保证其生物活性，因而产生一个问题：本发明人应用腺病毒载体表达单克隆抗体用于基因治疗是否有效。本发明人的研究结果表明，腺病毒表达抗体的基因治疗方法完全可行。首先，通过间接免疫荧光实验本发明人证明了腺病毒表达的单抗与商业化单抗相似，都与细胞表面的EGFR有特异性的亲和作用；然后，本发明人进一步通过Binding ELISA发现腺病毒表达的单抗与商业化单抗具有相似的EC₅₀值，证明其与商业化单抗对EGFR具有相同的亲和力。同时，体外对结直肠癌细胞增殖的抑制实验和体内对裸鼠肿瘤的抑制实验都表明，体内外腺病毒表达的全长单抗都具有生物活性。以上各种实验证明重组腺病毒载体表达Cetuximab单抗具有高表达效能，表达的单抗具有高度的生物活性，在肿瘤动物模型中，重组腺病毒可明显抑制肿瘤生长，甚至达到治愈效果。

目前在临床上，Cetuximab单抗的使用剂量为一星期输注一次，起始剂量是400mg每平方米体表面积，之后每周的剂量为250mg每平方米体表面积，使用剂量大且频繁[17]。同时，单克隆抗体的制备、纯化过程繁琐，要求严格，导致单抗的价格昂贵，使受益于该单抗的病人在接受治疗时受到极大限制。由于腺病毒制备、纯化简单、产量高、安全性好、外源表达时间长等特点，因此本发明人研发的腺病毒表达Cetuximab单抗成本低，疗效好，可充分满足临床病人的需求。另外，本发明人克隆于腺病毒载体的Cetuximab单抗是一种可分泌的蛋白，因此，本发明人除了可以将重组腺病毒直接用于注射治疗外，还能将重组腺病毒感染适宜细胞后收获高浓度的Cetuximab的单抗，然后以纯化的单抗应用于肿瘤治疗或其它临床与科研。综上，本发明人研发的重组腺病毒载体表达Cetuximab单抗为临床相关肿瘤的治疗与研究提供了一种有效的新手段，并具有巨大的市场发展前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。