一种测定土壤中漆酶酶活的方法

摘要

本发明属于土壤学和环境科学领域，具体涉及一种测定土壤中漆酶酶活的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)土壤的预处理；(2)反胶束体系的制备；(3)求解ABTS自由基浓度和吸光度关系的线性方程；(4)ABTS比色法测定漆酶酶活。本发明采用反胶束提取土壤中的漆酶，反胶束适合生物大分子的提纯，且当漆酶与反胶束接触时漆酶会进入反胶束的“水池”内，能够有效的保证提取过程中漆酶的活性，本发明用醋酸‑醋酸钠缓冲液反萃取反胶束中的漆酶，缓冲溶液能够使漆酶保持在一个相对稳定的环境中且使漆酶的酶活达到最适宜的程度，此外本发明使用的漆酶酶活检测技术简便快速且使用的反胶束溶液能够重复使用，适合批量检测。

说明书

技术领域

本发明属于土壤学和环境科学领域，具体涉及一种测定土壤中漆酶酶活的方法。

背景技术

漆酶是一种结合有多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，漆酶利用分子氧催化氧化反应的副产物为水，属于环保型酶类，而且由于漆酶的催化有机底物较为广泛，使得漆酶已成为一种具有多方面优良特性的多功能酶，其应用涉及生物、化学及环境等多个学科领域，目前已经有越来越多的学者开始利用漆酶处理被有机物污染的土壤，而漆酶的酶活是影响有机物处理能力的关键因素，因此测定土壤中漆酶活性的变化规律显得尤其重要。

反胶束是表面活性剂在有机溶剂中形成的一种方向胶团，表面活性剂在有机溶剂中会形成亲水基团朝内而疏水基团朝外的具有多分子聚集体的极性内核，反胶团的极性内核溶解适量水后会形成“水池”现象，由于“水池”现象的存在，使得反胶团可以选择性的溶解一些生物物质，如蛋白质、核酸和氨基酸等，由于这些生物物质与有机溶剂之间隔着反胶团，使得生物物质不会与有机溶剂直接接触，同时水池的微环境又保护的生物物质的活性。用反胶团萃取生物物质，不仅萃取率高，萃取具有选择性，还能够保持萃取过程中生物物质的活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种能有效测定土壤中漆酶酶活的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是，一种测定土壤中漆酶酶活的方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)土壤的预处理：

将待测土壤样品取回后，放入通风橱中风干，然后将风干的土壤研磨过20目筛后备用；

(2)反胶束体系的制备：

将表面活性剂AOT溶解于异辛烷中，配成浓度为0.05～0.08g/mL的AOT/异辛烷混合液，然后在AOT/异辛烷混合液中加入KCl和醋酸-醋酸钠缓冲液，然后对混合液进行超声，直到表面活性剂AOT完全溶解，并且混合溶液澄清透明，制得反胶束体系；

(3)求解ABTS自由基浓度和吸光度关系的线性方程：

在6只25mL的具塞比色管中分别加入0mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL的ABTS溶液，ABTS溶液的浓度为4mmol/L，然后在6只装有ABTS溶液的具塞比色管中各加入1mL漆酶溶液，漆酶溶液的酶活为1U/mL，然后在6只具塞比色管中均添加蒸馏水至25mL刻度，然后将6只具塞比色管均摇匀后放置一个小时，放置一小时后用紫外分光光度计在420nm的波长下测量6只具塞比色管中溶液的吸光度并绘制标准曲线，求出具塞比色管中混合溶液ABTS自由基浓度和吸光度关系的线性方程：

Y＝aX+b，

式中：Y为ABTS自由基的浓度(μmol/L)；X为吸光度(A)；a、b为待求常数；

(4)ABTS比色法测定漆酶酶活：

将研磨后的土壤称取1.0～3.0g放入离心管中，并在离心管中加入10mL反胶束体系，然后将离心管放到摇床震荡1～2个小时，震荡完成后，将离心管放在离心机上以4000r/min的速度离心15～30min，离心完成后将处于上层的溶液取出放入另外干净的离心管中备用，将处于下层的土壤继续加入10mL的反胶束体系重复进行上述震荡和离心操作，重复两次，并且每个样品做三个平行试样；

向取出的处于上层的溶液中加入等体积的醋酸-醋酸钠缓冲液，并震荡15～20分钟，然后将混合溶液置于离心机中，以4000r/min的速度离心30～40分钟，离心分层后取出处于下层的漆酶溶液，实现漆酶的反萃取，在比色皿中加入1.5mL反萃取后的漆酶溶液和1.5mL的ABTS溶液，其中ABTS溶液的浓度为0.5mmol/L，然后利用紫外分光光度计在420nm的波长下，在2分钟内每隔15s测定一次比色皿中混合溶液的吸光度，求出比色皿中混合溶液吸光度与时间关系的线性方程：

S＝cT+d，

式中：S为吸光度(A)；T为时间(min)；c、d为待求常数；

待测土壤漆酶酶活的计算公式如下：

式中：e为ABTS自由基与吸光度关系的线性方程的斜率，即e等于步骤(3)中求得的常数a；f为吸光度与时间关系的线性方程的斜率，即f等于步骤(4)中求得的常数c；V₁为反萃取后漆酶溶液的体积(mL)；V₂为加入到比色皿中反萃取后漆酶溶液的体积(mL)；m为土壤质量(g)；V₃为加入比色皿中ABTS溶液的体积(mL)。

进一步，所述加入的KCl溶液的浓度为0.1mol/L，加入量为每10mL的AOT/异辛烷混合液中加入0.5～0.8ml的KCl溶液。

进一步，所述加入的醋酸-醋酸钠缓冲液的pH为2.0～6.0，浓度为0.1mol/L。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明采用反胶束提取土壤中的漆酶，反胶束适合生物大分子的提纯，当漆酶与反胶束接触时漆酶会进入反胶束的“水池”内，能够有效的保证提取过程中漆酶的活性。

2、本发明用醋酸-醋酸钠缓冲液反萃取反胶束中的漆酶，缓冲溶液能够使漆酶保持在一个相对稳定的环境中且使漆酶的酶活达到最适宜的程度。

3、本发明使用的漆酶酶活检测技术简便快速且使用的反胶束溶液能够重复使用，适合批量检测。

附图说明

图1为实施例1中ABTS自由基与吸光度关系的线性关系图；

图2为实施例1中为吸光度与时间关系的线性关系图；

图3为实施例2中ABTS自由基与吸光度关系的线性关系图；

图4为实施例2中吸光度与时间关系的线性关系图；

其中，R²为线性相关指数。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明方法作进一步的描述，并非对其保护范围的限制。

实施实例1

一种测定土壤中漆酶酶活的方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)土壤的预处理：

采集棕色石灰土表层土壤放入通风橱中风干，然后将风干的土壤研磨过20目筛后备用；

(2)反胶束体系的制备：

将表面活性剂AOT溶解于异辛烷中，配成浓度为0.05g/mL的AOT/异辛烷混合液，然后在AOT/异辛烷混合液中加入KCl和醋酸-醋酸钠缓冲液，然后对混合液进行超声，直到表面活性剂AOT完全溶解，并且混合溶液澄清透明，制得反胶束体系；

(3)求解ABTS自由基浓度和吸光度关系的线性方程：

在6只25mL的具塞比色管中分别加入0mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL的ABTS溶液，ABTS溶液的浓度为4mmol/L，然后在6只装有ABTS溶液的具塞比色管中各加入1mL漆酶溶液，漆酶溶液的酶活为1U/mL，然后在6只具塞比色管中均添加蒸馏水至25mL刻度，然后将6只具塞比色管均摇匀后放置一个小时，放置一小时后用紫外分光光度计在420nm的波长下测量6只具塞比色管中溶液的吸光度并绘制标准曲线(见图1)，求出具塞比色管中混合溶液ABTS自由基浓度和吸光度关系的线性方程：

Y＝aX+b，

式中：Y为ABTS自由基的浓度(μmol/L)；X为吸光度(A)；a、b为求得的常数，且a＝192.1，b＝2.950，线性相关指数R²＝0.998；

(4)ABTS比色法测定漆酶酶活：

将研磨后的土壤称取1.0g放入离心管中，并在离心管中加入10mL反胶束体系，然后将离心管放到摇床震荡1个小时，震荡完成后，将离心管放在离心机上以4000r/min的速度离心15min，离心完成后将处于上层的溶液取出放入另外干净的离心管中备用，将处于下层的土壤继续加入10mL的反胶束体系重复进行上述震荡和离心操作，重复两次，并且每个样品做三个平行试样；

向取出的处于上层的溶液中加入等体积的醋酸-醋酸钠缓冲液，并震荡15分钟，然后将混合溶液置于离心机中，以4000r/min的速度离心30分钟，离心分层后取出处于下层的漆酶溶液，实现漆酶的反萃取，在比色皿中加入1.5mL反萃取后的漆酶溶液和1.5mL的ABTS溶液，其中ABTS溶液的浓度为0.5mmol/L，然后利用紫外分光光度计在420nm的波长下，在2分钟内每隔15s测定一次比色皿中混合溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，时间为横坐标绘制吸收曲线(图2)，求出比色皿中混合溶液吸光度与时间关系的线性方程：

S＝cT+d，

式中：S为吸光度(A)；T为时间(min)；c、d为求得的常数，且c＝0.358，d＝0.058，线性相关指数R²＝0.999；

土壤中漆酶的酶活按下式计算：

式中：e为ABTS自由基与吸光度关系的线性方程的斜率，即e等于步骤(3)中求得的常数a，e＝192.1；f为吸光度与时间关系的线性方程的斜率，即f等于步骤(4)中求得的常数c，f＝0.358；V₁为反萃取后漆酶溶液的体积(mL)，V₁＝30mL；V₂为加入到比色皿中反萃取后漆酶溶液的体积(mL)，V₂＝1.5mL；m为土壤质量(g)，m＝1g；V₃为加为入比色皿中ABTS溶液的体积(mL)，V₃＝1.5mL。

进一步，所述加入的KCl溶液的浓度为0.1mol/L，加入量为每10mL的AOT/异辛烷混合液中加入0.5～0.8ml的KCl溶液。

进一步，所述加入的醋酸-醋酸钠缓冲液的pH为2.0～6.0，浓度为0.1mol/L。

实施实例2

一种测定土壤中漆酶酶活的方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)土壤的预处理：

风干采集的亚热带红壤表层土壤，并将土壤研磨风干后过20目筛后备用；

(2)反胶束体系的制备：

将表面活性剂AOT溶解于异辛烷中，配成浓度为0.08g/mL的AOT/异辛烷混合液，然后在AOT/异辛烷混合液中加入KCl和醋酸-醋酸钠缓冲液，然后对混合液进行超声，直到表面活性剂AOT完全溶解，并且混合溶液澄清透明，制得反胶束体系；

(3)求解ABTS自由基浓度和吸光度关系的线性方程：

在6只25mL的具塞比色管中分别加入0mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL的ABTS溶液，ABTS溶液的浓度为4mmol/L，然后在6只装有ABTS溶液的具塞比色管中各加入1mL漆酶溶液，漆酶溶液的酶活为1U/mL，然后在6只具塞比色管中均添加蒸馏水至25mL刻度，然后将6只具塞比色管均摇匀后放置一个小时，放置一小时后用紫外分光光度计在420nm的波长下测量6只具塞比色管中溶液的吸光度并绘制标准曲线(见图3)，求出具塞比色管中混合溶液ABTS自由基浓度和吸光度关系的线性方程：

Y＝aX+b，

式中：Y为ABTS自由基的浓度(μmol/L)；X为吸光度(A)；a、b为求得的常数，且a＝193.7，b＝0.105，线性相关指数R²＝0.999；

(4)ABTS比色法测定漆酶酶活：

将研磨后的土壤称取2.0g放入离心管中，并在离心管中加入10mL反胶束体系，然后将离心管放到摇床震荡2个小时，震荡完成后，将离心管放在离心机上以4000r/min的速度离心30min，离心完成后将处于上层的溶液取出放入另外干净的离心管中备用，将处于下层的土壤继续加入10mL的反胶束体系重复进行上述震荡和离心操作，重复两次，并且每个样品做三个平行试样；

向取出的处于上层的溶液中加入等体积的醋酸-醋酸钠缓冲液，并震荡20分钟，然后将混合溶液置于离心机中，以4000r/min的速度离心40分钟，离心分层后取出处于下层的漆酶溶液，实现漆酶的反萃取，在比色皿中加入1.5mL反萃取后的漆酶溶液和1.5mL的ABTS溶液，其中ABTS溶液的浓度为0.5mmol/L，然后利用紫外分光光度计在420nm的波长下，在2分钟内每隔15s测定一次比色皿中混合溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，时间为横坐标绘制吸收曲线(图4)，求出比色皿中混合溶液吸光度与时间关系的线性方程：

S＝cT+d，

式中：S为吸光度(A)；T为时间(min)；c、d为求得的常数，且c＝0.666，d＝0.107，线性相关指数R²＝0.999；

土壤中漆酶的酶活按下式计算：

式中：e为ABTS自由基与吸光度关系的线性方程的斜率，即e等于步骤(3)中求得的常数a，e＝193.7；f为吸光度与时间关系的线性方程的斜率，即f等于步骤(4)中求得的常数c，f＝0.666；V₁为反萃取后漆酶溶液的体积(mL)，V₁＝30mL；V₂为加入到比色皿中反萃取后漆酶溶液的体积(mL)，V₂＝1.5mL；m为土壤质量(g)，m＝2g；V₃为加为入比色皿中ABTS溶液的体积(mL)，V₃＝1.5mL。

进一步，所述加入的KCl溶液的浓度为0.1mol/L，加入量为每10mL的AOT/异辛烷混合液中加入0.5～0.8ml的KCl溶液。

进一步，所述加入的醋酸-醋酸钠缓冲液的pH为2.0～6.0，浓度为0.1mol/L。