一种胆红素去除用血液灌流树脂吸附剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种生物医用材料领域的胆红素去除用血液灌流树脂吸附剂的制备方法，选择交联度4～20％、总平均孔径10～100nm、粒径30～80目的交联丙烯酸酯聚合物微球作为载体，先通过胺化接枝具有一定长度的间隔臂，然后对间隔臂末端季铵化，最后对这种吸附剂包膜聚甲基丙烯酸‑β‑羟乙酯。本发明提供的制备方法难度低、易于控制，机理明确；本发明制备的胆红素去除用的血液灌流树脂吸附剂具有良好的生物相容性，对胆红素有较高的选择吸附率，可应用于血液灌流治疗领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物医用材料领域的血液灌流吸附材料的制备方法，特别是涉及一种胆红素去除用血液灌流树脂吸附剂的制备方法。

背景技术

胆红素(Bilirubin,BR)是胆色素的一种，呈橙黄色，是体内血红素的主要代谢产物。胆红素是非极性的脂溶性物质，难溶于水，但对血浆白蛋白具有很高的亲和力。正常人血清中的胆红素，一种是结合胆红素(或称直接胆红素)，经过肝细胞内质网作用，与葡糖醛酸或其他物质结合；另一种是游离胆红素(或称间接胆红素)，来自红细胞破坏产生的胆红素，在血浆中主要与白蛋白结合而运输。正常人血浆中的胆红素很少，当体内因内源性(血细胞缺陷或异常)或外源性因素(如中毒、急性病等)造成胆红素生成过多，或因器官组织功能受损导致胆红素的代谢障碍，可使血浆胆红素浓度异常升高，成为内源性毒素并形成高胆红素血症。其特征是在血浆浓度过高时胆红素可以透过生物膜扩散进入并沉积在组织(包括脑部)中，造成黄疸，严重的可引起组织细胞坏死危及生命。

血液灌流法是目前可以有效治疗高胆红素血症的方法之一，其核心是用于去除血液中的代谢物或毒素的吸附材料。血液灌流用的吸附材料主要有活性炭和合成树脂(包括各类阴离子交换树脂和大孔吸附树脂)以及其他类型的吸附剂(新型吸附微球、功能过滤膜、中空纤维等)。

活性炭吸附剂来源广泛，成本低廉，自身具有较大的比表面积和丰富的孔道，可以快速吸附去除外源性的毒素，但存在血液相容性较差，机械强度低，易发生脱落，吸附的选择性差等缺点。

合成树脂是目前使用较多较为成熟的一类血液灌流用吸附剂。其中一类是大孔树脂类吸附剂，基于交联的聚苯乙烯、聚乙烯醇等，利用了大的比表面积和较大的孔径以及良好的机械性能，通过疏水作用或配合改性后接枝的基团进行胆红素的吸附，具有吸附量大的优点，如国内珠海健帆生产的HA型血液灌流器系列产品。大孔树脂吸附剂的主要问题是对胆红素的选择性不强，虽然可以通过改性引入功能基团，如氰基(李乃宏等，中国生物医学工程学报，1982,1(1)：40-43)等，但相关研究(中国专利，公开号CN 102049242B)指出其存在蛋白吸附量过高或基团易受污染等问题。另一类是离子交换树脂吸附剂，主要原理是树脂吸附剂所带离子正电荷与胆红素所带负电荷的静电吸引作用，以交联聚苯乙烯二乙烯基苯树脂为主要载体。目前在胆红素灌流治疗中较成熟的产品有日本可乐丽的BL-300型和旭化成的BRS-350型吸附器，国内实现上市销售的有天津紫波的HB-L-6、河北廊坊爱尔的AR-350吸附柱等。这类吸附剂的主要问题是：(1)现有产品，特别是进口产品价格昂贵，且部分产品治疗时间较长；(2)国产胆红素阴离子树脂吸附剂产品的吸附率尚低于国外产品的水平，以AR-350为例，对胆红素吸附率(董明清等，吉林大学学报(医学版)，2010,36(01):19)在30％左右，而日本可乐丽的BL-300吸附柱对血浆胆红素的吸附率可达58.1％(高蕾等.中国血液净化,2008,11(7):615-617.)。

其他类型的胆红素吸附剂目前鲜有市售商品化的报道，更多的是在实验室开发中，尚有较多技术问题需要解决。

发明内容

针对现有胆红素灌流吸附剂技术中存在的制备工艺复杂，成本昂贵，产物吸附效率较低等不足，本发明的目的是提供一种胆红素去除用的血液灌流树脂吸附剂的制备方法。

本发明针对胆红素吸附的特点要求，选取具有一定结构参数的聚合物微球作为载体，对所选的树脂载体先通过胺化，接枝具有一定长度的间隔臂，再对间隔臂末端进行季铵化，最后对这种吸附剂包膜聚甲基丙烯酸-β-羟乙酯。该制备方法具有难度低、易于控制的优点，获得的胆红素去除用的血液灌流树脂吸附剂具有良好的生物相容性，对血浆中的胆红素有较好的选择吸附性，可应用于血液灌流治疗领域。

本发明公开了一种胆红素去除用血液灌流树脂吸附剂的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)选择交联度4～20％，总平均孔径10～100nm，粒径30～80目的交联丙烯酸酯聚合物微球作为胆红素去除用血液灌流树脂吸附剂的载体；

所述的丙烯酸酯聚合物微球选自：丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯；

(2)对所选择的树脂吸附剂的载体表面接枝间隔臂：

将上述树脂吸附剂的载体用大量乙醇和去离子水洗净并干燥后，加入溶剂中溶胀1-2小时，随后加入胺化剂进行胺化，升温至80～120℃，300转/分钟搅拌下恒温反应12-18小时后出料，用去离子水洗涤过滤，得到接枝间隔臂的树脂吸附剂；

所述的溶剂选自：二甲基甲酰胺、苯乙酮、二氯乙烷或正丁醇，其与树脂吸附剂载体的质量比为2:1～5:1。

所述的胺化剂选自：己二胺、三乙烯四胺或四乙烯五胺，其与树脂吸附剂载体的质量比为1:1～3:1。

(3)对上述树脂吸附剂上所接枝的间隔臂末端季铵化。

(4)对步骤(3)获得的树脂吸附剂进行表面包膜处理：

将洗净后的树脂吸附剂与含有甲基丙烯酸-β-羟乙酯单体(HEMA)、交联剂、致孔剂以及引发剂的油相溶液充分混合，再转移到保温在50-55℃的含有3％氯化钠与1％明胶的水相溶液中，在300转/分钟的搅拌条件下，反应10-20分钟，然后升温至65-70℃反应4-6小时，再升温至75-80℃固化4-6小时。最后将产物滤干，用相对于所述产物3-5倍体积的乙醇与8-10倍体积的去离子水交替清洗3次，过滤；

所述的交联剂选自：双甲基丙烯酸乙二醇酯、乙二醇二乙基二烯丙基酯、二丙烯酸-1，4-丁二醇酯或丙烯酸丁酯。

所述的引发剂选自：偶氮二异丁氰、偶氮二异庚腈、过氧化苯甲酰或过氧化月桂酰。

所述的致孔剂选自：乙酸乙酯、正丁醇、十二醇或它们中的多个。

所述的引发剂与树脂吸附剂的质量比为1:2000～1:4000。

所述的HEMA单体与交联剂、致孔剂、树脂吸附剂的体积比为1:0.01～0.02:0.5:2～8。

本发明的优点和有益效果：

与现有技术相比，本发明选取的树脂吸附剂的载体属于丙烯酸酯类交联聚合物微球，它们具有表面亲水、内部骨架疏水的特点，配合优选的载体孔结构参数以及粒径分布，有利于吸引脂溶性的胆红素进入吸附剂内部；在接枝间隔臂时，本发明所选的载体避免了一般交联聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂常常需要先使用强致癌物氯甲基甲醚或二氯甲醚进行氯甲基化的问题，因此制备工艺除操作难度低易于控制外，还有绿色安全，对环境友好的优点；本发明在引入间隔臂后对间隔臂末端季铵化，相比现有单纯的接枝或季铵化的技术方式，可以有效的利用空间效应和基团的强静电吸引吸附胆红素分子，提高胆红素吸附效率；利用生物相容性良好HEMA为吸附剂包膜，有效的改善了吸附剂的血液相容性。

附图说明

图1是胆红素标准吸附曲线。

图2是本发明的6个树脂吸附剂样品在吸附试验过程中不同时间点模拟血浆内的胆红素浓度。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明：

实施例一：

(1)选择交联度4～20％，总平均孔径10～100nm，粒径30～80目的交联聚甲基丙烯酸甲酯作为胆红素去除用高分子树脂型吸附剂的载体；

(2)对所选择的树脂吸附剂载体表面接枝间隔臂：

称取上述树脂吸附剂载体100g，洗净后置于带有温度计、搅拌器的三口烧瓶中，加入200g二甲基甲酰胺溶胀1小时，随后加入200g己二胺进行胺化，升温至120℃，在300转/分钟搅拌下恒温反应12小时后出料，用去离子水洗涤过滤，得到接枝间隔臂的树脂吸附剂；

(3)对上述树脂吸附剂上所接枝的间隔臂末端季铵化：

将在步骤(2)得到的接枝了间隔臂的树脂吸附剂放入带有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，加入10％的NaOH溶液60mL，加入8.16g碘甲烷，水浴保持20℃下反应10小时后出料，用5％的盐酸溶液转型后清洗；

(4)对上述获得的树脂吸附剂进行表面包膜处理：

将洗净后的树脂吸附剂与含有50ml甲基丙烯酸-β-羟乙酯单体、1ml乙二醇二乙基二烯丙基酯、25ml正丁醇以及0.05g偶氮二异丁腈的油相溶液充分混合，再转移到含有300ml保温在50℃的含有3％氯化钠与1％明胶的水相溶液的三口烧瓶中，在300转/分钟的搅拌条件下，反应20分钟，然后升温至70℃反应6小时，再升温至80℃固化6小时。最后将产物滤干，用3-5倍的乙醇与8-10倍去离子水交替清洗3次，过滤。

实施例二

本实施例的方法与步骤与实施例一基本相同，不同之处在于步骤(1)中：选择交联度4～20％，总平均孔径10～100nm，粒径30～80目的交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯作为胆红素去除用高分子树脂型吸附剂的载体。

实施例三

本实施例的方法与步骤与实施例一基本相同，不同之处在于步骤(2)中：加入200g二甲基甲酰胺溶胀1小时，随后加入300g四乙烯五胺进行胺化。

实施例四

本实施例的方法与步骤与实施例一基本相同，不同之处在于步骤(2)中：升温至80℃，在300转/分钟搅拌下恒温反应18小时后出料。

实施例五

本实施例的方法与步骤与实施例一基本相同，不同之处在于步骤(4)中：将洗净后的树脂吸附剂与含有25ml甲基丙烯酸-β-羟乙酯单体、0.5ml丙烯酸丁酯、25ml十二醇以及0.05g偶氮二异庚腈的油相溶液充分混合。

实施例六

本实施例的方法与步骤与实施例一基本相同，不同之处在于步骤(4)中：将洗净后的树脂吸附剂与含有100ml甲基丙烯酸-β-羟乙酯单体、1ml双甲基丙烯酸乙二醇酯、25ml乙酸乙酯与十二醇等体积混合物以及0.1g过氧化苯甲酰的油相溶液充分混合。

实施例七：本发明所述胆红素去除用血液灌流树脂吸附剂对胆红素吸附评价。

对实施例一至六制备的胆红素去除用的血液灌流树脂吸附剂进行模拟血浆中高浓度胆红素的吸附评价：

(1)树脂预处理：将上述实施例一至六制备的树脂吸附剂依次编号为SP1-SP6，消毒后，用生理盐水冲洗至中性并滤干，待用。

(2)配制试验用试剂：

a)重氮试剂配制(需新鲜配制，现配现用)：试剂A：1.25g对氨基苯磺酸与15ml浓盐酸混合，用蒸馏水稀释至250ml；试剂B：2g亚硝酸钠溶于100ml蒸馏水，置于冰箱中冷藏；将12ml试剂A与0.4ml试剂B混合即得重氮试剂；

b)紫外检测用缓冲液(UV detection buffer)配制：12ml甲醇与0.4ml蒸馏水混溶；

c)模拟血浆的配制：将2g人血清白蛋白溶于PBS缓冲液中，配制成含3.5％白蛋白的模拟血浆；

d)胆红素试剂(Bil.Reagent)的配制：将0.02g胆红素溶于3ml二甲亚砜(DMSO)和2ml浓度为0.1M的Na2CO3的混合溶液中，用上述配制的模拟血浆稀释至100ml，以棕色瓶冷藏于冰箱中(配制时避免强光照射，储存瓶应用黑纸包裹)。

(3)试验方法：

a)按照表1准备6种不同浓度的标样用于标准曲线绘制。

表1六种不同浓度标样

序号ABCDEF模拟血浆(μl)4003603002001000Bil.Reagent(μl)040100200300400胆红素浓度(mg/ml)00.020.050.100.150.20

b)标准曲线绘制：按照表2将UV detection buffer与重氮试剂以及标样(或测试样品)混合配制作为检测溶液。在黑暗中保持30分钟，用紫外-可见分光光度计读取标样序号B-F在560nm波长处的吸收值(以上述A号标样作为空白比对，校准光密度零点)，与对应的胆红素浓度绘制标准曲线，如图1所示。

表2胆红素吸附测定用溶液配制

溶液组成体积(ml)UV detection buffer4.2重氮试剂0.4标样(或样品)0.2

c)树脂吸附剂样品对胆红素吸附率的测定：称取1g经预处理的待测树脂吸附剂置于三角烧瓶中，加入30ml的胆红素试剂，37℃水浴振荡4小时；根据不同时间点抽取溶液样品，测定胆红素浓度。

d)树脂吸附剂对胆红素吸附率和吸附效率的计算：

吸附率(％)＝(0.20-C)/0.20×100％，

吸附效率(mg/g)＝(0.20-C)(mg/ml)×30ml/1g，

其中，C＝(A-0.0048)/4.6831，

C代表吸附一定时间后模拟血浆内胆红素浓度，

A代表吸附一定时间后测得的模拟血浆内胆红素浓度对应的紫外吸收值。

(4)测试结果：树脂吸附剂样品SP1-SP6对胆红素的吸附率以及吸附效率测试结果如表3所示，不同条件下制备的6个树脂吸附剂样品对模拟血浆内的高浓度胆红素都具有很高的吸附率和吸附效率，其中实施例一所制备的样品吸附效果最优。上述6个树脂吸附剂样品在吸附试验过程中不同时间点对应的模拟血浆内剩余的胆红素浓度如图2所示，在吸附开始后0.5小时即可使胆红素浓度下降75％以上，1-2小时以内即可达到吸附平衡。

表3六种不同树脂吸附剂样品对胆红素的吸附率以及吸附效率(吸附时间：4小时)

样品编号SP1SP2SP3SP4SP5SP6吸附率％93.8787.4690.0283.5991.6586.13吸附效率mg/g5.6325.2475.4015.0155.4995.168

根据上述结果，选取实施例一制备的树脂吸附剂样品SP1，用于高胆红素血浆的吸附效果评价。

将上述SP1树脂吸附剂样品严格消毒后，用生理盐水湿润并装填于30ml吸附柱内，将约300ml高胆红素血浆在37℃下进行循环灌流吸附4小时(流速约3ml/分钟)。灌流吸附试验后血浆中的总胆红素浓度从389.61±53.65μmol/L下降至149.92±19.26μmol/L，吸附率为62.2％，直接胆红素浓度从142.85±64.20μmol/L下降至56.57±30.98μmol/L，吸附率为60.4％，间接胆红素浓度从246.76±89.45μmol/L下降至81.92±88.30μmol/L，吸附率为67.1％。试验前后，血浆内总蛋白、白蛋白以及球蛋白水平变化率均在5％以下，受到树脂吸附剂的影响不大。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。